周秀錦，張 靜，林維宣，王秋燕，周向陽

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316000；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116001)

?

質譜檢測泰樂菌素的方法研究進展

周秀錦1，張 靜1，林維宣2，王秋燕2，周向陽1

(1.舟山出入境檢驗檢疫局，浙江舟山 316000；2.遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116001)

廣泛應用于醫(yī)學和獸醫(yī)學領域的泰樂菌素具有中譜抗菌功能和動物生長促進作用，在各種介質中的污染狀況和環(huán)境行為備受關注，質譜檢測技術由于具有高效、穩(wěn)定、高靈敏度等特點，成為泰樂菌素檢測的主要手段。重點介紹2011年以來不同基質中泰樂菌素的樣品前處理方法，以及LC-ESI-MS/MS、LDTD-APCI-MS/MS、LC-SALDI-MS 、LC-Q-Orbitrap等各種質譜檢測技術的研究進展，以期為同類研究提供一定的參考。

泰樂菌素；樣品前處理；質譜；檢測技術

隨著社會的進步和人們生活水平的日益提高，人們對食品質量安全越來越重視。泰樂菌素是大環(huán)內酯類抗生素(macrolide antibiotics，MALs)中一類非常重要的抗菌化合物，同時也是一種重要的動物生長促進劑，廣泛地應用于醫(yī)學和獸醫(yī)學等領域。隨著研究的不斷深入，泰樂菌素等大環(huán)內酯類抗生素的潛在危害逐漸被發(fā)現。泰樂菌素藥物作為動物食品中的藥物殘留其檢測技術也成為國內外研究的熱點，而抗生素的發(fā)現和檢測主要得益于檢測技術的發(fā)展，液相色譜-質譜聯用技術具有高靈敏度、高分辨率、低檢出限等優(yōu)點，該技術的應用使抗生素檢測技術邁上了更高平臺。筆者綜述了2011年以來國內外泰樂菌素質譜檢測技術，以期為同類研究提供一定的參考。

