駱永富　王湘英　曾之耀

1.湖南省永州市中心醫(yī)院普外科，湖南永州425000；2.湖南省人民醫(yī)院肝膽胰外科，湖南長(zhǎng)沙410005

早期腹腔置管引流與重癥急性胰腺炎腸黏膜HMGB1表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

駱永富1王湘英2曾之耀1

1.湖南省永州市中心醫(yī)院普外科，湖南永州425000；2.湖南省人民醫(yī)院肝膽胰外科，湖南長(zhǎng)沙410005

目的探討早期腹腔置管引流對(duì)重癥急性胰腺炎腸黏膜HMGB1表達(dá)的影響及意義。方法將SD大鼠（n= 60）隨機(jī)分為A組（SAP模型組，n=20）、B組（腹腔置管治療組，n=20）和SO組（對(duì)照組，n=20）。A、B組大鼠均泵入5%?；悄懰徕c建立SAP模型，B組大鼠在建立SAP模型的同時(shí)予以留置腹腔引流管一根，SO組大鼠開(kāi)腹僅翻動(dòng)十二指腸。三組大鼠均在建模后24 h開(kāi)腹，觀察大鼠腹腔內(nèi)改變，檢測(cè)AMY、DAO濃度，檢測(cè)小腸黏膜HMGB1的表達(dá)水平，觀察小腸和胰腺的病理改變。結(jié)果A、B組大鼠血AMY、DAO濃度、小腸黏膜HMGB1的表達(dá)水平、小腸和胰腺病理學(xué)改變均顯著優(yōu)于SO組（P＜0.05），但與A組比較，B組上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論大鼠SAP腸黏膜的損傷可能與腸黏膜HMGB1的表達(dá)增加有關(guān)。早期腹腔置管引流能減輕大鼠SAP腸黏膜的損傷。

早期腹腔置管引流；重癥急性胰腺炎；高遷移率族蛋白1；腸黏膜損傷

［Abstract］Objective To study the influences and significance of HMGB1 expression intestinal mucosal damage by severe acute pancreatitis（SAP）with early peritoneal catheter drainage.Methods 60 SD rats were randomly divided into three group:the group A（n=20）；the group B（n=20）；group SO（n=20）.The rats of group A，B were all injected with 5% sodium taurocholate to establish the SAP model，but the rats in group B was to be indwelling peritoneal drainage tube while SAP model，and the pancreas of the rats were turned up only in group SO.The three groups rats were opened abdominal again after 24 h to detect the concentration of AMY，DAO of the serum and the expression of HMGB1 in the intestinal，and pathological changes in the intestinal mucosal and pancreas.Results The concentrations of AMY，DAO in the serum of the blood and the expression of HMGB1 in the intestinal mucosal and pathological changes in the intestinal mucosal and pancreas were significantly better in the group A，B than group SO，but compared with group A，group B was significantly decreased（P＜0.05）.Conclusion The damage of intestinal mucosal in SAP may be related with the high expression of HMGB1 in the intestinal mucosal，the early peritoneal catheter drainage can reduce the intestinal mucosa damage in the SAP rats.

［Key words］Early peritoneal catheter drainage；Severe acute pancreatitis；HMGB1；Intestinal mucosal damage

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）是一種病情嚴(yán)重、治療困難、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的急腹癥［1，2］。SAP常導(dǎo)致腸黏膜屏障功能障礙、細(xì)菌移位，導(dǎo)致后期出現(xiàn)繼發(fā)性的胰周感染、胰腺膿腫，增加了治療難度，預(yù)后不好［3］。但是外科手術(shù)干預(yù)對(duì)SAP患者創(chuàng)傷大、并發(fā)癥發(fā)生率高，目前內(nèi)科治療越來(lái)越得到肯定。腹腔置管引流在臨床上已開(kāi)始使用，但是其具體機(jī)制目前尚不完全清楚。本研究通過(guò)建立大鼠SAP模型，初步探討早期腹腔置管引流在SAP腸黏膜屏障功能改善的可能發(fā)生機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1一般材料

