陳新宇，段志良，江明華，賈慶軍，徐娟娟，陳柏坤，文金生，

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院蟲媒病毒研究所，浙江 溫州 325035）

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登革病毒高度保守的HLA-A*1101限制性T細胞表位鑒定和體內(nèi)免疫反應研究

陳新宇1，段志良1，江明華1，賈慶軍2，徐娟娟2，陳柏坤2，文金生1，2

（1.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 檢驗科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院蟲媒病毒研究所，浙江 溫州 325035）

目的：鑒定登革病毒2型（DENV-2）HLA-A*1101限制性T細胞表位并探討其誘導的T細胞反應的特征。方法：基于DENV-2的氨基酸序列，采用T細胞表位預測軟件預測HLA-A*1101限制性候選T細胞表位；基于HLA-A*1101轉基因小鼠，采用ELISPOT實驗、ELISA實驗和CD8+T細胞（CTL）殺傷實驗研究候選表位的HLAA*1101限制性和所誘導的T細胞反應的特征。結果：在合成的14條候選表位中，9條肽（NS1161-170、NS1263-272、NS36-15、NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）免疫HLA-A*1101轉基因小鼠可誘導產(chǎn)生肽特異性分泌IFN-γ的T細胞。除了分泌IFN-γ，C58-67和NS3576-584特異性T細胞也可分泌TNF-α，而E30-38特異性T細胞更可同時分泌TNF-α和IL-6。DENV-2感染的HLA-A*1101轉基因小鼠體內(nèi)也可檢測到針對NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80的分泌IFN-γ的T細胞。采用上述6條肽的混合物免疫HLA-A*1101轉基因小鼠所誘導的效應細胞可顯著殺傷DENV-2感染的小鼠脾單核細胞。結論：本研究鑒定出了9條全新的DENV-2特異性HLA-A*1101限制性T細胞表位。

登革病毒；HLA-A*1101；表位/肽；轉基因小鼠

登革病毒（dengue virus，DENV）感染常引起自限性登革熱（dengue fever，DF），也可導致致死性登革出血熱（dengue hemorrhagic fever，DHF）/登革休克綜合癥（dengue shock syndrome，DSS）。每年約有3.9億人感染DENV，包括約1億DF患者，50萬DHF和（或）DSS，2萬死亡病例［1-2］。大量研究表明：DENV特異性CD8+T細胞（CTL）不但可保護機體抵抗DENV的攻擊、控制DENV感染和復制［3-5］，而且可預防DENV二次感染時抗體依賴增強效應（antibody dependent enhancement，ADE）的發(fā)生［6］。因此，鑒定CTL表位將有助于研發(fā)新型登革候選疫苗及用于評估候選疫苗的細胞免疫效應。本研究擬預測合成DENV-2中潛在的HLA-A*1101限制性CTL表位，候選表位免疫HLA-A*1101轉基因小鼠，采用酶聯(lián)免疫斑點（ELISPOT）實驗和ELISA實驗檢測肽特異性分泌IFN-γ、TNF-α和IL-6的T細胞的水平。DENV-2感染HLA-A*1101轉基因小鼠，采用ELISPOT實驗檢測肽特異性分泌IFN-γ的T細胞的水平，最后采用CTL殺傷實驗評估肽特異性T細胞對DENV-2感染的靶細胞的殺傷效應。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1表位預測和肽合成：基于DENV-2（NGC株；GenBank Accession No：AAC59275）氨基酸序列，采用SYFPEITHI軟件（http://www.syfpeithi.de/ bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm）預測HLA-A*1101限制性CTL表位［7］，并用PAProc軟件（http://www.paproc.de/）分析預測的候選表位是否含有人蛋白酶體裂解位點。委托上海強耀多肽合成公司合成純度＞95%的候選表位和1條廣譜性Pan-DR Th表位（PADRE：AKFVAAWTLKAAA），并溶于無菌PBS中至終濃度1 mg/mL。

