沈豐，王艷，鄒明暢，盛玉青

(鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江　212002)

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棘豆素對(duì)人雄激素非依賴(lài)性前列腺癌PC-3細(xì)胞的作用研究

沈豐，王艷，鄒明暢，盛玉青

(鎮(zhèn)江市第一人民醫(yī)院藥劑科，江蘇 鎮(zhèn)江212002)

目的研究棘豆素(2′,4′-dihydroxychalcone,TFC)對(duì)人雄激素非依賴(lài)性前列腺癌PC-3細(xì)胞的作用，并探討其作用機(jī)制。方法CCK-8法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響；Hoechst 33258染色、熒光顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的變化；Western blot檢測(cè)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞中P27kip1和PTEN蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果TFC能顯著抑制PC-3細(xì)胞的增殖，細(xì)胞呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)改變，凋亡率明顯增加，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。此外，P27kip1和PTEN蛋白表達(dá)量明顯增加。結(jié)論TFC通過(guò)誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡抑制腫瘤細(xì)胞增殖，可能與其G0/G1細(xì)胞周期阻滯，以及PTEN 和P27Kip1蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

前列腺腫瘤;黃酮類(lèi);棘豆屬;周期素依賴(lài)激酶抑制劑p27;基因,腫瘤抑制;細(xì)胞凋亡

前列腺癌是危害男性健康最常見(jiàn)的腫瘤之一，其發(fā)病率在美國(guó)居男性惡性腫瘤之首，占男性死亡原因的第二位[1]。在中國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖遠(yuǎn)低于西方國(guó)家，然而近20年來(lái)，隨著居民生活方式的改變、平均壽命的延長(zhǎng)及醫(yī)學(xué)診療水平的提高，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，并且發(fā)病年齡也日趨年輕化[2]。局限性前列腺癌可以采用觀(guān)察隨訪(fǎng)、前列腺全切術(shù)和放療等治療手段，但我國(guó)大部分患者在確診時(shí)已伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。對(duì)于晚期前列腺癌患者，內(nèi)分泌治療是最主要的治療方法。但大部分前列腺癌患者在進(jìn)行18～24個(gè)月持續(xù)內(nèi)分泌治療后，會(huì)進(jìn)展為雄激素非依賴(lài)性前列腺癌(androgen independent prostate cancer,AIPC)[3]。對(duì)于A(yíng)IPC目前尚無(wú)有效的治療手段,化療作為二線(xiàn)治療方法被應(yīng)用，但存在著選擇性差、毒副反應(yīng)大及腫瘤細(xì)胞耐藥等問(wèn)題。目前臨床迫切需要針對(duì)AIPC有效且毒副作用小的治療藥物。本研究考察了棘豆素(2′,4′-dihydroxychalcone,TFC)對(duì)人雄激素非依賴(lài)性前列腺癌PC-3細(xì)胞的作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1　材料與儀器

TFC (純度大于 95%) 按照呂芳等[4]的方法提取，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。TFC以二甲亞砜(DMSO)助溶，DMSO最終濃度為1.0% (v/v)，并經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃保存待用。F-12培養(yǎng)基購(gòu)自L(fǎng)ife technologies (美國(guó))；胎牛血清購(gòu)自Invitrogen (美國(guó))；CCK-8試劑盒和Hoechst 33258試劑盒均購(gòu)自碧云天 (江蘇南通)； Annexin V-FITC 凋亡檢測(cè)試劑盒和Cycletest plus DNA Reagent kit均購(gòu)自BD Pharmingen (美國(guó))；antiP27kip1 (D69C12,#3686)、antiPTEN (D4.3,#9188)和antiβ-actin (13E5,#4970)均購(gòu)自Cell Signaling Technology (美國(guó))；鼠抗兔二抗購(gòu)自Abcam公司(英國(guó))。Becton Dickinson流式細(xì)胞儀 (美國(guó))； CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；酶標(biāo)分光光度讀板儀(Bio-Rad 680，美國(guó))；超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng))；Nikon倒置顯微鏡(日本)，ECL 發(fā)光試劑盒(上海普飛)。