健康SD大鼠60只，清潔級(jí)，雌雄不拘，體重250～300 g，由永州市職業(yè)技術(shù)學(xué)院（衛(wèi)校區(qū)）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證編號(hào)SCXK（湘）2006-0001。HMGB1抗體、DAO和HMGB1試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1分組將SD大鼠（n=60）隨機(jī)（抽簽法）分成：A組（SAP模型組，n=20）；B組（腹腔置管治療組，n= 20）；SO組（對(duì)照組，n=20）。三組大鼠分別在建模成功后24 h再次開(kāi)腹。

1.2.2建立模型（1）A組（SAP）模型建立：水合氯醛腹腔注射麻醉，剪毛、消毒，鋪無(wú)菌巾，取上腹正中線切口，長(zhǎng)約3 cm，逐層進(jìn)入腹腔，經(jīng)十二指腸刺孔經(jīng)乳頭開(kāi)口置入胰膽管內(nèi)，勻速泵入5%的?；悄懰徕c，8 min后松開(kāi)血管夾并拔管，無(wú)損傷縫線縫合十二指腸穿刺孔，關(guān)腹。見(jiàn)封三圖1、2。（2）B組（腹腔治療組）模型建立：在SAP模型建立成功后，從左上腹部予以留置一根輸液管與腹腔外相通，保持引流通暢。（3）SO組模型建立：僅翻動(dòng)十二指腸，關(guān)腹。

1.2.3標(biāo)本采集A、B、SO三組大鼠均在24 h開(kāi)腹，觀察腹腔及胰腺的大體情況，收集血液和組織標(biāo)本。

1.2.4指標(biāo)檢測(cè)（1）全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血淀粉酶（amylase，AMY）；（2）ELISA法檢測(cè)血二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）和小腸組織高遷移率族蛋白1（high mobility group box protein 1，HMGB1）濃度；（3）免疫組化法檢測(cè)小腸黏膜HMGB1的表達(dá)：陽(yáng)性：棕黃色表達(dá)于胞漿；陰性：細(xì)胞核和細(xì)胞漿均為藍(lán)色，并且測(cè)定陽(yáng)性染色部位的累積吸光度（integrated optical density，IOD）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，采用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腹腔改變

24 h后開(kāi)腹觀察大鼠腹腔大體觀，A組大鼠見(jiàn)大量黃色渾濁腹水和胰腺大量造化斑，胰腺壞死明顯，腸管擴(kuò)張和水腫明顯（封三圖3、4）。而經(jīng)過(guò)早期腹腔置管引流后，B組大鼠腹水和造化斑均明顯減少，胰腺壞死減少，腸管擴(kuò)張和水腫亦好轉(zhuǎn)（封三圖5、6）。SO組大鼠腹腔未見(jiàn)腹水和造化斑，腸管未見(jiàn)擴(kuò)張和水腫（封三圖7、8）。

2.2三組大鼠血AMY、DAO和小腸組織HMGB1濃度比較

A、B組大鼠血AMY、DAO、HMGB1濃度均高于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B組大鼠血AMY、DAO、HMGB1濃度顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1　三組大鼠血AMY］DAO和小腸組織HMGB1濃度比較（±s）

表1　三組大鼠血AMY］DAO和小腸組織HMGB1濃度比較（±s）

注：A組vs SO組，t1=3.812，P1=0.001，t2=3.800，P2=0.000，t3=3.824，P3=0.001，B組vs SO組，t1=3.883，P1=0.001，t2=3.843，P2=0.001，t3= 3.854，P3=0.001，B組vs A組，t1=3.86，P1=0.001，t2=3.836，P2=0.001，t3=3.849，P3=0.001

