戶 倩，張水明

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系，安徽合肥 230036)

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石榴乙烯反應(yīng)因子PgERF1基因的克隆及序列分析

戶 倩，張水明*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝系，安徽合肥 230036)

[目的]探討乙烯反應(yīng)因子在乙烯轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要作用。[方法]克隆石榴ERF1基因，并對其進(jìn)行序列分析。采用RACE和PCR技術(shù)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中已知的ERF基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，最終獲得石榴ERF1的cDNA序列。[結(jié)果]cDNA序列全長1 612 bp，可編碼394個(gè)氨基酸。利用BLAST、DNAMAN及其他生物學(xué)信息分析軟件，對該段序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，其包含AP2結(jié)構(gòu)域，并具有典型的ERF基因特點(diǎn)。經(jīng)氨基酸同源性分析表明，石榴ERF1基因與其他物種ERF基因同源性較高；經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，其與歐洲栗、醉蝶花等物種親緣關(guān)系較近。[結(jié)論]該研究成功克隆石榴ERF1基因，為后續(xù)的下游分析及園藝植物分子育種奠定基礎(chǔ)。

石榴；ERF1；克隆；序列分析

石榴(PunicagranatumL.)為石榴科石榴屬多年生落葉喬木或灌木，具有廣泛的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，集食用、綠化、藥用、觀賞于一體。目前國內(nèi)外關(guān)于石榴采后品質(zhì)變化的研究較少，貯藏環(huán)節(jié)已成為影響石榴產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。乙烯作為控制產(chǎn)后水果質(zhì)量的主要激素，常作用于果實(shí)成熟過程，影響產(chǎn)后貯藏運(yùn)輸。因此，了解乙烯轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并在源頭控制乙烯合成，可對石榴生產(chǎn)以及育種工作提供便捷。 乙烯作為植物發(fā)育不可或缺的氣態(tài)激素，它參與種子萌發(fā)、植物開花及果實(shí)成熟等生理過程。通過遺傳和生物化學(xué)研究模式植物煙草(Nicotianatabacum)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)等相關(guān)突變體，Guo等[1]對乙烯信號(hào)感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的相關(guān)基因進(jìn)行分離和基因組學(xué)研究，建立了乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)線性模型。其線性模型主要包含有5個(gè)級別元件：乙烯受體(ETRs)、CTR1、EIN2、 EIN3/EILs和乙烯響應(yīng)因(ERFs)。

ERF(ethylene-response factor)屬于植物特有的一個(gè)反應(yīng)因子家族，位于乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游，含有高度保守的AP2 區(qū)域。該結(jié)構(gòu)域由57 個(gè)左右氨基酸組成，可形成1 個(gè)α-螺旋和3 個(gè)反平行鏈構(gòu)成的β-折疊結(jié)構(gòu)[2]。ERF基因是EIN3/EIL1的直接作用目標(biāo)，能夠與乙烯誘導(dǎo)基因啟動(dòng)子的GCC-box 結(jié)合，其超表達(dá)突變體表現(xiàn)出組成性乙烯反應(yīng)，說明ERF基因是正的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[3-5]。目前，在觀賞樹木方面，人們對于ERF基因研究較少。ERR基因不僅促進(jìn)果實(shí)生長發(fā)育，還具有抗病蟲害的功能。研究表明，在擬南芥中，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對于北方根結(jié)線蟲的侵入有強(qiáng)烈的吸引或者趨避作用，石榴發(fā)育過程中的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對于其他病蟲是否同樣具有吸引或者趨避作用[6]。筆者在已知物種ERF基因家族的基礎(chǔ)上，以石榴籽粒作為材料，依據(jù)ERF基因的保守性，運(yùn)用RACE及PCR技術(shù)克隆石榴ERF1基因完整序列。通過NCBI BLAST以及其他生物學(xué)信息分析軟件，獲得目的基因PgERF1的特異性擴(kuò)增引物，利用PCR技術(shù)克隆全長目的基因。為深入闡明目的基因的結(jié)構(gòu)和功能特征，運(yùn)用氨基酸序列分析，并經(jīng)系統(tǒng)樹聚類分析表明，目的基因的氨基酸序列與擬南芥等植物的親緣關(guān)系極近，表明該研究克隆的PgERF1基因?qū)儆谕活怑RF家族成員，以期為后續(xù)分子育種奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料供試材料采自安徽懷遠(yuǎn)，品種名“玉石籽”。試驗(yàn)所需RNA提取試劑、PCR反應(yīng)體系所需試劑以及瓊脂糖電泳試劑分別購自GenStar公司、TaKaRa公司和上海生工生物有限公司。

