田　雨　王　娜　宋天姣　曹倩文　王　姍　鄭全輝

華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院河北省慢性病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　河北唐山　063000

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NKT細(xì)胞激活劑α-Galcer對(duì)小鼠肺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

田雨王娜宋天姣曹倩文王姍①鄭全輝①

華北理工大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；①基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院河北省慢性病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室河北唐山063000

①目的探討自然殺傷性T細(xì)胞(NKT)特異激活劑α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-Galcer)對(duì)小鼠肺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。②方法體外培養(yǎng)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(LLC)，經(jīng)腋部皮下注射雌性C57BL/6小鼠制備肺腫瘤模型。將LLC接種小鼠進(jìn)一步分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組小鼠腹腔注射α-Galcer，對(duì)照組小鼠注射等量溶劑二甲基亞砜(DMSO)。LLC接種兩周后處死小鼠，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周NKT細(xì)胞變化。③結(jié)果LLC細(xì)胞接種兩周后，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺腫瘤重量明顯小于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組小鼠外周NKT細(xì)胞數(shù)量顯著高于對(duì)照組。④結(jié)論α-Galcer通過(guò)促進(jìn)NKT細(xì)胞數(shù)量的增加,抑制小鼠肺腫瘤的生長(zhǎng)。

NKT細(xì)胞α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺肺腫瘤細(xì)胞

自然殺傷性T細(xì)胞(natural killer T cells,NKT)是一類近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群。最初因其細(xì)胞表面既表達(dá)T細(xì)胞受體復(fù)合物(TCR-CD3)，同時(shí)又表達(dá)NK細(xì)胞受體如NK1.1而命名，現(xiàn)在認(rèn)為具有MHC I類樣分子NK1.1而命名，具有MHC I類樣分子CD1d限制性的T細(xì)胞為NKT細(xì)胞[1]。與傳統(tǒng)T細(xì)胞主要識(shí)別多肽類抗原不同，NKT細(xì)胞通過(guò)識(shí)別由CD1d提呈的脂類抗原而活化，活化NKT細(xì)胞可迅速產(chǎn)生大量Th1和Th2型細(xì)胞因子如IFN-γ和IL-4,在抗腫瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植免疫耐受中發(fā)揮作用[2]。α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺(α-Galcer)是從海綿提取物中發(fā)現(xiàn)的一類NKT細(xì)胞激活劑，能夠誘導(dǎo)NKT細(xì)胞增殖并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，進(jìn)而激活CD8+T、NK等具有腫瘤殺傷作用的免疫細(xì)胞[3]。在此研究中,我們采用小鼠皮下腫瘤模型，觀察了α-Galcer對(duì)肺腫瘤的抑制效果。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞系(LLC)由北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院提供,在含10%胎牛血清及雙抗(青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/mL)的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，條件是飽和濕度、37℃、5%CO，2～3天更換1次培養(yǎng)液。細(xì)胞總數(shù)達(dá)到95%,融合時(shí)用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化、傳代培養(yǎng)。

1.1.2小鼠。 C57BL/6 小鼠由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供[許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0017],SPF級(jí)環(huán)境培養(yǎng)。

1.1.3主要試劑及儀器。α-Galcer購(gòu)于上海西寶生物科技有限公司，二甲基亞碸(DMSO)購(gòu)于北京康輝試劑有限公司。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶消化液、磷酸鹽緩沖液(PBS)購(gòu)自北京今日經(jīng)典試劑有限公司。熒光素標(biāo)記抗小鼠B220抗體、抗小鼠TCR-β抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司，熒光素標(biāo)記NKT細(xì)胞特異染色試劑CD1d-α-Galcer 四聚體(CD1d-tetramer)購(gòu)自英國(guó)Proimmune公司。流式細(xì)胞儀FACS Calibur為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1皮下肺癌小鼠模型制備。 消化、收集LLC細(xì)胞，離心去上清，用無(wú)菌生理鹽水洗滌兩次，將細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞活力大于95%。進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。選取6～8周齡雌性C57BL/6小鼠20只，腋下皮膚酒精消毒后注射LLC細(xì)胞100μL(1×106)/只。