圖1　TFC結(jié)構(gòu)圖

2　方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，選用含10%胎牛血清的F-12培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)液中青霉素、鏈霉素的濃度為100 U·mL-1，于37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞滿(mǎn)至80%左右時(shí)，用0.25%胰酶消化、傳代。

2.2TFC對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC-3細(xì)胞，消化、吹打成單細(xì)胞懸液，每孔98 μL接種于96孔板中(細(xì)胞密度約每孔5×103個(gè)細(xì)胞)，次日每孔加入2 μL的TFC，最終濃度分別為12.5、25、50、 100、200 μmol·L-1，每組3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(1%二甲基亞砜DMSO)，TFC作用24 h后每孔加入10 μL的CCK-8溶液，混勻后，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，然后置于酶標(biāo)分光光度讀板儀下測(cè)定各孔中的吸光值(測(cè)定波長(zhǎng)450 nm，參比波長(zhǎng)650 nm)。按下面公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：細(xì)胞抑制率(%)=(對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。

2.3TFC對(duì)PC-3細(xì)胞形態(tài)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孔中預(yù)先放入經(jīng)高溫滅菌處理的小蓋玻片，待細(xì)胞爬片后，加TFC處理,使其終濃度分別為25、50、100 μmol·L-1，對(duì)照組用1% DMSO處理。加藥處理24 h后，吸盡培養(yǎng)液，加入0.5 mL固定液固定10 min。去固定液，用PBS洗2遍，加入0.5 mL Hoechst 33258染色液染色5 min，用搖床晃動(dòng) 2～3 min。去染色液，用PBS洗2遍。滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。置熒光顯微鏡下觀(guān)察拍照，激發(fā)波長(zhǎng)350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)460 nm。

2.4TFC對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響將細(xì)胞以每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞的密度接種于六孔板中，待細(xì)胞貼壁后去培養(yǎng)液，加入980 μL的培養(yǎng)液和20 μL不同濃度的TFC，使其終濃度分別為50、100、200 μmol·L-1，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(1% DMSO)。藥物作用24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞1次，用胰酶消化細(xì)胞，合并收集的細(xì)胞液，1 000 g離心5 min，棄上清，用PBS洗滌細(xì)胞2次，Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)輕輕重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到每毫升1.0×106個(gè)細(xì)胞，取100 μL 的細(xì)胞懸液至5 mL的離心管中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，輕輕混勻，避光放置15 min，再加入400 μL Annexin V-FITC結(jié)合液(1×)，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡百分率。

2.5TFC對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響細(xì)胞準(zhǔn)備和藥物處理同細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)，待TFC作用24 h后將細(xì)胞收集，用70%乙醇固定過(guò)夜，然后按照Cycletest plus DNA Reagent kit說(shuō)明書(shū)的要求處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。

2.6Western blot檢測(cè)P27kip1和PTEN蛋白的表達(dá)細(xì)胞準(zhǔn)備和藥物處理同細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)，待TFC作用24 h后收集細(xì)胞，離心，PBS洗2次，加入一定量的細(xì)胞裂解液，置冰上裂解30 min。將裂解液移入eppendorf管中，12 000 g離心2 min，吸上清。取2～5 μL考馬斯亮藍(lán)G-250進(jìn)行蛋白定量，其余樣品按比例加入3×SDS凝膠上樣緩沖液中溶解，煮沸5 min。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。恒壓條件下，積層膠內(nèi)電泳電壓為80 V，分離膠電壓為100 V。在50 V恒壓的條件下、將凝膠置于轉(zhuǎn)移體系中轉(zhuǎn)膜4 h，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上；將膜置于封閉液中封閉2 h；用PBST簡(jiǎn)單清洗后將膜置于一抗稀釋液中4 ℃過(guò)夜；之后用PBST清洗6次，每次10 min；將膜置于二抗稀釋液中，室溫孵育2 h；再用PBST清洗6次，每次10 min；ECL發(fā)光3～5 min，暗室內(nèi)X光片感光、顯影、定影、觀(guān)察。

