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新疆家蠶抗菌肽研究現(xiàn)狀及應用綜述

2016-10-11 10:07:31修妤婁齊年王安皆石瑞常華麗峰
科技視界 2016年24期
關鍵詞:抗菌肽特征應用

修妤 婁齊年 王安皆 石瑞常 華麗峰

【摘 要】抗菌肽是生物機體進行自我防御的屏障,能夠抑制殺死多種細菌及寄生蟲,但不同生物體內(nèi)的抗菌肽在結(jié)構(gòu)特征上存在較大差異,本文主要介紹了家蠶抗菌肽的特性,并重點介紹了新疆家蠶抗菌肽的研究現(xiàn)狀和應用前景。

【關鍵詞】新疆家蠶;抗菌肽;特征;應用

高等生物的免疫防御體系來其自身免受細菌的侵害的重要屏障。雖然昆蟲沒有高度特異性的免疫體系, 但可以通過產(chǎn)生具有強活力的抗菌肽應對受到外界微生物刺激??咕淖鳛榈偷葎游餀C體快速有效的免疫屏障,是自然界中普遍存在的具有免疫效應的陽離子活性多肽,在機體的先天非特異性免疫中起重要作用[1-3]。第一個真正意義上的抗菌是于1972年由瑞典科學家boman等從惜古比天蠶(Hyatophora-cecropia)蛹中誘導分離出來的。boman等并將其命名為天蠶素(Cecropin)[4]。隨后在細菌、植物、昆蟲、魚類、兩棲類和哺乳動物中也發(fā)現(xiàn)了種類繁多的抗菌肽[5]。

抗菌肽并不同于代謝過程酶促反應生成的多肽類抗生素,它是由基因編碼、蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)合成的具有抗菌活性的一類小分子多肽的總稱[6]。目前,己經(jīng)通過研究分離獲得多種抗菌肽,并測定了其基因序列和氨基酸序列。大多數(shù)抗菌肽分子有兩性的α-螺旋結(jié)構(gòu)域,并富含堿性氨基酸,表現(xiàn)出抗菌肽的主要特征[7]。

自二十世紀中葉以后,抗菌肽的研究一直是生命科學研究的熱點之一。研究表明,抗菌肽具有分子量小,熱穩(wěn)性較高,抗菌譜廣,并且不具有抗原性和不會產(chǎn)生耐藥性,同時還表現(xiàn)出廣譜的抗菌性,尤其是在目前抗生素的耐藥性日益嚴峻的情況下,抗菌肽的應用價值倍受關注,有望成為抗生素的最佳替代者,因而吸引了醫(yī)學界和生物學界的廣泛關注。

新疆生物資源種類繁多、品種獨特、特性優(yōu)良,開發(fā)和發(fā)展的潛力較大。但新疆生物資源研究領域還有許多空白點,資源的利用率較低。 近幾年對新疆家蠶的研究和開發(fā)利用已經(jīng)成為焦點,本文就新疆家蠶抗菌肽的研究現(xiàn)狀及應用做以下綜合闡述。

1 抗菌肽的理化性質(zhì)

抗菌肽是生物機體產(chǎn)生一種小分子多肽,天然抗菌肽含氨基酸數(shù)目不等,堿性,水溶性好。大部分抗菌肽具有熱穩(wěn)定性,在100℃時加熱10~15min仍然可以保持活性。新疆家蠶的抗菌肽在加熱煮沸8h時,仍能保持良好活性[8]。帶有一個凈正電荷,兩親性,富含賴氨酸和精氨酸等陽離子型氨基酸 ,親水端則富含丙氨酸和甘氨酸等非極性氨基酸,并往往發(fā)生酞胺化,是新疆家蠶抗菌肽的主要特征。目前,已從單細胞生物、昆蟲和其它無脊椎動物、植物、兩棲類動物、鳥類、魚類和哺乳動物,包括人類中分離到抗菌肽。此外部分抗菌肽還具備抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力[9]。

抗菌肽具有廣譜抗菌,單一的抗菌肽即可抑制殺死多種細菌、真菌和某些寄生蟲,并對多種癌細胞及動物實體瘤有明顯的殺傷作用。另外,在加速免疫和傷口愈合方面抗菌肽同樣有顯著作用。雖然抗菌肽的作用對象種類繁多,但其發(fā)揮作用的位點是相同的,即膜成分??咕陌l(fā)揮防御作用的基礎在于細胞膜結(jié)構(gòu)的特點,這些特點是動植物所不具備的,這方面的研究使人們對抗菌肽的認識更深入。