1.1.2細胞株：C6/36細胞株購自美國ATCC并采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.1.3免疫小鼠分組：CB6F1-Tg（HLA-A*1101/H2-Kb）A11.01小鼠（HLA-A*1101轉基因小鼠）購自美國Taconic公司并于SPF級動物房飼養(yǎng)和繁殖。將雌性HLA-A*1101轉基因小鼠（6～8周齡）隨機分成16組（每組5只）。250 μg每條肽與250 μg PADRE肽溶于500 μL PBS，然后與500 μL弗氏完全佐劑進行乳化，隨后，將乳化好的肽溶液平均在5只小鼠背部皮下多點注射。1周后，同樣肽與弗氏不完全佐劑的乳化液加強免疫小鼠3次（間隔1周）。對照小鼠（模擬免疫組）采用同樣的免疫策略和佐劑免疫（無任何肽）。另外，6條肽的混合液（每條肽50 μg）采用上述免疫策略免疫5只小鼠。末次免疫1周后，處死小鼠，摘取小鼠脾和淋巴結（腘窩淋巴結和鎖骨下淋巴結）并制備脾細胞和淋巴結細胞懸液。采用小鼠淋巴細胞分離液分離脾細胞中脾單個核細胞（splenic mononuclear cells，SMCs）。采用IFN-γ ELISPOT實驗檢測SMCs和淋巴結細胞中肽特異性分泌IFN-γ的T細胞的水平，采用ELISA實驗檢測脾細胞中分泌TNF-α和IL-6的T細胞的水平。另外，對來自6條肽混合物免疫小鼠的脾細胞，進一步采用小鼠淋巴細胞分離液分離脾細胞中SMCs，采用IFN-γ ELISPOT實驗檢測SMCs中肽特異性分泌IFN-γ的T細胞的水平。另外，SMCs作為效應細胞用于基于乳酸脫氫酶（LDH）釋放的CTL殺傷實驗。

1.2方法

1.2.1DENV-2感染HLA-A*1101轉基因小鼠：將DENV-2（NGC株）加入C6/36細胞于37 ℃感染2 h，棄病毒液后于37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d。當細胞病變出現(xiàn)“+++”時，收集細胞上清液并采用0.22 μm過濾器過濾，濾過病毒液采用Vero細胞測定PFU后凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。通過小鼠尾靜脈將上述濾過病毒液注入HLA-A*1101轉基因小鼠體內(nèi)（0.5 mL，1× 107PFU/小鼠）。4周后，處死小鼠制備脾細胞懸液并分離出SMCs。采用IFN-γ ELISPOT實驗檢測SMCs中單個上述候選表位特異性T細胞的水平。

1.2.2準備靶細胞：將正常的HLA-A*1101轉基因小鼠的脾細胞鋪于6孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)2 h后，棄每孔上清液，采用RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕洗孔3次。在感染復數(shù)（MOI）為5時，將DENV-2加入貼壁細胞（脾單核細胞）于37 ℃感染2 h，棄病毒液，加RPMI-1640維持液于37 ℃培養(yǎng)24 h。未感染的脾單核細胞和DENV-2感染的脾單核細胞做為靶細胞用于CTL殺傷實驗。

1.2.3小鼠IFN-γ ELISPOT檢測：小鼠IFN-γ ELISPOT試劑盒（預包被96孔板）購自荷蘭U-CyTech公司，ELISPOT實驗方法參考本課題組前期研究［8］。將上述SMCs（每孔2×105細胞）或淋巴結細胞（每孔2×105細胞）加入ELISPOT板每孔中。背景對照孔（無肽）和實驗孔（每孔20 μg肽）均為雙復孔。于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄細胞并洗板。依次進行：加抗小鼠IFN-γ單抗并孵育，洗板；加HRP標記的鏈霉親合素并孵育，洗板；加底物并顯色，洗板。最終，孔中每個斑點代表一個斑點形成細胞（spot forming cell，SFC）或肽特異性分泌IFN-γ的T細胞。采用ELISPOT讀板儀計數(shù)每孔斑點數(shù)，結果表示為IFN-γ SFCs/2×105SMCs或淋巴結細胞。

1.2.4小鼠細胞因子ELISA檢測：小鼠TNF-α，IL-6 ELISA試劑盒（預包被96孔板）購自達科為生物科技公司。參考說明書進行操作，將肽免疫的小鼠的脾細胞（1×106細胞）加入無菌的1.5 mL EP管（500 μL培養(yǎng)基）。設置背景對照（無肽）和實驗孔（20 μg不同的候選表位肽）。于37 ℃培養(yǎng)48 h后，離心EP管后將100 μL上清轉移至ELISA 96孔板中。隨后按照說明書，依次加抗小鼠TNF-α或IL-6的抗體、孵育、洗板；加HRP標記的鏈霉親合素、孵育、洗板；加底物并顯色。采用酶標儀測定每孔液體的OD450值。根據(jù)TNF-α或IL-6標準品測定并繪制的標準曲線，計算出每孔中細胞因子的濃度（pg/mL）。

