陳新諾，張朝輝，徐　林，唐　川，余　勁，李　勁，廖　昆，湯　承，張　斌*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.四川省甘孜州動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，四川康定 626000)

?

青藏高原牦牛感染BVDV和BEV的分子流行病學(xué)調(diào)查

陳新諾1，張朝輝2*，徐林2，唐川2，余勁2，李勁2，廖昆2，湯承1，張斌1*

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041；2.四川省甘孜州動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，四川康定 626000)

為了解青藏高原地區(qū)牦牛牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛腸道病毒(BEV)的感染情況,應(yīng)用RT-PCR對青藏高原地區(qū)(西藏、青海、四川和云南)共計(jì)222份出現(xiàn)腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品開展了分子流行病學(xué)調(diào)查。從222份樣品中，檢出44份BVDV陽性，BVDV陽性檢出率為20%(95% CI：15.5%～25.6%)；檢出65份BEV陽性，BEV陽性檢出率為29.4%(95% CI：24.1%～35.0%)；BVDV/BEV混合感染陽性率為4.8%(95% CI：2.5%～8.0%)。結(jié)果表明，所有被檢地區(qū)牦牛均存在BVDV和BEV感染，且部分地區(qū)感染較為嚴(yán)重，有混合感染的情況。研究結(jié)果旨在為青藏地區(qū)牦牛腹瀉的綜合防控措施提供基本數(shù)據(jù)，豐富BVDV和BEV的分子流行病學(xué)調(diào)查資料。

青藏高原；牦牛；牛病毒性腹瀉病毒；牛腸道病毒；分子流行病學(xué)調(diào)查

牛病毒性腹瀉是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)引起的一種極為復(fù)雜、呈多臨床類型表現(xiàn)的傳染性疾病，以發(fā)熱、白細(xì)胞下降、腹瀉、消化道黏膜糜爛、潰瘍、母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或畸形胎為主要特征[1]，一年四季均可發(fā)生，各種年齡均可發(fā)病，以3歲以上的母牦牛發(fā)病居多。BVDV屬黃病毒科、瘟病毒屬，是一種重要的動(dòng)物疫病病原，在全球范圍內(nèi)廣泛分布[2]。BVDV進(jìn)入機(jī)體后可造成持續(xù)性感染與免疫抑制，持續(xù)感染牛的血清抗體為陰性，但卻終身帶毒與排毒[3]。牛腸道病毒(Bovine enterovirus，BEV)屬于小RNA病毒科、腸道病毒屬，呈球形，大小為25 nm～30 nm，為無囊膜單股正鏈RNA病毒。牛腸道病毒病原性不明顯，通常只引起輕度腹瀉或隱性感染，但常因侵犯其他器官而引起各種臨床綜合征，或者在一定條件下引發(fā)顯著癥狀。BVDV被證實(shí)后，發(fā)現(xiàn)其在世界范圍內(nèi)流行，在養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的地區(qū)較為嚴(yán)重。自傳入我國后，各地牦牛產(chǎn)區(qū)陸續(xù)報(bào)道本病。近年來的血清流行病學(xué)表明[4-6]，該病在牦牛中廣泛流行，因牦牛生存環(huán)境特殊，且青藏高原當(dāng)?shù)啬撩耦A(yù)防意識不強(qiáng)，BVDV的感染情況十分嚴(yán)重，危害牦牛生產(chǎn)，給當(dāng)?shù)啬撩裨斐闪司薮蟮慕?jīng)濟(jì)損失。本研究對青藏高原地區(qū)的222份腹瀉牦牛的糞便樣本進(jìn)行了BVDV和BEV感染情況的分子流行病學(xué)調(diào)查，以期為牦牛BVDV和BEV的防控提供基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑與儀器QuickTaqHS DyeMix，Toybo-東洋紡生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA MarkerⅡ、Prime ScriptTMRT試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；Tirzol試劑盒(RNAiso Plus)，上海英駿生物科技有限公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)5804，Eppendor公司產(chǎn)品;普通PCR儀、核酸蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)VersaDoc2000，Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.1.2引物參照文獻(xiàn)[7-8]中引物序列，分別合成針對BVDV、BEV的2對特異性引物(表1)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1　引物序列