1.2引物設(shè)計(jì)從NCBI中獲取桃、擬南芥以及歐洲栗等已知物種ERF基因序列，使用DNAMAN找出同源性較高序列，并通過Primer Primer 5設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。引物序列：上游引物5′-TAAGTCAAACCCACCGAAGC-3′，下游引物5′-CTGAGAATCAAATGCCGAGA-3′。

1.3總RNA的提取及cDNA的合成選取色澤度較好的成熟果實(shí)籽粒，置于4 ℃下預(yù)冷72 h，隨后用液氮速凍后于-70 ℃冰箱備用。隨后進(jìn)行石榴籽?？俁NA的提取(采用GenStar公司的StarSpin植物RNA小量提取試劑盒提取)，以提取的石榴籽粒總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈。

1.4基因中間片段的獲得利用PCR技術(shù)，將設(shè)計(jì)引物與模板結(jié)合，獲得目的基因同源片段。PCR反應(yīng)體系：cDNA模板1 μL，Mix 10 μL，dH2O 7 μL，上下游引物各1 μL，總體積20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5PCR擴(kuò)增與序列拼接根據(jù)獲得的基因中間片段核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于5′端克隆的基因特異性引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增各基因5′端，獲得5′端的基因序列。隨后，設(shè)計(jì)用于3′端克隆的特異性引物，并對其進(jìn)行擴(kuò)增，獲得3′端基因序列。將已獲得的目的基因片段、3′端基因序列和5′端基因序列進(jìn)行拼接，最終獲得基因的cDNA全長序列。

2　結(jié)果與分析

2.1PgERF1的全長基因擴(kuò)增用設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR目的片段的擴(kuò)增，經(jīng)回收、連接轉(zhuǎn)化后，挑取陽性克隆測序得到一個(gè)511 bp的核酸片段(圖1A)，NCBI序列比對結(jié)果顯示，該片段序列與歐洲栗(Castaneasativa)的CsERF12(Accession：JF755969.1)序列一致性為87%，初步判斷該片段為石榴ERF1基因序列片段。

2.2PgERF1的5′-RACE利用特異性擴(kuò)增引物獲得ERF1基因的5′端序列，測序得到一個(gè)長864 bp的片段(圖1B)，NCBI序列對比結(jié)果顯示，該片段與歐洲櫟(Quercusrobur)的QrERF1(Accession：KR152259.1)的一致性高達(dá)83%，說明已經(jīng)克隆得到石榴ERF1基因cDNA的5′端序列。

2.3PgERF1的3′-RACE經(jīng)特異性擴(kuò)增獲得ERF1基因的3′端序列，測序得到一個(gè)長563 bp的片段(圖1C)，其3′端發(fā)現(xiàn)終止密碼子TGA和PolyA尾巴，說明以達(dá)到3′末端。NCBI序列對比結(jié)果顯示，該片段與其白梨(Pyrusbretschneideri)PbERF12(Accession：XP_009357932.1)的一致性為67%，且3′端序列與同源片段部分重疊，確認(rèn)其為石榴ERF1基因的3′端序列。

注：M.DL2 000；A.PgERF1；B.5′-RACE；C.3′-RACE。Note：M.DL2 000；A.PgERF1；B.5′-RACE；C.3′-RACE.圖1　石榴籽粒PgERF1基因的擴(kuò)增圖譜Fig.1　PCR amplification results of PgERF1 gene in pomegranate seeds

2.4PgERF1基因分析將試驗(yàn)所得的基因序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫中，利用ORF Finder及DNAMAN對其進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，所得基因具有完整的開放閱讀框，全長cDNA為1 612 bp，其中包含3′非編碼區(qū)287 bp和開放閱讀框1 185 bp，5′非編碼區(qū)140 bp，編碼394個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量約為43.86 ku，等電點(diǎn)為4.97。通過NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對，證明PgERF1基因具有與其他物種相似的功能序列，具有典型的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域。將其與擬南芥等物種進(jìn)行比對，構(gòu)建進(jìn)化樹以及聚類圖譜，結(jié)果表明，兩者功能結(jié)構(gòu)域大致相同。表明其具有控制乙烯反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的相似功能[7]。

2.5氨基酸同源性分析將所得的PgERF1基因序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫中，對其進(jìn)行氨基酸序列推導(dǎo)。其序列與歐洲栗、歐洲櫟等同源程度高達(dá)83%。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，其親緣關(guān)系與麻風(fēng)樹、醉蝶花等物種較近，初步判定克隆得到的基因?yàn)槭馝RF1基因(圖3)。