1.2.2α-Galcer 處理。α-Galcer用DMSO溶解，濃度為100μg/mL。將LLC細(xì)胞注射小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組10只。實(shí)驗(yàn)組小鼠在LLC細(xì)胞接種當(dāng)天開(kāi)始腹腔注射α- Galcer,劑量為每只4μg/100μL, 連續(xù)注射3次，每次間隔3天。對(duì)照組腹腔注射等量DMSO溶液，注射次數(shù)及間隔同實(shí)驗(yàn)組。LLC細(xì)胞接種兩周后處死小鼠，觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況；

1.2.3流式細(xì)胞儀分析。LLC細(xì)胞接種兩周后分別取小鼠脾臟，裂解紅細(xì)胞，將脾細(xì)胞懸于含2%小牛血清的PBS液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/mL。取以上細(xì)胞懸液100μL加入流式管中, 加入2.4G2，4℃封閉10分鐘，先加入0.5μL PE 標(biāo)記的CD1d-α-Galcer 四聚體(CD1d-tetramer)冰上孵育30分鐘，再分別加入per-CP標(biāo)記B220和FITC標(biāo)記TCR-β抗體，冰上繼續(xù)孵育30分鐘，PBS液洗滌兩次后上機(jī)檢測(cè)，數(shù)據(jù)分析采用Cell Quest分析軟件。

2　結(jié)果

2.1LLC細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)LLC細(xì)胞，當(dāng)其密度達(dá)到細(xì)胞瓶95%時(shí)傳代、擴(kuò)增，直至細(xì)胞數(shù)量達(dá)到接種要求，見(jiàn)圖1。

圖1　LLC細(xì)胞培養(yǎng) 放大倍數(shù)：400×

圖2　實(shí)驗(yàn)組抑制小鼠肺腫瘤生長(zhǎng)

2.2α-Galcer對(duì)小鼠LLC細(xì)胞腫瘤的影響α-Galcer和對(duì)照組小鼠在LLC接種兩周后均有明顯腫瘤出現(xiàn)。對(duì)照組小鼠腫瘤平均重量為(3.27±0.43)克，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤平均重量為(2.08±0.28)克，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤明顯小于對(duì)照組小鼠，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3α-Galcer對(duì)小鼠NKT細(xì)胞數(shù)量的影響流式檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)照組小鼠脾臟NKT細(xì)胞所占比率為(0.66±0.06)%，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟NKT細(xì)胞所占比率為(1.51±0.09)%，實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟NKT細(xì)胞比率(P<0.01)和數(shù)量(P<0.05)較對(duì)照組小鼠均有顯著增加，見(jiàn)圖3。

注：NKT細(xì)胞為TCR-β和CD1d-tetramer染色雙陽(yáng)性細(xì)胞

圖3實(shí)驗(yàn)組增加小鼠外周NKT細(xì)胞的比率和數(shù)量

3　討論

肺癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤之一，嚴(yán)重危害人們的身體健康，目前仍無(wú)有效的治療方法。肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等與機(jī)體的免疫機(jī)能密切相關(guān)，其中參與固有免疫的細(xì)胞如自然殺傷細(xì)胞(NK)、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、巨噬細(xì)胞以及參與適應(yīng)性免疫細(xì)胞的各類T細(xì)胞亞群在機(jī)體抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。NKT細(xì)胞是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)T細(xì)胞亞群，產(chǎn)生于胸腺，成熟后主要分布在外周免疫器官和肝臟。活化NKT細(xì)胞能夠分泌大量不同類型的細(xì)胞因子，進(jìn)而在激活固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn)，NKT細(xì)胞通過(guò)激活NK細(xì)胞分泌表達(dá)IFN-γ和IFN-α，同時(shí)可以促進(jìn)DC的成熟和活化，而成熟的DC又可以進(jìn)一步活化NK和CD8+T細(xì)胞，間接發(fā)揮抗腫瘤作用。同時(shí)，NKT細(xì)胞激活后能夠通過(guò)穿孔素/顆粒酶、FasL/Fas或者TRAIL直接殺傷腫瘤細(xì)胞[5]。