2 抗菌肽的分類

目前研究抗菌肽結(jié)構(gòu)的主要方法有圓二性色譜和二維核磁共振等。按照抗菌肽的結(jié)構(gòu)特征主要將其劃分為4類:即α-螺旋、β-折疊、環(huán)形、伸展性結(jié)構(gòu)[10]等。

2.1 α-螺旋型抗菌肽

α-螺旋型抗菌肽主要特征為分子內(nèi)具有一個或多個螺旋結(jié)構(gòu)域,通常含有小的彎曲結(jié)構(gòu)域,如cecropin,magainin。以cecropin A為例,其N端和C端均為α-螺旋,形成兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)。其中N端的1~21個氨基酸構(gòu)成一段帶正電的親水螺旋,C端發(fā)生酞氨化,第25~37個氨基酸構(gòu)成一段帶負電的疏水螺旋結(jié)構(gòu)域,兩段α螺旋由1個短鏈的AGP(丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸)連接。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的20多種cecropin抗菌肽均具有較高的相似性。

α-螺旋抗菌肽分子通過其兩性α-螺旋上的正電荷與細菌細胞質(zhì)膜磷脂分子上負電荷的靜電吸引而結(jié)合,緊接著抗菌肽分子的疏水端借助于分子中AGP連接插入到質(zhì)膜中,然后抗菌肽分子兩性α-螺旋也插入到質(zhì)膜中,通過破壞脂質(zhì)雙分子層原有的有序結(jié)構(gòu),使抗菌肽分子通過膜內(nèi)分子間的位移相互聚集在一起,從而在膜上形成離子通道,細菌最終因不能保持正常滲透壓而死亡[11]。

2.2 β-折疊型抗菌肽

β-折疊型抗菌肽分子內(nèi)存在β-折疊和反平行的β-折疊結(jié)構(gòu),分子內(nèi)含有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的二硫鍵,有助于抗菌肽穿過細胞膜。在分離自日本鱟(Tachypleus tridentatus)血細胞的酸性抽提物TachyplesinI(TPI)中, Tachyplesins與LPS之間具有較強的結(jié)合力,能引起磷脂分子在細胞膜中的翻轉(zhuǎn)及側(cè)移等。說明此類抗菌肽能破壞磷脂分子的有序排列,在不形成穩(wěn)定性孔洞或通道的前提下,使多肽分子穿過脂雙層[12]。

2.3 環(huán)狀結(jié)構(gòu)型的抗菌肽

環(huán)形肽具有高度可變性結(jié)構(gòu),thanatin即屬此類。除了β-折疊結(jié)構(gòu), 環(huán)形肽也能夠形成具有兩性性的α-螺旋結(jié)構(gòu),肽分子中含有的半肽氨酸,能夠形成分子內(nèi)二硫鍵。如防御素(defensins)可通過二硫鍵連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。具有兩性α-螺旋結(jié)構(gòu)域的環(huán)形肽,抗菌作用機理與α-螺旋型抗菌肽基本相同,都是破壞腫瘤細胞或細菌質(zhì)膜結(jié)構(gòu),引起胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出,從而最終導致細菌死亡。不同之處是由于防御素分子太小而不能以單聚體的形式造成膜穿孔,但其分子結(jié)構(gòu)和電生理研究提示,防御素分子能以多聚體的形式作用于細胞膜[13]。

2.4 伸展性結(jié)構(gòu)型的抗菌肽

這類抗菌肽通常缺少典型的二級結(jié)構(gòu),多呈線型,富含脯氨酸、甘氨酸等小分子氨基酸,其抗菌活性結(jié)構(gòu)是通過肽與質(zhì)膜間的氫鍵或范德華力形成,但一般不依賴于殘基間的氫鍵。這一類抗菌肽這結(jié)構(gòu)組成上主要表現(xiàn)為:富含脯氨酸的抗菌肽,如Indolicidin ;富含甘氨酸的抗菌肽,如Hemiptericin和Coleopterlcin。富含脯氨酸的抗菌肽抗菌機制比較特殊,它們能夠穿過細胞膜進入細胞質(zhì),錨定于細菌生長所必需的靶因子,并抑制其生物學功能,從而導致細菌死亡。富含甘氨酸的抗菌肽,如Attacins,其作用模式可能是干擾大腸桿菌細胞外膜蛋白基因OpmC,OpmF和OpmA的轉(zhuǎn)錄,使這些細胞外膜的結(jié)構(gòu)性蛋白表達降低,從而導致膜的通透性增加,細菌的生長受到抑制。