1.2方法

1.2.1樣品采集與處理2015年在青藏高原 (西藏、青海、四川和云南)4個(gè)省區(qū)分別采集發(fā)生腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品共計(jì)222份(西藏70份，青海60份，四川59份，云南33份)，按照采集地分別標(biāo)記編號。

將糞便樣品按1∶5加入滅菌生理鹽水研磨，經(jīng)反復(fù)凍融后，按每毫升加入青霉素、鏈霉素各1 000 單位，以3 000 r /min 離心20 min，取上清液。

1.2.2總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄參照上海英駿生物科技有限公司Trizol試劑盒(RNAisoPlus)說明書，提取牦牛BVDV總RNA。取病毒懸液500 μL加入700 μL的Trizol，室溫靜置10 min；加入 200 μL氯仿，強(qiáng)烈振蕩15 s，室溫靜止5 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液；加入等體積的異丙醇充分顛倒混勻，室溫靜置 10 min；4℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入1 mL 750 mL/L(經(jīng) DEPC處理過的滅菌水配制)乙醇；4℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液，用 15 μL經(jīng) DEPC處理過的無菌水溶解沉淀，置-70℃保存?zhèn)溆谩＠肞rime ScriptTMRT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并置于-20℃保存待用。

1.2.3BVDV的PCR的擴(kuò)增與檢測以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：QuickTaqHS DyeMix 5 μL，上、下游引物均為10 pmol/L各0.5 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O 3 μL ;PCR反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，68℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min；4℃終止反應(yīng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測與分析。

1.2.4BEV的PCR擴(kuò)增與檢測以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：QuickTaqHS Dye Mix 5 μL，上、下游引物均為10 pmol/L各0.2 μL，cDNA模板0.8 μL，加ddH2O 3.8 μL ；PCR反應(yīng)條件為：94℃ 2 min；94℃ 30 s，50℃ 30 s，68℃ 1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min；4℃終止反應(yīng)。取擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠核酸電泳和凝膠成像掃描儀進(jìn)行檢測與分析。

2　結(jié)果

2.1BVDV RT-PCR檢測

222株出現(xiàn)腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品中，BVDV中有44份擴(kuò)增出了特異性條帶，BVDV陽性檢出率為20%(95% CI：15.5%～25.6%)。部分樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.2BEV RT-PCR檢測

222株出現(xiàn)腹瀉癥狀的牦牛糞便樣品中，BEV中有65份擴(kuò)增出了特異性條帶，BVDV陽性檢出率為29.4%(95% CI：24.1%～35.0%)。部分樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2。

對收集的青藏高原地區(qū)的222份牦牛糞便進(jìn)行BVDV和BEV核酸檢測，從222份樣品中， BVDV陽性檢出率為20%(95% CI：15.5%～25.6%)(表2)。BEV陽性檢出率為29.4%(95% CI：24.1%～35.0%)。BVDV/BEV混合感染陽性率為4.8%(95% CI：2.5%～8.0%)。其中，西藏BVDV陽性檢出率為18.1%(95% CI：9.8%～27.2%)， BEV陽性檢出率為47.4%(95% CI：36.2%～59.1%)。BVDV/BEV混合感染陽性率為7%(95% CI：2.5%～13.8%)。青海BVDV陽性檢出率為35.6% (95% CI：24.1%～48.2%)， BEV陽性檢出率為25.8%(95% CI：16%～37%)。BVDV/BEV混合感染陽性率為8.1%(95% CI：2.7%～16.6%)。四川BVDV陽性檢出率為4.9% (95% CI：0.9%～10.9%)， BEV陽性檢出率為16.3%(95% CI：8%～27.3%)。云南BVDV陽性檢出率為28.4% (95% CI：14.9%～44.1%)， BEV陽性檢出率為25.6% (95% CI：12.6%～40.8%)。BVDV/BEV混合感染陽性率為8.4%(95% CI：1.7%～19.2%)?？梢姴煌貐^(qū)的牦牛感染BVDV、BEV的感染率不同，BVDV/BEV混合感染情況也不同。

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ；N.陰性對照；1～8.樣本 M．DNA Marker Ⅱ；N．Negative control；1-8．Samples圖1　BVDV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1　Amplified results of BVDV by RT-PCR