1　泰樂菌素樣品前處理

自2012年以來，國內外對泰樂菌素研究較多的領域主要集中在畜禽[1-7]、蜂蜜[8]、水[9-11]、底泥[10]、糞便[12-14]、水產品[15-19]、嬰兒食品[20]、尿液[21]、奶制品[22-23]等樣品的分析。大環(huán)內酯類藥物為弱堿性化合物，在酸性(pH<4.0)和堿性(pH>9.0)條件下均不穩(wěn)定，且大環(huán)內酯類藥物能與陽離子特別是那些含有Ca2+和Mg2+形成螯合物。以上多種基質樣品的前處理多采取酸化乙腈和/或緩沖液提取，固相萃取柱凈化和濃縮各種基質中的泰樂菌素，具體見表1。雷曉寧等[11]采用在40 ℃下用乙腈-磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)萃取5 min，循環(huán)3次，活性污泥樣品中泰樂菌素的回收率達到80.8%～88.7%。Dickson LC等[19]在水產品試樣中加入3顆9 mm鋼珠和乙腈水，快速搖動5 min，離心后轉移上清液提取，再用乙腈和磷酸緩沖液重復提取，不僅鋼珠能再次破壞魚蝦組織，促進二次萃取溶劑完全滲透，磷酸緩沖液也可將螯合的泰樂菌素提取出來，獲得較好的回收率。糞便樣品多采用Mcllvaine緩沖液/EDTA緩沖液提取。萬位寧等[14]比較了EDTA-McIlvaine 無機提取液、甲醇和乙腈有機提取液單獨及混合使用時各目標物的回收率。結果發(fā)現，單獨使用 EDTA-McIlvaine 提取液，可有效減少抗生素與糞便中金屬離子螯合，但共提取雜質過多會干擾待測物出峰，并抑制質譜離子化過程，還易堵塞 SPE裝置，或導致串聯SAX柱過早吸附飽和，且單獨使用有機溶劑時，同時檢測的多種目標物回收率效果不理想，最終采用 EDTA-Mcllvaine緩沖液提取，再以甲醇混合乙腈進行提取的回收率較高。Berendsen B J等[13]比較了振蕩和超聲提取糞便樣品中泰樂菌素，結果發(fā)現，超聲提取效率并不優(yōu)于振蕩，由于振蕩操作簡單，批量處理作為首選。Morgan S等[12]用pH 5的McIlvaine和EDTA緩沖液與甲醇為提取液，25 ℃超聲波提取15 min泰樂菌素，檸檬酸調整上層清液pH在5～4，Stratax-C柱凈化，檸檬酸不僅能保持目標化合物的溫度，并且去除了目標化合物與陽離子之間的離子鍵，降低基質干擾。田豐等[17]對比磷酸鹽緩沖溶液、0.3% 偏磷酸-甲醇溶液、乙腈、Tris溶液和乙酸鹽溶液提取5種大環(huán)內酯類藥物，Tris溶液作為提取液時，5種大環(huán)內酯類抗生素的回收率在78.4%～99.1%范圍；同時對Varian C18、Oasis HLB(500 g)、Oasis HLB(200 g)、MCX和 Bakerbond SPE C185種固相萃取柱的效率做了比較，Oasis HLB(500 g)固相萃取柱的效果最理想，這和萬位寧等[14]、雷曉寧等[11]、王瑩等[6]的選擇一致。SPE C18柱常用于許多中等或低極性藥物的凈化，其凈化機制主要是疏水作用，也有一定的陽離子交換作用，但是對復雜基質的樣品凈化效果不好；SPE SCX柱采用硅膠基苯丙磺酸填料物，兼有陽離子交換作用和疏水作用機制，采用其凈化有一定的效果，但回收率并不理想；SPE HLB柱對極性化合物具有優(yōu)異的保留能力，其相對保留容量比傳統(tǒng)硅膠基質SPE吸附劑(如C18)較高。Morgan S等[12]則選擇StrataX-C陽離子交換柱，調上清液pH在4～9，可去除糞便基質中大部分的干擾物質。QuEChERS方法是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種多殘留快速篩選的基質分散凈化技術，是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用，吸附雜質從而達到除雜凈化的目的。Renata PL等[1]采用QuEChERS方法處理雞肉樣品，前處理過程非?？焖佟⒎奖?、廉價、有效、堅固耐用、安全，但他指出EDTA緩沖液和PSA共同提取雞肉樣品中的泰樂菌素，提取效率反而比乙腈差。Wei Jia等[22]優(yōu)化了嬰兒食品的提取步驟，認為乙腈-水(84∶16，V/V)是最適宜的提取溶劑，因為它能快速沉淀蛋白質，又與水有很好的互溶性，減少了脂溶性物質的提取，大大降低了基質干擾，提高了檢測的靈敏度和回收率。

表1　不同基質中泰樂菌素的樣品前處理方法及回收率

2　泰樂菌素質譜分析方法

2.1LC-ESI-MS/MS方法目前LC-ESI-MS/MS是檢測基質中泰樂菌素常用的方法，但是該方法受耐鹽能力較低及分析物必須以氣態(tài)進入質量分析器等條件限制，在實際檢測中需要優(yōu)化色譜、質譜條件，以提供整體最佳的峰值形狀，最大限度地提高方法的靈敏度和分辨率，主要色質譜參數具體見表2。Renata PL等[1]比較了甲酸水溶液-甲醇和甲酸水溶液-乙腈 2 種流動相的分離效果，結果顯示，甲酸-乙腈作流動相時的響應值和峰形更好，朱世超等[15]在研究中得到同樣的結論。雷曉寧等[11]則比較了乙酸銨-乙腈和乙酸銨-甲醇作為流動相的效果，結果發(fā)現使用10 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相時的響應值和分離效果最佳[11]。Berendsen BJ等對比了Phenomenex Kinetex C18、Kinetex C18XB、Waters ACQUITY UPLC BEH C18、HSS-T3和Waters Cortecs C18質譜柱分離糞便中46種藥物殘留的效果，發(fā)現使用Kinetex C18XB色譜柱分離效果最好，兩性化合物在其他4種質譜柱上顯示峰形較寬，分離效果不佳[13]。Berendsen BJ等[13]、Dickson LC等[19]、朱世超等[15]為了在一定程度上消除基質效應的影響，根據試樣制備相應的空白樣品提取液作為標準液的稀釋溶液，這使得標準品和樣品液具有一樣的離子化條件，降低基質效應。