1.2.5基于LDH釋放的CTL殺傷試驗：細胞毒實驗試劑盒購自美國Promega公司，并用于測定肽特異性T細胞殺傷DENV-2感染的小鼠脾單核細胞的能力。根據(jù)說明書，本實驗在V形底96孔板中進行。6條肽混合免疫小鼠的SMCs用作效應細胞，未感染的小鼠脾單核細胞和DENV-2感染的小鼠脾單核細胞做為靶細胞。將各種細胞依次加入V形底孔中。實驗孔包括恒定量的靶細胞（每孔1×104細胞）和3種不同量的效應細胞［效/靶（E:T）比分別為10:1，5:1，1:1］，靶細胞自發(fā)釋放孔（TS孔，每孔1×104細胞），效應細胞自發(fā)釋放孔（ES孔，每孔1×105或5×104或1×104細胞），靶細胞最大釋放孔（TM孔，每孔1×104細胞），培養(yǎng)基孔（CM孔），容積校正孔（VC孔）。37 ℃孵育8 h后，向TM孔和VC孔加入細胞裂解液，于37 ℃繼續(xù)孵育1 h。離心96孔板（400 g，4 min），轉移每孔50 μL上清至平底96孔板每孔中，然后每孔加入底物，于37 ℃避光反應20 min。采用酶標儀測定每孔OD490。針對每個E:T比，將各孔OD490值代入下面公式以計算靶細胞被效應細胞殺傷的百分比。

1.3統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)采用來表示，2組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1候選表位的特征 從預測的表位中選擇合成了14條預測得分高并且羧基端為人蛋白酶體裂解位點的候選表位，其中5條為9肽［NS549-57（ETDHHAVSR）、NS5571-579（LTYQNKVVR）、E30-38（CVTTMAKNK）、NS3576-584（NVEVEIWTK）和NS4a72-80（LMSGRGIGK）］，9條為10肽［NS1161-170（GVFTTNIWLK）、NS1263-272（QTAGPWHLGK）、NS2a85-94（PTFAAGLLLR）、NS2a126-135（ALALGMMVLK）、NS36-15（DVPSPPPVGK）、NS4b44-53（ATTFVTPMLR）、NS333-42（YSQIGAGVYK）、NS4b77-86（GLGKGWPLSK）和C58-67（TIPPTAGILK）］。BLAST檢索顯示，大部分候選表位（12/14）在超過700個DENV-2分離株中保守（表1），E30-38為保守性最高的肽。另外，4條肽（NS1161-170、NS1263-272、NS5571-579和E30-38）在其他DENV血清型中也保守，見表1。

2.2候選表位誘導HLA-A*1101轉基因小鼠產(chǎn)生肽特異性T細胞反應 14條候選CTL表位中，9條肽（NS1161-170、NS1263-272、NS36-15、NS4b44-53、NS333-42、C58-67，E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）免疫HLA-A*1101轉基因小鼠誘導產(chǎn)生了高水平的可分泌IFN-γ的T細胞反應，其中NS1263-272誘導的T細胞反應最強烈，見圖1。而剩余5條肽（NS2a85-94、NS2a126-135、NS4b77-86、NS549-57和NS5571-579）所誘導產(chǎn)生的T細胞頻率與背景對照差異無統(tǒng)計學意義。采用ELISA實驗檢測了肽誘導產(chǎn)生的T細胞在分泌IFN-γ以外是否還可分泌促炎因子（TNF-α和IL-6）。E30-38誘導的T細胞還可同時分泌TNF-α和IL-6，即使C58-67和NS3576-584特異性T細胞也可分泌TNF-α；而剩余的6條肽誘導的T細胞不分泌TNF-α和IL-6，見圖2A-B。

2.3DENV-2感染HLA-A*1101轉基因小鼠產(chǎn)生肽特異性T細胞反應 DENV-2感染小鼠的SMCs可識別6條肽（NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80），表現(xiàn)為SMCs受到這些肽刺激時可分泌IFN-γ（圖3）。另外，ELISA結果提示E30-38特異性T細胞還可分泌TNF-α和IL-6，而C58-67和NS3576-584特異性T細胞只產(chǎn)生TNF-α（數(shù)據(jù)本文未提供）。DENV-2感染小鼠的SMCs在受到其他8條肽刺激時既不分泌IFN-γ，也不分泌TNF-α和IL-6，見圖3。

2.4候選表位免疫的HLA-A*1101轉基因小鼠體內(nèi)肽特異性T細胞的細胞毒效應 在混合肽免疫小鼠的SMCs中存在單個肽特異性分泌IFN-γ的T細胞；混合肽免疫小鼠的SMCs可高效殺傷DENV-2感染的小鼠脾單核細胞，靶細胞殺傷百分率與E：T比呈正比［（54.69±12.23）%，E:T=10:1；（31.21±8.79）%，E:T= 5:1；（10.85±4.38）%，E:T=1:1］；而SMCs對正常的小鼠脾單核細胞無顯著性殺傷效果，見圖4和圖5。