近年來(lái)有關(guān)NKT細(xì)胞在肺癌患者中的變化已有報(bào)道，如任林廣等[6]研究結(jié)果顯示肺癌患者組外周血CD3+、CD4+T細(xì)胞以及NK、NKT細(xì)胞比率均顯著低于正常對(duì)照組；楊斌等[7]發(fā)現(xiàn)肺癌患者中，腫瘤的分期越晚，患者的NKT細(xì)胞數(shù)量就越少。以上研究結(jié)果表明，NKT細(xì)胞數(shù)量減少或功能降低可能是肺癌發(fā)生、發(fā)展的一個(gè)重要因素。

本研究中我們采用NKT細(xì)胞特異激活劑α-Galcer處理肺腫瘤小鼠，由于小鼠NKT細(xì)胞在小鼠外周血的比率很低，難于檢測(cè)，為此，我們主要檢測(cè)了肺腫瘤小鼠脾臟NKT細(xì)胞數(shù)量變化。發(fā)現(xiàn)α-Galcer處理在增加小鼠NKT細(xì)胞的同時(shí)，具有顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用，研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)提高NKT細(xì)胞數(shù)量來(lái)抑制肺腫瘤發(fā)展的可行性，而α-Galcer對(duì)肺腫瘤小鼠NKT細(xì)胞功能的影響，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中加以研究。

[1]Altman JB,Benavides AD,Das R,et al.Antitumor responses of invariant natural killer T cells[J].J Immunol Res,2015,2015(6):1-10

[2]Quanhui Zheng,Li Zhou,Qing sheng Mi.MicroRNA miR-150 is involved in invariant NKT cell development and function[J].J Immunol,2012,188(5):2118-2146

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[4]李娟，鄭全輝.NKT細(xì)胞研究進(jìn)展[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2015,31(5):700-703

[5]Huang JR,Tsai YC,Chang YJ,et al.α-Galactosylceramide but not phenyl-glycolipids induced NKT cell anergy and IL-33-mediated myeloid-derived suppressor cell accumulation via upregulation of egr2/3[J].J Immunol,2014,192(4):1972-1981

[6]任林廣,張健,徐廣偉,等.肺癌患者外周血T細(xì)胞亞群與NK、NKT細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2013,17(10):1873-1874

[7]楊斌,岳強(qiáng),王艷峰,等.NKG2D+CD8+NKT細(xì)胞及sMICA在肺癌免疫逃逸中的作用[J].中國(guó)藥物與臨床,2011,11(7):796-797

(2016-01-15收稿)(庫(kù)雪飛編輯)

NKT cell stimulator α-Galcer inhibit the lung tumor growth in mice

TIANYu,WANGNa,SONGTianjiao,etal

(CollegeofPublicHealth,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo explore the effect of NKT cell stimulator α-Galcer on the lung tumor growth in mice.MethodsC57BL/6 mice were subcutaneously injected with the Lewis lung tumor cell (LLC).The LLC injected mice were divided into experimental group(injected α-Galcer) and control group(injected DMSO).Two weeks after the LLC injection,tumors from the α-Galcer or DMSO treated group were weighed and the number of NKT cells were detected by flow cytometry.ResultsThe tumors from the experimental group were smaller than that of control group,while the ratio and number of NKT cells from experimental group were higher than that of control group.Conclusionα-Galcer inhibits the growth of lung tumor by increasing the number of NKT cells.

NKT cell.α-Galcer.Lung tumor cell

華北理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)：X2015153)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81373111)；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：H2013209019)。

田雨(1994-)，女，在校本科生。研究方向：腫瘤免疫。

鄭全輝。

R 734.2

A

2095-2694(2016)04-323-03