ESI+模式下泰樂菌素以[M+H]+為分子離子峰，MRM 模式檢測泰樂菌素，其定性和定量離子對為916/174、916/145和916/772。LC-ESI-MS/MS檢測水產品中的泰樂菌素，方法的檢出限和定量限分別為0.5～1.0 μg/kg和1.0～4.0 μg/kg；由于基質不同，LC-ESI-MS/MS檢測其他基質中的泰樂菌素，方法的靈敏度和定量限各有不同，具體見表2。張園等[16]以羅紅霉素為內標，先用乙腈提取，中性氧化鋁柱凈化，LC-ESI-MS/MS檢測，檢出限為 0.5 μg/kg，定量限為 1.0 μg/kg，回收率為 82.40%～100.70%；Bayen S等[10]無需樣品前處理直接進樣，LC-ESI-MS/MS分析了地表淡水和海水7種抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺甲惡唑、磺胺二甲嘧啶、氯霉素、林可霉素、泰樂菌素)的檢測結果，泰樂菌素的定量限為0.16 ng/L，但是直接進樣會造成設備污染，增加維護保養(yǎng)頻率和降低設備使用壽命[10]。

表2　不同基質中泰樂菌素的LC-ESI-MS/MS方法

2.2LDTD-APCI-MS/MS方法LDTD高速熱解析化學電離源，是一種激光輔助的無接觸、熱解析化學電離質譜快速分析技術。LDTD與串聯質譜(MS/MS)或高分辨質譜聯用，利用高靈敏度的多反應離子檢測(MRM)、快速正負離子切換及高靈敏度全掃描等功能，4～6 s內實現液體樣品的定性和定量分析。LDTD-MS/MS保持了串聯質譜的高選擇性，增加了快速和極高分析通量的特點，適用于有大批量待檢樣品的生物醫(yī)藥分析、藥物發(fā)現與開發(fā)、藥品毒理研究、濫用藥物檢測、食品檢測、環(huán)境污染物分析等領域。

Morgan S等[12]首次報道了LDTD-APCI-MS/MS方法分析糞便中甲氧芐啶、磺胺多辛、林可霉素和泰樂菌素的測定。McIlvaine緩沖液和甲醇作為提取劑，超聲提取，陽離子交換柱固相萃取凈化，選擇反應監(jiān)測模式檢測。為避免檢測過程中的基體效應，在糞便中添加甲氧芐啶、磺胺多辛、林可霉素和泰樂菌素藥物殘留500 μg/kg的目標分析物，正離子模式下優(yōu)化了激光功率、激光模式、沉積量、載氣流量和沉積溶劑等LDTD參數以提高檢測信號強度。在APCI和ESI源下分別優(yōu)化了泰樂菌素的MS/MS參數：916/174和916/772離子對，最優(yōu)的激光能量設定在50%，最優(yōu)的激光模式為2 s，0.5 s步幅內從0%變化到50%，由于泰樂菌素的較高分子量，保留時間設定為1 s。流動相為甲醇-水(90∶10，V/V)、進樣量為3 mL時信噪比最高、基質效應最低。該方法的檢出限為2.5～8.3 μg/kg，定量限為8.3～28.0 μg/kg，該方法已成功地應用于實際的糞便樣本檢測。

2.3LC-Q-Orbitrap方法Q-Orbitrap 是傅立葉變換質譜的一種，將高性能四級桿的母離子選擇性與高分辨的準確質量數(HR/AM)Orbitrap檢測技術相結合，提供優(yōu)異性能和出色多功能性。Q-Orbitrap質譜儀能進行高精度的目標物或非目標物篩選，同時也能實現大范圍的定性和定量分析檢測。

Wei Jia等[20]采用超高效液相色譜-電噴霧四極Orbitrap高分辨質譜(UPLC-ESI Q-Orbitrap)同時篩選嬰兒食品的包含泰樂菌素的333種農藥和獸醫(yī)藥物殘留，流動相為甲醇和FAC/甲酸銨，色譜柱為QC18柱，目標分析物的主要離子為[M+NH4]+，正、負離子模式全紀錄色譜掃描。該方法通過2002/657/EC和SANCO/12571/2013的驗證，方法的回收率為79.8%～110.7%，方法定量限為0.01～9.27 μg/kg。Chitescu CL等[9]采用固相萃取和LC-Q Exactive Orbitrap高分辨質譜篩選和確證多瑙河流域的67藥物殘留研究，75%的化合物回收率在85%～115%，10%的化合物回收率在65%～85%。正、負離子模式全掃描，m/z為200時的分辨率為70 000 FWHM，自動增益設定在3e6，進樣時間設定在200 ms，掃描速率2次/s。泰樂菌素的掃描模式為正離子掃描，主要離子形式為[M+H]+，母離子m/z為916.526 4，主要子離子m/z為174.112 7、116.070 7和156.101 8，該方法中水樣的基質效應抑制了泰樂菌素12%的響應值，方法檢出限為9.7 ng/L，定量限為29.4 ng/L。