表1　HLA-A*1101限制性候選T細胞表位

圖1　肽免疫的HLA-A*1101轉基因小鼠脾和淋巴結內(nèi)肽特異性分泌IFN-γ的細胞的頻率

圖2　肽免疫的HLA-A*1101轉基因小鼠脾內(nèi)肽特異性細胞分泌TNF-α和IL-6的情況

圖3　DENV-2感染的HLA-A*1101轉基因小鼠脾內(nèi)肽特異性分泌IFN-γ的細胞

圖4　6條肽混合物免疫的HLA-A*1101轉基因小鼠脾內(nèi)肽特異性分泌IFN-γ的細胞

圖5　6條肽混合物免疫的HLA-A*1101轉基因小鼠SMCs的殺傷效應

3　討論

考慮到HLA-A的等位基因A*1101具有廣泛人群覆蓋率，其在不同膚色和種族中人群覆蓋率均超過20%［9］。DENV-2是中國近年來主要的流行血清型［10］。因此，本研究擬鑒定DENV-2中受HLA-A*1101限制的CTL表位并探討其所誘導T細胞反應的特征?？紤]到IFN-γ是T細胞分泌的一種可抑制DENV復制的細胞因子［11］，因此我們首先評估候選CTL表位在HLAA*1101轉基因小鼠內(nèi)誘導的T細胞能否分泌IFN-γ。盡管14條候選表位均具有較高的預測得分，但只有9條肽可誘導顯著的IFN-γ+T細胞反應。值得注意的是，所有14條候選表位免疫Balb/c和C57BL/6小鼠均未誘導具有統(tǒng)計學意義的IFN-γ+T細胞反應，而且模擬（無肽）免疫的HLA-A*1101轉基因小鼠體內(nèi)也不存在這些候選表位特異性IFN-γ+T細胞反應（數(shù)據(jù)本文未提供）。上述實驗結果強烈提示上述9條肽應該受HLA-A*1101限制性，而不受小鼠MHC分子（H-2分子）限制。Imrie等［12］的研究表明：人的DENV特異性多功能性CTL能夠同時分泌IFN-γ、IL-6 和TNF-α。我們前期基于HLA-A*2402轉基因小鼠的研究也發(fā)現(xiàn)小鼠的DENV特異性多功能CTL也可分泌這些細胞因子［13］。而本研究再一次證明了這種現(xiàn)象的存在：E30-38、C58-67和NS3576-584可誘導多功能性T細胞反應。最新研究表明：DENV特異性多功能CTL細胞可保護機體免于感染DENV［5］。因此，這3條表位可能具有誘導保護性免疫的效應。

為了確定DENV蛋白是否可被小鼠蛋白酶體加工釋放出這些候選CTL表位，進而誘導T細胞反應。將DENV-2通過血液途徑感染HLA-A*1101轉基因小鼠，在體外采用各個候選CTL表位刺激小鼠SMCs，采用ELISPOT實驗檢測SMCs在受到候選表位刺激時是否分泌IFN-γ。我們發(fā)現(xiàn)DENV-2感染的小鼠的SMCs可識別6條上述鑒定的表位（NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）。這些數(shù)據(jù)提示DENV的蛋白可被小鼠蛋白酶體加工產(chǎn)生上述6條肽，后者誘導了T細胞反應。由于DENV在小鼠細胞內(nèi)復制水平低，產(chǎn)生的肽的濃度也偏低，因而誘導的T細胞反應的水平較弱。3條肽（C58-67、E30-38和NS3576-584）特異性T細胞分泌TNF-α和IL-6的模式同肽免疫小鼠中T細胞分泌這些細胞因子的模式一致，再次印證了這些多功能性T細胞反應。盡管NS1161-170、NS1263-272和NS36-15免疫HLA-A*1101轉基因小鼠可誘導高水平的T細胞反應，但三者不被DENV-2感染小鼠的SMCs識別，提示DENV的蛋白在小鼠細胞內(nèi)無法加工產(chǎn)生這3條肽。由于6條肽（NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）可誘導IFN-γ+ T細胞反應，并且可被DENV-2感染的HLA-A*1101轉基因小鼠的脾細胞識別。因此，這些表位可做為免疫原用于評估登革候選疫苗在小鼠體內(nèi)誘導T細胞免疫反應的情況。另外，由于6條表位（NS4b44-53、NS333-42、C58-67、E30-38、NS3576-584和NS4a72-80）均受HLA-A*1101分子呈遞，因此我們想知道這6條肽同時免疫機體時是否存在相互干擾以及所誘導的T細胞是否可殺傷DENV-2感染的靶細胞。結果，6條肽混合免疫小鼠也可誘導產(chǎn)生單個肽特異性IFN-γ+T細胞（說明肽與肽之間在免疫時無明顯干擾），后者可高效殺傷DENV-2感染的小鼠脾單核細胞。