3 新疆家蠶抗菌肽特性及抗菌作用的超微結(jié)構(gòu)觀察

新疆家蠶抗菌肽的殺菌活力為:1 μg/μl,抗菌肽與24 000U 的氨芐青霉素殺菌活力相當;抗菌肽具有很強的熱穩(wěn)定性;在含有氨芐青霉素的金黃色葡萄球菌的固體培養(yǎng)基上, 加入抗菌肽的孔周圍有明顯的抑菌圈,表明新疆家蠶抗菌肽可以殺滅抗氨芐青霉素的環(huán)境微生物??咕哪軌蚰褪芤欢ǚ秶釅A的影響;高濃度鹽不影響抗菌肽抗菌活性;用瓊脂孔擴散實驗檢測抗菌肽對不同細菌抗菌活性發(fā)現(xiàn),抗菌肽對大腸桿菌、化膿桿菌、巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、蘇云金桿菌、谷氨酸桿菌、變形桿菌等有不同程度的殺滅抑制作用, 其中抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強, 對巨大芽孢桿菌、谷氨酸桿菌、蘇云金桿菌、變形桿菌的抗菌作用次之, 對大腸桿菌和化膿桿菌的抑菌作用稍弱一些,相當于抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌作用的一半。

迄今為止, 已分離獲得700 多種抗菌肽,關于抗菌肽的抗菌機理看法不一,目前抗菌肽對細胞膜磷脂分子層的滲透主要有兩種模式:“桶-板”模型(barrel-stave pore)和“毯式”模型(carpet model), 不同類型的抗菌肽可能采用不同模式的作用機制[14]。

劉忠淵等采用透射電鏡研究了新疆家蠶抗菌肽對金黃色葡萄球菌的作用過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在利用抗菌肽處理金黃色葡萄球菌時, 發(fā)現(xiàn)細菌細胞表面部分區(qū)域變模糊、粗糙, 并且隨著時間的延長模糊、粗糙的區(qū)域性增大, 表明抗菌肽的作用可能使金黃色葡萄球菌內(nèi)容物泄漏,導致細菌死亡, 且作用效果與時間呈正相關。金黃色葡萄球菌細胞膜在經(jīng)過長時間的抗菌肽處理后呈中空圓環(huán), 但是細胞壁完整,提示抗菌肽主要是作用靶位在細胞膜上,通過溶解使內(nèi)容物泄漏,導致細菌死亡。王云起等研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽magainin Ⅱ 以“ 毯式” 作用方式破壞大腸桿菌的外壁, 抗菌肽分子環(huán)繞著菌體切斷胞膜, 使大腸桿菌細胞從中斷裂成兩節(jié)[15] 。如果新疆家蠶抗菌肽采用的是“毯式” 的作用模型殺菌,金黃色葡萄球菌細胞應該可以觀察到斷裂、殘缺的胞體, 而在透射電鏡下卻未觀察到此類細胞結(jié)構(gòu),因而推測新疆家蠶抗菌肽很可能是通過“桶-板” 模式滲透細胞膜,首先是抗菌肽分子多聚體化,然后插入細胞膜形成孔洞, 進而使細胞內(nèi)容物從孔道向胞外滲漏,通過影響細菌的新陳代謝系統(tǒng)起到抑菌殺菌作用。目前關于抗菌肽的膜定位方式有待于進一步的研究。

4 抗菌肽表達及優(yōu)化

抗菌肽Cecropin XJ通過提取新疆家蠶總RNA 并進行RT-PCR, 獲得抗菌肽cDNA 分子, 通過與GenBank 中已發(fā)表抗菌肽序列進行比對分析, 確定新的抗菌肽基因。將Cecropin-XJ亞克隆至穿梭質(zhì)粒pGAPZαA 上, 通過轉(zhuǎn)化酵母表達產(chǎn)物。通過對濃度(330mg∕mL)和其分子量(理論值7kD)分析發(fā)現(xiàn) , 酵母表達系統(tǒng)所表達的產(chǎn)物為17.5kD ,說明該分子很可能在水溶液中以二聚體的形式存在[8]。為了提高 Cecropin XJ 融合蛋白的產(chǎn)量,康蘇等通過調(diào)整培養(yǎng)基的碳氮比、誘導時間和誘導劑濃度對蛋白進行優(yōu)化提高蛋白的表達量,但是該研究并沒有對誘導溫度進行優(yōu)化,原因在于37℃未必是蛋白表達的最適溫度卻是細菌生長的最佳溫度。這些條件的確定為我們后期要進行的重組蛋白的規(guī)?;a(chǎn)奠定基礎。