2.4LC-SALDI-MS方法 SALDI-MS是基于納米材料的免有機基質的激光解吸離子化質譜，形成質子化、堿金屬加成的[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+或脫氫得到[M-H]+等系列準分子離子，在質譜系統(tǒng)中得以分離和檢測。分析中使用的起到能量轉移作用的納米材料在低分子量區(qū)間不會產生背景干擾峰，可以將分析對象由大分子擴展到小分子。另外，SALDI-MS還具有許多其他優(yōu)點，如樣品制備簡單、信噪比高、耐鹽性好、基底表面信號重復性好及可實現樣品的定量分析等，是檢測的新方法。

Chen KY等[21]采樣液液微萃取-表面輔助激光解吸電離質譜檢測了人體尿液中的大環(huán)內酯類抗生素，丙酮作為分散劑，二氯甲烷作為萃取溶劑，丙酮和二氯甲烷混合液快速加入樣液中提取，離心收集下層提取液并吹干，膠體銀溶液溶解殘渣，表面輔助激光解吸電離質譜檢測，該方法紅霉素、螺旋霉素、替米考星和泰樂菌素的檢測限(LOD噪聲比為3)分別為在2、3、3和2 nmol/L，在線性范圍內由于提取溶劑的極性低，紅霉素、螺旋霉素、替米考星和泰樂菌素的回收率相對較低，分別為46.3%、48.2%、54.7%和55.9%，若采用有機溶劑和高極性或離子液體有機溶劑，或可提高回收率。DLLME技術不僅可有效地消除復雜的生物基質抑制效應，又能在10 min內完成尿液中大環(huán)內酯類抗生素的篩選。3結語

該研究主要對檢測泰樂菌素的多種質譜分析方法進行了綜述和介紹，但并不是所有的方法都是經過驗證并用于定量分析，只能為新方法的開發(fā)奠定堅實基礎。目前應根據樣品基質種類、設備及分析目的建立快速、合適的前處理方法及快速、靈敏、準確、可靠的質譜分析方法，為可能引起公眾健康安全危險的物質的監(jiān)管提供技術支撐。

[1] RENATA P L，ROCO C R，ROBERTO R G，et al.Development and validation of a multiclass method for the determination of eterinary drug residues in chicken by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Talanta，2012，89：201-208.

[2] DICKSON L C，O’BYRNE C，CHAN W.A quantitative method for residues of macrolide antibiotics in porcine kidney by liquid chromatography/tandem mass spectrometry[J].J AOAC Int，2012，95(2)：567-575.

[3] 班付國，胡興娟，吳寧鵬，等.超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬肉中66種獸藥殘留的研究[J].中國獸藥雜志，2014，48(6)：40-51.

[4] 林維宣，陳溪，張寧，等.LC-MS/MS測定腸衣中7種大環(huán)內酯類抗生素殘留量[J].食品研究與開發(fā)，2012，33(9)：123-128.

[5] 崔陽，王冰，徐剛，等.超高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬血清中泰樂菌素殘留的建立[J].東北農業(yè)大學學報，2011，42(9)：125-130.

[6] 王瑩，張素霞，程林麗，等.超高效液相色譜-串聯質譜法檢測豬肝中乙酰異戊酰泰樂菌素殘留[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(10)：224-227.

[7] REZENDE C P，SOUZA L F，ALMEIDA M P，et al.Optimisation and validation of a quantitative and confirmatory method for residues of macrolide antibiotics and lincomycin in kidney by liquid chromatography coupled to mass spectrometry[J].Food additives and contaminants，2012，29(4)：587-595.

[8] 高玲，張丹，郭棟，等.高效液相色譜-質譜法檢測蜂蜜中的大環(huán)內酯類藥物殘留[J].光譜實驗室，2012，29(6)：3568-3572.