組別血AMY（U/L）DAO（U/mL）HMGB1（ng/mL）A組B組SO組F值P值10525.15±3000.21 7290.46±1231.47 1613.90±99.44 3.09 0.001 0.83±0.14 0.41±0.09 0.14±0.01 3.10 0.001 0.96±0.06 0.61±0.07 0.21±0.03 3.05 0.001

2.3三組大鼠胰腺組織的病理學(xué)檢查比較

A組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)破壞、細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，大片出血壞死灶、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（封三圖9）。而B(niǎo)組大鼠胰腺腺泡、細(xì)胞間質(zhì)水腫，少量出血壞死灶，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（封三圖10）。SO組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)明顯壞死和出血，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（封三圖11）。

2.4三組大鼠小腸組織的病理學(xué)檢查比較

A組大鼠小腸組織絨毛大部分破壞，未見(jiàn)明顯杯狀細(xì)胞，肌層破壞明顯，可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（封三圖12）。B組小腸組織部分絨毛破壞，杯狀細(xì)胞減少，肌層完整，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)（封三圖13）。SO組小腸組織絨毛完整，可見(jiàn)大量杯狀細(xì)胞，肌層完整，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)（封三圖14）。

2.5三組大鼠小腸腸黏膜細(xì)胞HMGB1陽(yáng)性表達(dá)及IOD比較

小腸黏膜ELISA法和免疫組化結(jié)果均顯示，A、B組大鼠小腸組織HMGB1濃度及IOD顯著高于SO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但與A組比較，B組大鼠小腸組織HMGB1濃度及IOD顯著低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2、封三圖15～17。

表2　三組大鼠小腸腸黏膜細(xì)胞HMGB1陽(yáng)性表達(dá)比較（±s）

表2　三組大鼠小腸腸黏膜細(xì)胞HMGB1陽(yáng)性表達(dá)比較（±s）

注：A組vs SO組，t1=3.845，P=0.001，t2=3.839，P=0.001，B組vs SO組，t1=3.809，P=0.001，t2=3.815，P=0.001，B組vs A組，t1=3.84，P= 0.001，t2=3.827，P=0.001

組別n 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)IOD A組B組SO組F值P值20 20 20 2.97±0.83 1.40±0.70 0.90±0.54 3.07 0.001 53733.75±9849.22 30635.37±9081.32 2764.16±325.97 3.10 0.001

3　討論

SAP是臨床常見(jiàn)急腹癥之一，并發(fā)癥較多，早期可以過(guò)度激活炎性細(xì)胞，釋放大量的細(xì)胞因子及炎性物質(zhì)，如不能及時(shí)清除，會(huì)形成連鎖放大反應(yīng)，發(fā)生腸黏膜損傷，導(dǎo)致腸道細(xì)菌及內(nèi)毒素移位、腹腔感染性壞死以及多器官功能衰竭，從而增加SAP的治療難度［4，5］。因而，早期治療SAP腸黏膜損傷有重大意義。

目前對(duì)SAP早期的非手術(shù)治療已得到共識(shí)，早期對(duì)壞死組織行開(kāi)腹手術(shù)將進(jìn)一步加重對(duì)機(jī)體的打擊［6］。早期利用微創(chuàng)外科方法干預(yù)已逐步受到重視。徐東升等［7］提出SAP的治療應(yīng)遵循微創(chuàng)化的原則，采用非手術(shù)-微創(chuàng)-手術(shù)即“創(chuàng)傷遞進(jìn)式”的外科干預(yù)方式，并對(duì)17例SAP行超聲引導(dǎo)下穿刺引流，效果良好。然而，對(duì)腹腔置管引流的時(shí)機(jī)并不統(tǒng)一，置管引流對(duì)SAP腸黏膜損傷影響的機(jī)制亦缺乏相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究。