研究人員僅從DENV中鑒定出了數(shù)量有限的HLAA*1101限制性表位。例如，NS3133-142（GTSGSPIIDK）和E258-266（GAMHSALAG）被鑒定為HLA-A*1101限制性表位［14］。Weiskopf等［15］報道了9條DENV-2特異性HLA-A*1101限制性表位。Appanna等［16］從DENV-2中鑒定出了HLA-A11限制性表位。將我們本研究鑒定的表位與上述研究人員報道的表位對比可知，本文鑒定的表位NS333-42（YSQIGAGVYK）比Weiskopf研究團隊報道的HLA-A*1101限制性表位NS334-42（SQ IGAGVYK）多一個氨基酸殘基。Vaughan等［17］報道NS4a61-80（LATVTGGIFLFLMSGRGIGK）是一個T細胞表位，但并沒有確定其最短的免疫優(yōu)勢肽。本研究鑒定的表位NS4a72-80（LMSGRGIGK）位于上述肽序列內(nèi)，因而應該是最短的免疫優(yōu)勢肽。Rivino等［18］從DENV-2鑒定出了一條CTL表位NS1161-175（GVFTT NIWL KLKEKQ）但未確定其HLA限制性。近期研究表明NS1162-171（VFTTNIWLKL）是一條HLA-A*2402限制性表位［12］。有趣的是，本研究證明與其高度相似的肽NS1161-170（GVFTTNIWLK）為HLA-A*1101限制性表位，二者僅有1個氨基酸殘基差異。

本研究鑒定出了9條DENV-2特異性HLA-A*1101限制性表位。本研究所鑒定的表位可被用于研究CTL的功能、評估登革候選疫苗在小鼠內(nèi)細胞免疫效果，甚而研發(fā)基于CTL表位的新型登革疫苗。

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（本文編輯：吳彬）

Identification of dengue virus-derived highly conserved HLA-A*1101-restricted T-cell epitopes and study on their in vivo immune responses

CHEN Xinyu1，DUAN Zhiliang1，JIANG Minghua1，JIA Qingjun2，XU Juanjuan2，CHEN Bokun2，WEN Jinsheng1，2. 1.Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325027； 2.Institute of Arboviruses，School of Basic Medical Sciences，Wenzhou Medical University，Wenzhou，325035

Objective： To identify dengue virus serotype 2 （DENV-2）-derived HLA-A*1101-restricted T-cell epitopes and explore the characteristics of induced T cells. Methods： Based on the complete amino acid sequence of DENV-2，T-cell epitope prediction software was utilized to predict putative HLA-A*1101-restricted T-cell epitope. Based on HLA-A*1101 transgenic mice，the HLA-A*1101 restriction of epitope candidates and the characteristics of induced T cells were determined using ELISPOT assay，ELISA assay and CTL cytotoxicity assay. Results： Among 14 epitope candidated，each of 9 peptide （NS1161-170，NS1263-272，NS36-15，NS4b44-53，NS333-42，C58-67，E30-38，NS3576-584，and NS4a72-80） could induce IFN-γ-secreting T cell response in HLA-A*1101 transgenic mice. Except for IFN-γ，C58-67- and NS3576-584-specifc T cells also could secret TNF-α while E30-38-specifc T cells could secret TNF-α and IL-6 simultaneously. High levels of IFN-γ-secreting T cells were detected in DENV-2-infected HLA-A*1101 transgenic mice and directed to 6 peptides （NS4b44-53，NS333-42，C58-67，E30-38，NS3576-584，and NS4a72-80）. The effector cells from HLA-A*1101 transgenic mice immunized with the mixture of 6 abovementioned peptides effciently lysed DENV-2-infected splenic monocytes. Conclusion： Nine DENV-2-derived peptides are identifed as HLA-A*1101-restricted T-cell epitopes.

dengue virus； HLA-A*1101； epitope/peptide； transgenic mice

R373.2

A DOI： 10.3969/j.issn.2095-9400.2016.08.002

2015-11-11

國家自然科學基金資助項目（81501363）；浙江省自然科學基金資助項目（LQ14C010006）；浙江省科技計劃項目（Y2014 0653）。

陳新宇（1976-），男，浙江溫州人，副主任技師。

文金生，教授，碩士生導師，Email：wjs78@wmu.edu. cn。