[9] CHITESCU C L，KAKLAMANOS G，NICOLAU A I，et al.High sensitive multiresidue analysis of pharmaceuticals and antifungals in surface water using U-HPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS.Application to the Danube river basin on the Romanian territory[J].Science of the total environment，2015，532：501-511.

[10] BAYEN S，YI X，SEGOVIA E，et al.Analysis of selected antibiotics in surface freshwater and seawater using direct injection in liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Journal of chromatography A，2014，1338：38-43.

[11] 雷曉寧，方小丹，魯建江，等.HPLC-ESI-MS/MS檢測典型廢水與活性污泥中4種大環(huán)內酯類抗生素[J].分析測試學報，2013，32(6)：715-720.

[12] MORGAN S，DANIEL M S S.Analysis of trimethoprim，lincomycin，sulfadoxin and tylosin in swine manure using laser diode thermal desorption-atmospheric pressure chemical ionization-tandem mass spectrometry[J].Talanta，2014，128：23-30.

[13] BERENDSEN B J，WEGH R S，MEMELINK J，et al.The analysis of animal faeces as a tool to monitor antibiotic usage[J].Talanta，2015，132：258-268.

[14] 萬位寧，陳熹，居學海，等.固相萃取-超高效液相色譜串聯質譜法同時檢測禽畜糞便中多種抗生素殘留[J].分析化學，2013，41(7)：993-999.

[15] 朱世超，錢卓真，吳成業(yè).水產品中7種大環(huán)內酯類抗生素殘留量的HPLC-MS/MS測定[J].南方水產科學，2012，8(1)：54-60.

[16] 張園，吳成業(yè)，趙春暉，等.液相色譜質譜聯用法測定水產品中泰樂菌素殘留方法的研究[J].南方水產科學，2013，9(2)：57-62.

[17] 田豐，王飛，呂鵬，等.HPLC-ESI-MS/MS檢測河豚魚中5種抗生素殘留的方法[J].食品科學，2012，33(18)：206-210.

[18] 秦振發(fā).水產品中泰樂菌素殘留量的液質聯用檢測方法[J].南方農業(yè)，2014，8(18)：162，170.

[19] DICKSON L C.Performance characterization of a quantitative liquid chromatography-tandem mass spectrometric method for 12 macrolide and lincosamide antibiotics in salmon，shrimp and tilapia[J].Journal of chromatography B，2014，967：203-210.

[20] JIA W，CHU X，LING Y，et al.High-throughput screening of pesticide and veterinary drug residues in baby food by liquid chromatography coupled to quadrupole Orbitrap mass spectrometry[J].Journal of chromatography A，2014，1347：122-128.

[21] CHEN K Y，YANG T C，CHANG S Y.Determination of macrolide antibiotics using dispersive liquid-liquid microextraction followed by surface-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry[J].J Am Soc Mass Spectrom，2012，23(6)：1157-1160.

[22] DA COSTA R P，SPISSO B F，PEREIRA M U，et al.Innovative mixture of salts in the quick，easy，cheap，effective，rugged and safe method for the extraction of residual macrolides in milk followed by analysis with liquid chromatography and tandemmass spectrometry[J].J Sep Sci，2015，38(21)：3743-3749.

Research Progress of the Mass Spectrometry Detection Method of Tylosin

ZHOU Xiu-jin1, ZHANG Jing1, LIN Wei-xuan2et al

(1. Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan, Zhejiang 316000; 2. Liaoning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Dalian, Liaoning 116001)

Tylosin has a spectrum of antibacterial function and animal growth promoting effect, which is harm to humans and the environment, and arouses widespread attention．The mass spectrometry has become the major method for the determination of tylosin due to high efficiency, stability and sensitivity. In this research, we mainly introduced the sample pretreatment methods of tylosin in different substrates since 2011, as well as the research progresses of various mass spectrometry detection technologies, such as LC-ESI-MS/MS, LDTD-APCI-MS/MS, LC-SALDI-MS and LC-Q-Orbitrap. This research provides certain

for the further studies in similar works．

Tylosin; Sample pretreatment; Mass spectrometry; Detection technology

國家科技支撐項目(2012BAD29806)；國家質檢總局公益項目(201310140)。

周秀錦(1974-)，女，河南周口人，高級工程師，碩士，從事食品質量安全及標準化研究。

2016-06-24

S 816.73

A

0517-6611(2016)23-031-04