血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）可間接反映腸黏膜屏障功能［8］。本實(shí)驗(yàn)研究中A、B組大鼠血DAO濃度與SO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與病理檢查證實(shí)的腸黏膜結(jié)構(gòu)的破壞與恢復(fù)是一致的。本研究還顯示，B組大鼠與A組比較，其血清DAO明顯降低（P＜0.05），表明B組大鼠在經(jīng)過(guò)早期腹腔置管引流后，腸黏膜屏障損傷得到了有效改善。

高遷移率族蛋白1（HMGB1）是一種重要的炎癥介質(zhì)參與了膿毒癥的病理生理過(guò)程，可明顯影響肝、肺、腸等重要器官的功能［9，10］。在SAP發(fā)病過(guò)程中也起著關(guān)鍵性作用［11］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)急性胰腺炎后血漿中的HMGB1水平會(huì)顯著升高，器官損傷也會(huì)明顯增加［12，13］。Shen X等［14］發(fā)現(xiàn)，急性胰腺炎時(shí)患者血漿中的HMGB1水平也會(huì)顯著增高，并且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。欒正剛等［15］研究中證實(shí)SAP大鼠腸組織HMGB1表達(dá)延遲并持續(xù)增高，可能參與了SAP腸屏障功能損害的病理生理過(guò)程。本組實(shí)驗(yàn)中24 h后開(kāi)腹觀察大鼠腹腔大體觀，見(jiàn)A組大鼠大量黃色渾濁腹水和造化斑，腸管擴(kuò)張和水腫明顯，胰腺壞死明顯，小腸組織絨毛大部分破壞，未見(jiàn)明顯杯狀細(xì)胞，肌層破壞明顯，可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，而經(jīng)過(guò)早期腹腔置管引流后，B組大鼠腹水和造化斑明顯減少，胰腺壞死減少，腸管擴(kuò)張和水腫亦好轉(zhuǎn)，小腸組織部分絨毛破壞，杯狀細(xì)胞減少，肌層完整，僅有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，提示早期腹腔置管對(duì)于控制SAP病情是有效的。進(jìn)一步研究顯示，A、B組大鼠小腸HMGB1濃度和免疫組化的表達(dá)與SO組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步證實(shí)了HMGB1可能介導(dǎo)了SAP腸屏障功能的損傷，同時(shí)B組大鼠與A組比較，其小腸HMGB1濃度和免疫組化的表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），推測(cè)B組大鼠在經(jīng)過(guò)早期腹腔置管引流后，可能通過(guò)降低腸黏膜HMGB1的表達(dá)改善和保護(hù)了腸黏膜屏障功能。

綜上所述，目前腹腔置管引流作為一種新的微創(chuàng)治療SAP的方法在臨床已得到重視，但是對(duì)于其產(chǎn)生機(jī)制的基礎(chǔ)研究較少。本實(shí)驗(yàn)從基礎(chǔ)研究的角度表明，早期腹腔置管引流可能通過(guò)將腹腔積液排出體外，減少了大量有毒物質(zhì)的吸收，從而阻斷了炎癥介質(zhì)的網(wǎng)絡(luò)式反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)了全身炎癥反應(yīng)綜合征，進(jìn)而抑制SAP大鼠的腸黏膜HMGB1的表達(dá)，減輕了腸黏膜的損傷，從而有利于改善SAP病情?？梢?jiàn)，早期腹腔置管引流，其微創(chuàng)而又能滿意引流的手術(shù)特點(diǎn)，很可能會(huì)成為SAP早期治療的首選方式。但是對(duì)于SAP的治療，治療過(guò)程中必須遵循個(gè)體化治療的原則。

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Experimental study of early peritoneal drainage with the HMGB1 expression in intestinal mucosal damage by severe acute pancreatitis

LUO Yongfu1WANG Xiangying2ZENG Zhiyao1
1.Department of General Surgery，the Central Hospital of Yongzhou City in Hu'nan Province，Yongzhou 425000，China；2.Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery，the People's Hospital in Hu'nan Province，Changsha 410005，China

R657.51

A

1673-9701（2016）21-0025-03

2016-05-13）