M．DNA標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ；N.陰性對照；1～8.樣本 M．DNA MarkerⅡ；N．Negative control；1-8．Samples圖2　BEV RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2　Amplified results of BEV by RT-PCR表2　BVDV和BEV陽性檢出率Table 2　The positive detection rates of BVDV and BEV

樣本來源Samplesource樣本數(shù)量/份SampleNo.BVDV檢出率/%PositiveratesofBVDVBEV檢出率/%PositiveratesofBEVBEV/BVDV檢出率/%PositiveratesofBVDV/BEV西藏Tibet7018.1(9.8～27.2)47.4(36.2～59.1)7(2.5～13.8)青海Qinghai6035.6(24.1～48.2)25.8(16～37)8.1(2.7～16.6)四川Sichuan594.9(0.9～10.9)16.3(8～27.3)0云南Yunnan3328.4(14.9～44.1)25.6(12.6～40.8)8.4(1.7～19.2)

3　討論

牦牛多生存于海拔3 000 m～5 000 m及以上的青藏高原地區(qū)，是典型的高原物種之一，具有“高原之舟”之稱。牦牛廣泛分布于中國青藏高原地區(qū)(西藏、青海、四川、云南)及其相鄰的高原地區(qū)。我國牦牛資源較為豐富，牦牛數(shù)量較多，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國約有1 300多萬頭牦牛，占世界牦?？倲?shù)的90%以上[9]。在青藏高原地區(qū)，牦牛作為最重要的高原生存物種之一，具有產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、皮革和絨毛生產(chǎn)等多方面的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[10]。

BVDV是導(dǎo)致牦牛腹瀉的重要病原，BVDV感染牦牛后可導(dǎo)致牛奶產(chǎn)量下降，牛奶品質(zhì)差，繁殖力降低，生長遲緩和繼發(fā)感染其他疾病。據(jù)調(diào)查，該病在我國大部分地區(qū)廣泛存在，牛群中相當(dāng)一部分是BVDV的攜帶者[11]。在國外牛群中，BEV感染陽性率高達(dá)17.6%～80%。BEV通過糞-口傳播，傳染源主要為病牛和無癥狀的病毒攜帶者。近年來，在我國的牛群中也不斷發(fā)現(xiàn)有BEV的存在。在我們前期研究中，利用宏病毒組學(xué)在腹瀉牦牛的糞便中發(fā)現(xiàn)了BEV，且具有相對高的檢出率。自青海第1例BVDV感染的血清學(xué)檢測開始，大量的調(diào)查顯示BVDV抗體血清陽性率為0.56%～72.14%[4-6]。2012年青海牦牛血清樣品中BVDV抗體陽性率為54.15%，四川紅原牦牛血清樣品中抗體陽性率為45.25%。2013年西藏牦牛血清樣品中BVDV抗體陽性率為54.15%，四川紅原牦牛血清樣品中BVDV抗體陽性率為45.25%?？梢钥闯觯?年的血清流行病學(xué)調(diào)查中，西藏牦牛血清樣品中BVDV抗體陽性率下降了20.32%，青藏地區(qū)下降了17.99%，四川紅原上升了10.78%，但3個(gè)省區(qū)的整體水平仍然較高。本調(diào)查應(yīng)用PCR從2013年青藏高原地區(qū)的20份腹瀉牦牛糞便樣品中檢測病毒流行情況，BVDV陽性率為15%，BEV陽性率為30%[8]。而本研究用PCR檢測2015年青藏地區(qū)腹瀉牦牛222份糞便樣品，BVDV陽性率為20%，BEV陽性率為29.4%；兩者檢測結(jié)果大致相同。根據(jù)本研究結(jié)果可見，青藏高原不同省區(qū)的牦牛感染BVDV、BEV的感染率不同，各個(gè)省區(qū)的牛場BVDV/BEV混合感染的情況也不同。目前還沒有牦牛專用的BVDV和BEV疫苗，因此，需要根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r及時(shí)做好防控工作，建立嚴(yán)格的飼養(yǎng)管理及獸醫(yī)防疫制度，加強(qiáng)重視區(qū)域性防控，降低BVDV、BEV感染率以及混合感染的情況。

[1]劉亞剛,殷中瓊,劉世貴,等.耗牛病毒性腹瀉/粘膜病的防治研究[J].中國獸醫(yī)預(yù)防學(xué)報(bào),2003,5(6):487-490.