5 新疆家蠶抗菌肽的應用

5.1 新疆家蠶抗菌肽對鮮榨果汁防腐效果的影響

新疆家蠶抗菌肽(Cecropin XJ)基因是從阿克蘇新蠶 3 號蠶體中通過克隆獲得,并已在原核和真核系統(tǒng)中成功表達。Cecropin XJ 屬于天蠶素B 類家族,具兩親性α-螺旋區(qū)域,信號肽含26個氨基酸,前體肽含37個氨基酸,具有較強的熱和酸穩(wěn)定性,單一使用時抗菌譜廣,在食品工業(yè)中具有潛在的應用價值。

不同濃度的新疆家蠶抗菌肽(Cecropin XJ)可以作為防腐劑添加到鮮榨番茄汁和葡萄汁中,并能有效抑制鮮榨果汁中病原微生物的生長,對鮮榨番茄汁和葡萄汁起防腐作用。實驗結(jié)果表明 0.02%(w/v) Cecropin XJ 與相同濃度的山梨酸鉀防腐效果沒有統(tǒng)計學差異,能夠顯著延長鮮榨番茄汁和葡萄汁保鮮期,表明 Cecropin XJ 在食品防腐產(chǎn)業(yè)應用中具有潛在的商業(yè)價值[16,17]。

5.2 新疆家蠶抗菌肽抑制掌面革蘭氏陰性菌的研究

抗菌肽也廣泛應用于食品工業(yè),目前主要的應用抗菌肽有細菌素 Bacteriocin AS-48、Nisn 和乳源抗菌肽等。根據(jù)對Cecropin XJ 的廣譜抑菌作用的研究,設計并對手掌表面菌的抑制消毒進行了初步探索,結(jié)果表明 Cecropin XJ 對手掌擦拭液中的微生物有明顯抑制作用。

5.3 新疆家蠶抗菌肽在番茄汁加工中的應用研究

抗菌肽具有強大的抗菌活性,但它不是細胞毒素,可以被人體內(nèi)的酶系降解、消化,且多數(shù)具有酸、熱穩(wěn)定性和低溫貯藏穩(wěn)定性,是一類潛力很大的生物防腐劑。由于抗菌肽具有眾多優(yōu)點,迅速成為生命科學領域的研究熱點,對昆蟲抗菌肽的研究具有重要理論意義和實際應用價值。由于其來源安全可靠,無毒副作用并可在一定食品范圍內(nèi)起到抑制微生物的生長繁殖,防止食品腐敗變質(zhì),具有降低相應食品的殺菌強度的作;且有實驗表明:抗菌肽無致畸變作用,無蓄積毒性,不容易產(chǎn)生抗藥性[18],因而尋找和開發(fā)應用新的抗菌肽工作越來越受到重視。鄭力等以茄汁為載體對新疆家蠶抗菌肽在食品工業(yè)中的應用進行研究。分析認為:抗菌肽可用于番茄汁的UHT(一般為135~150℃、1~3min)工藝,雖無法縮短殺菌時間,但在相同殺菌時間條件下可降低殺菌溫度,在工業(yè)化生產(chǎn)中大大降低生產(chǎn)動力成本,因而抗菌肽的工業(yè)化應用前景廣闊。

6 抗菌肽的應用前景

目前在防治引起高等動物的各種細菌性、病毒性疾病及其它病害時, 由于抗生素的濫用, 使某些病原體產(chǎn)生了耐藥性, 而導致無法有效地防治病害的發(fā)生,并且新的抗生素的篩選也極為困難, 特別是真菌病害在當前仍是一個難以解決的問題。抗菌肽在昆蟲中的發(fā)現(xiàn), 尤其是抗菌肽對耐藥性致病菌的有良好殺滅作用和在致畸變作用、蓄積毒性、抗藥性產(chǎn)生等方面的明顯弱化特點, 無疑為治療這幾類病害提供了新的途徑。抗菌肽活性強, 功能廣泛, 在應用研究中的潛在重要價值,引起了越來越多研究者的重視。在腫瘤及癌癥治療方面, 大部分化療藥物往往會同時抑殺癌細胞和正常細胞, 引發(fā)較大的毒副作用,而抗菌肽能選擇性地抑制某些腫瘤細胞的生長, 對正常細胞無副作用, 這是腫瘤化療藥物所不具備的。因此, 抗菌肽在醫(yī)藥中有廣闊的應用前景, 有望成為抗菌素、抗病毒素、抗癌藥物的新替代者。

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[責任編輯:朱麗娜]

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