3　討論

ERF 位于乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游，可以特異性地結(jié)合于核心序列為GCCGCC 的GCC-box順式作用元件上，而GCC-box存在于很多乙烯誘導(dǎo)的生物脅迫和非生物脅迫反應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域[8]。對于植物特有的ERF，通常包含一個(gè)高度保守的AP2區(qū)域，AP2/ERF功能域可以與DNA結(jié)合作為一個(gè)單體。此功能域約由57 個(gè)氨基酸組成，具有高度親和力。而擬南芥APETALA2 相似蛋白中含有2 個(gè)AP2 區(qū)域。研究表明，已發(fā)現(xiàn)的ERF基因僅存在于高等植物中，與乙烯、抗病、抗凍等信號(hào)傳遞過程有關(guān)，且調(diào)控與乙烯、抗病有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[9-10]。目前，國內(nèi)外關(guān)于植物乙烯反應(yīng)因子的研究較少，其作為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要轉(zhuǎn)錄因子，能否通過控制其基因表達(dá)而影響乙烯作用仍待考證。

該研究以石榴籽粒為材料，運(yùn)用RACE及PCR技術(shù)獲得石榴ERF1基因完整序列。通過NCBI BLAST及其他生物學(xué)信息分析軟件，獲得目的基因PgERF的特異性擴(kuò)增引物，利用PCR技術(shù)獲得全長目的基因。通過氨基酸序列分析表明，PpERF1與歐洲栗、歐洲櫟以及醉蝶花等物種在DNA 結(jié)合功能域的約57 個(gè)氨基酸中，同源性達(dá)85%。系統(tǒng)樹聚類分析表明PgERF1基因氨基酸序列與擬南芥等植物的親緣關(guān)系極近。由此證明，該研究獲得的PgERF1基因?qū)儆谕活怑RF家族成員。

圖2　PgERF1基因序列及推測核苷酸序列Fig.2　The cDNA sequence and predicted amino acid sequence of PgERF1

在現(xiàn)有基礎(chǔ)上，該研究將進(jìn)一步發(fā)掘PgERF1基因在石榴果實(shí)發(fā)育和成熟過程中的基因表達(dá)特性，以期為石榴的果實(shí)發(fā)育以及分子育種等提供理論依據(jù)。

4　結(jié)論

乙烯作為重要的植物激素，在果實(shí)發(fā)育以及成熟階段扮

圖3　ERF基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3　Phylogenetic tree sequences of PgERF to ERF from other species

演著重要角色。目前，由于石榴貯藏參數(shù)難以確定，貯藏保鮮問題已成為影響石榴推廣和發(fā)展的一大難題。因此，乙烯作為控制產(chǎn)后水果質(zhì)量的主要激素，了解其轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并在源頭控制乙烯合成可有效地解決石榴貯期存在的問題，對提高果實(shí)品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益、保護(hù)和發(fā)展我國石榴產(chǎn)業(yè)具有重要的意義。同時(shí)，ERF基因不僅參與乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，同樣作用于抗病、抗凍等生理脅迫信號(hào)。ERF基因作為AP2功能結(jié)構(gòu)域重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，其功能和結(jié)果仍待鑒定。因此，該研究選擇石榴作為研究材料，成功克隆石榴乙烯反應(yīng)因子，為進(jìn)一步控制乙烯轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及抗性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Sequencing Analysis ofPgERF1 Gene fromPomegranateFruit

HU Qian, ZHANG Shui-ming*

(Department of Horticulture, Anhui Agricultural University, Hefei, Anhui 230036)

[Objective] The aim was to study the importance of ethylene-response factor in ethylene process. [Method] TheERF1 gene was cloned from pomegranate fruit and sequence analysis was conducted. By PCR and RACE, according to the knownERFsequence in NCBI database, specific primers were designed to obtain the cDNA sequence of pomegranate fruit. [Result] The full-length DNA was 1 612 bp long, and encoded 394 amino acids. Blast, DNAMAN and other biological information analysis software were used to analyze the structure of sequence. The results showed that the gene owns the typical characteristics of theERFgene, which contains an AP2 domain. Homology analysis showed that, theERF1 gene was hihgly homologous between pomegranate and other species, especilly the Castanes sativa andTarenayahassleriana. [Conclusion]PgERF1 gene was successfully cloned, which will contribute to further analysis and molecular breeding of horticultural plants.

Pomegranate;ERF1; Cloning; Sequence analysis

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30900971)；大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目。

戶倩(1995- )，女，安徽六安人，本科生，專業(yè)：園藝。*通訊作者，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，從事果樹資源研究。

2016-06-24

S 188

A

0517-6611(2016)23-087-03