[2]韓玉霞,孟露萍,孫志華,等.不同生物型BVDV感染對MDBK細(xì)胞泛素基因轉(zhuǎn)錄水平的影響[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(12):11-17.

[3]Helal M A,Okamatsu H,Taijima M.Bovine viral diarrhea virus infection in a dairy herd with high prevalence of persistently infected calves[J].Jpn J Vet Res,2012,60(2-3) :111-117.

[4]韓志華,圈華,賀曉龍,等.牦牛病毒性腹瀉病/粘膜病和傳染性鼻氣管炎血清學(xué)調(diào)查[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2010,18(6):56-59.

[5]赫曉龍,韓志輝.青海省牛傳染性鼻氣管炎及病毒性腹瀉粘膜病血清學(xué)調(diào)查[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2011(1):29-32.

[6]Gao J,Liu M,Meng X,et al.Seroprevalence of bovine viral diarrhea infection in yaks (Bosgrunniens) on the Qinghai-Tibetan Plateau of China[J].Trop Anim Health Prod,2013,45:791-793.

[7]Gong X W,Liu L H,Zheng F Y,et al.Molecular investigation of bovine viral diarrheavirus infection in yaks(Bosgruniens) from Qinghai,China[J].Virol J,2014,11:29.

[8]Chen X,Zhang B,Yue H,et al.A novel astrovirus species in the gut of yaks with diarrhea in the Qinghai-Tibetan Plateau,2013[J].J Gene Virol,2015,doi: 10.1099/jgv.0.000303.

[9]拜彬強(qiáng),郝力壯,柴沙駝,等.牦牛肉品質(zhì)特性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2014,35(17):290-296.

[10]李齊發(fā),趙興波,劉紅林,等.牦牛分類地位研究概述[J].動(dòng)物分類學(xué)報(bào),2006,31(3):520-524.

[11]范晴,謝芝勛,謝志勤,等.牛病毒性腹瀉病毒抗原捕獲ELISA方法的建立[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(2):4-2.

Investigation on Molecular Epidemiology of BVDV and BEV Infections in Yaks of Qinghai-Tibetan Plateau

CHEN Xin-nuo1,ZHANG Chao-hui2,XU Lin2,TANG Chuan2,YU Jin2,LI Jin2,LIAO Kun2,TANG Cheng1,ZHANG Bin1

(1.College of Life Science and Technology,Southwest University for Nationalities,Chengdu，Sichuan， 610041,China；2.DiseasePreventionandControlCenterofGanziTibetaAutonomousPrefectureofSichuanProvince,Kangding，Sichuan， 626000,China)

In order to investigate the prevalence and distribution of bovine viral diarrhea virus and bovine entero virus infections in yaks of Qinghai-Tibetan Plateau,this study used RT-PCR to carry out molecular epidemiological investigation on a total of 222 diarrhea samples of yak feces collected from Qinghai-Tibetan Plateau(Tibet,Qinghai,Sichuan,Yunnan).From 222 samples,44 samples were detected as BVDV positive,BVDV positive rate was 20%(95% CI：15.5%-25.6%)and 65 samples were detected as BEV positive,BEV positive rate was 29.4%(95% CI：24.1%-35.0%);the positive rate of mixed infection of BVDV/BEV was 4.8%(95% CI：2.5%-8.0%).The results showed that BVDV and BEV existed in all areas of the samples collected,and the yaks in part of regions were infected seriously.This study provided the basic data for the comprehensive prevention and control of BVDV and BEV infections in yaks of Qinghai-Tibetan Plateau,and enriched the data for BVDV and BEV epidemiological investigation.

Qinghai-Tibetan Plateau;yak;Bovine viral diarrhea virus;Bovine enterovirus;molecular epidemiological investigation

2015-12-26

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014JQ0044)；西南民族大學(xué)研究生創(chuàng)新型科研項(xiàng)目(CX2016SZ091)

陳新諾(1992-)，女，遼寧沈陽人，碩士研究生，主要從事青藏高原牦牛疾病研究。*通訊作者

S855.3

A

1007-5038(2016)09-0035-04