3　結(jié)果

3.1TFC對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TFC對(duì)PC-3細(xì)胞具有明顯的抑制作用，TFC濃度為25、50、100、200 μmol·L-1時(shí)，對(duì)PC-3細(xì)胞的抑制率分別為9.19%,57.49%,73.48% 和98.49%，呈明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。其中50、100、200 μmol·L-1組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1　TFC對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響(n=9)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.01。

3.2TFC對(duì)PC-3細(xì)胞形態(tài)的影響Hoechst 33258為可通過(guò)細(xì)胞膜的特異性的 DNA 染料，在熒光顯微鏡下，活細(xì)胞核呈彌散狀的均勻熒光，而凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可出現(xiàn)濃染致密的顆粒塊狀熒光。對(duì)照組PC-3 細(xì)胞的細(xì)胞核大多呈彌散均勻熒光，且熒光較弱，隨著TFC給藥濃度的增加，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮,呈致密強(qiáng)熒光，并向核膜靠攏,部分細(xì)胞核呈新月?tīng)罨蛩榱殉尚K狀。見(jiàn)圖2。

圖2　TFC對(duì)PC-3細(xì)胞形態(tài)的影響(×400)

3.3TFC對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響對(duì)照組的凋亡率為(6.25±1.47)%，50、100、200 μmol·L-1的TFC作用PC-3細(xì)胞24 h后凋亡率分別為(44.58±7.19)%、(85.05±2.14)%和(93.62±3.08)%，具有明顯的量效關(guān)系，其中50、100、200 μmol·L-1組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2　TFC對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率的影響(n=3)

注：與對(duì)照組相比，aP<0.01。

3.4TFC對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響對(duì)照組G0/G1期細(xì)胞比例為(44.88±1.45)%，50、100、200 μmol·L-1的TFC作用PC-3細(xì)胞24 h后細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯的變化，其中G0/G1期細(xì)胞比例分別達(dá)到(81.77±5.53)%、(88.05±2.79)%和(90.27±1.26)%，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.01)，TFC導(dǎo)致PC-3細(xì)胞發(fā)生了明顯的G0/G1期阻滯，見(jiàn)表3。

表3　TFC對(duì)PC-3細(xì)胞周期的影響

注：與對(duì)照組相比，aP<0.01。

3.5TFC對(duì)P27kip1和PTEN蛋白表達(dá)的影響β-actin在對(duì)照組和TFC 50、100、200 μmol·L-1組的表達(dá)均較穩(wěn)定，P27kip1和PTEN在TFC的作用下蛋白表達(dá)量均顯著增加，且有明顯的量效關(guān)系，見(jiàn)圖3。

圖3　TFC對(duì)P27kip1和PTEN蛋白表達(dá)的影響

4　討論

TFC是從豆科棘豆屬(Oxytropis D.C.)植物鐮形棘豆的干燥全草中提取的單體黃酮類(lèi)化合物。黃酮類(lèi)化合物是鐮形棘豆的主要有效成分，除了具有抑菌[5]、抗炎鎮(zhèn)痛[6]、抗氧化[7]等藥理活性，還對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。顧青等[8]報(bào)道2′，4′-二羥基查耳酮對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、人肝癌細(xì)胞HuH7以及人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-23l五種腫瘤細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用。楊光明等[9-11]研究發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆黃酮類(lèi)成分能抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖，可能與其下調(diào)MMP-2的轉(zhuǎn)錄水平、下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)和降低Bcl-2/Bax的比值有關(guān)，并對(duì)H22荷瘤小鼠也有抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。陳醒等[12]研究發(fā)現(xiàn)鐮形棘豆總黃酮抑制 SMMC-7721細(xì)胞的增殖與其誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化而引起細(xì)胞凋亡有關(guān)。Lou等[13]報(bào)道了棘豆素具有誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞MGC-803凋亡的作用，與其下調(diào)survivin mRNA表達(dá)有關(guān)。雖然鐮形棘豆黃酮類(lèi)化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較好的抗腫瘤活性，但其對(duì)人前列腺癌細(xì)胞未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。本研究考察了TFC對(duì)人雄激素非依賴(lài)性前列腺癌PC-3細(xì)胞的作用，研究發(fā)現(xiàn)TFC對(duì)PC-3細(xì)胞具有明顯抑制增殖的作用，通過(guò)Hoechst 33258染色觀(guān)察TFC對(duì)PC-3細(xì)胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)隨著TFC給藥濃度的增加，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)學(xué)改變。進(jìn)一步使用流式細(xì)胞儀觀(guān)察TFC對(duì)PC-3細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示TFC能明顯誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡并引起G0/G1期阻滯，且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

P27Kip1基因是一種非特異性細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑 (cyclin dependent kinases inhibitors,CDKI)，通過(guò)抑制細(xì)胞周期素-細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(cyclin-CDK)復(fù)合物的生物活性參與細(xì)胞周期調(diào)控，使細(xì)胞不能通過(guò)G1期。P27kipl蛋白水平與前列腺癌的惡性程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后均存在明顯的負(fù)相關(guān)。PTEN基因是1997年美國(guó)3個(gè)研究小組分別發(fā)現(xiàn)并命名的第1個(gè)具有磷酸酯酶活性的抑癌基因，由于其對(duì)磷酸化的絲/蘇氨酸和酪氨酸殘基具有去磷酸化作用而對(duì)細(xì)胞增殖起負(fù)調(diào)節(jié)效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞中PTEN的過(guò)表達(dá)可使細(xì)胞周期發(fā)生G1期阻滯，還有增加細(xì)胞凋亡率的作用。PTEN基因的失活或突變與前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。已有研究證實(shí)，P27Kip1可能是PTEN所調(diào)控的重要的下游分子，是PTEN發(fā)揮抑癌作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[14]。

為了進(jìn)一步研究TFC誘導(dǎo)PC-3細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本研究通過(guò)Western blot檢測(cè)了前列腺癌相關(guān)P27kip1和PTEN蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TFC的作用下PC-3細(xì)胞的P27kip1和PTEN蛋白表達(dá)均呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)TFC可能是通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)從而引起P27Kip1表達(dá)的增加，導(dǎo)致PC-3細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究提示TFC可能是人雄激素非依賴(lài)性前列腺癌潛在的治療藥物，其作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。

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2′,4′-dihydroxychalcone-induced apoptosis of PC-3 human prostate cancer cells via up-regulation of P27kip1 and PTEN

SHEN Feng,WANG Yan,ZOU Mingchang,et al

(DepartmentofPharmacy,FirstRenminHospital,Zhenjiang,Jiangsu212002,China)

ObjectiveTo explore the effect of 2′,4′-dihydroxychalcone (TFC) on androgen-independent prostate cancer PC-3 cells and its possible anti-cancer mechanism.MethodsThe CCK-8 assay was employed for cellular proliferation measurement,Hoechst 33258 dye and fluorescent microscope for morphological observation,flow cytometry (FCM) for detection of apoptosis and cell cycles,Western blot for analyzing the expression of P27kip1 and PTEN proteins in PC-3 cells treated with TFC of different concentration.ResultsTFC significantly inhibited the proliferation of PC-3 cells,induced apoptotic morphological features,increased the percentage of apoptosis,arrested cell cycle in G0/G1 phase,up-regulated the expression of P27kip1 and PTEN proteins in a concentration dependent manner.ConclusionsTFC could inhibit the proliferation and induce the apoptosis in PC-3 cells by up-regulating P27kip1 and PTEN protein and arresting cell cycle in G0/G1 phase.

Prostatic neoplasms;Flavones;Oxytropis;Cyclin-dependent kinase inhibitor p27;Genes,tumor suppre;Apoptosis

盛玉青，女，副主任中藥師，研究方向：中藥藥理，E-mail：syq770330@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.08.011

2016-03-16,

2016-06-14)