楊紅霞，高　亞，蔣恒波，劉錄山

(1.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州　425000；2 南華大學(xué)心血管疾病研究所，湖南 衡陽　421001)

?

EGCG通過miR-33a上調(diào)ABCA1表達(dá)減少巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積

楊紅霞1，高亞2，蔣恒波1，劉錄山2

(1.湖南永州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 永州425000；2 南華大學(xué)心血管疾病研究所，湖南 衡陽421001)

目的研究EGCG是否通過影響miR-33a的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控ABCA1表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。方法先建立THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞，然后用EGCG處理，Real time PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-33a表達(dá)。細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、50 μmol·L-1EGCG處理組、50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組，Real time PCR和Werstern blot檢測(cè)細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白表達(dá)，油紅O 染色和高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量，[3H]法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出。結(jié)果在不影響細(xì)胞活性狀況下，EGCG呈濃度和時(shí)間依賴性下調(diào)miRNA33a表達(dá)；EGCG能明顯上調(diào)ABCA1 mRNA 和蛋白的表達(dá)，但能被轉(zhuǎn)染miRNA33 mimic抑制；EGCG可減少THP-1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)蓄積，但能被細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA33 mimic所弱化；EGCG減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積是與其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出有關(guān)，細(xì)胞中轉(zhuǎn)入過量miRNA33a可以抑制膽固醇流出。結(jié)論EGCG可通過減少miRNA33a的生成，進(jìn)而上調(diào)ABCA1表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇流出，這可能是EGCG抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的分子機(jī)制之一。

三磷酸腺苷結(jié)合盒A1；小分子RNA；巨噬細(xì)胞；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；泡沫細(xì)胞；脂質(zhì)代謝

MicroRNAs(miRNAs)是一類高度保守的非編碼小RNA，主要通過與靶標(biāo)基因的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)靶向結(jié)合，直接降解靶基因的mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯而調(diào)控基因的表達(dá)。目前，miRNAs在脂質(zhì)代謝中的調(diào)節(jié)作用日益得到重視，miR-33a位于固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-2(sterol regulatory element binding protein-2，SREBP-2)基因的第16位內(nèi)含子中，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守，其主要靶基因是三磷酸腺苷結(jié)合盒A1(ATP binding cassette transporter A1， ABCA1)[1]。ABCA1是介導(dǎo)細(xì)胞膽固醇流出的主要膜轉(zhuǎn)運(yùn)體，研究表明，miR-33a可抑制ABCA1表達(dá)，減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，導(dǎo)致泡沫細(xì)胞的形成[1-2]。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是綠茶中的一種主要活性成分，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤[3]等多種疾病均具有明顯的藥理作用。研究表明，EGCG可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝而抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[4-5]。近來研究也發(fā)現(xiàn)EGCG可上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)抑制泡沫細(xì)胞形成[6]，但miR-33a是否在其中發(fā)揮作用尚不清楚。因此，本研究觀察EGCG是否影響THP-1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞miR-33a的表達(dá)，并探討miR-33a在EGCG上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)抑制泡沫細(xì)胞形成中的作用，從而為動(dòng)脈粥樣硬化的防治提供新的策略。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑THP-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心； miR-33a 模擬物(miR-33a mimic)購自廣州銳博公司；EGCG、ABCA1 兔抗人一抗以及佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)購自Sigma 公司；GAPDH和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自杭州賢致公司；總RNA 抽提試劑盒購自Invitrogen 公司，SYBR Master Mixture購自TAKARA公司，RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega 公司，BCA 蛋白定量試劑盒、Western blot 熒光檢測(cè)試劑盒為江蘇碧云天公司產(chǎn)品，oxLDL購自廣州奕源生物科技有限公司，其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)THP-1細(xì)胞160 nmol·L-1的PMA處理24 h，使其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，再用50 mg·L-1oxLDL孵育使其變成泡沫細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。THP-1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后加按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加處理因素。

1.3Real time PCR檢測(cè)細(xì)胞miR-33a表達(dá)用不同濃度EGCG(0、12.5、25、50 μmol·L-1)處理THP-1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h，或用50 μmol·L-1的EGCG處理THP-1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時(shí)間(0、6、12、24 h)，提取細(xì)胞RNA。miR-33a檢測(cè)引物由廣州銳博設(shè)計(jì)合成，上游引物為: 5′-GUGCAUUGUAGUUGCAUUG-3′，下游引物miScript 通用引物。 PCR條件為: 95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)，設(shè)U6為內(nèi)參，其相對(duì)表達(dá)量采用△△CT法計(jì)算。

1.4Real time PCR檢測(cè)細(xì)胞ABCA1 mRNA表達(dá)細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、50 μmol·L-1EGCG處理組、50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組，處理24 h后，提取細(xì)胞RNA。ABCA1上游引物為: 5′-GGTTTG GAGATGGTTATACAATAGTTGT-3′, 下游引物為： 5′-CCCGGAAACGCAAGTCC-3′。采用SYBR綠色熒光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行Real time PCR分析。β-actin的表達(dá)用做內(nèi)參照，其相對(duì)表達(dá)量采用△△CT 法計(jì)算。

1.5Werstern blot檢測(cè)細(xì)胞ABCA1 蛋白表達(dá)細(xì)胞分3組同1.4，處理24 h后收集細(xì)胞，加入裂解液，冰浴中放置30 min，4℃離心10 min，收集上清液備用。上清液中按4 ∶1加入5×SDS凝膠加樣緩沖液，100℃孵育10 min。10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，12 V恒壓半干轉(zhuǎn)膜40 min后，麗春紅染色5 min觀察轉(zhuǎn)膜情況。5%脫脂牛奶封閉2 h，按1 ∶ 500加入兔抗人ABCA1 一抗，4℃孵育12 h，TBST 洗3次，1 ∶1 000加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗兔二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，用Tanon 5500免疫熒光檢測(cè)系統(tǒng)激發(fā)熒光，Tanon軟件攝取圖像并分析結(jié)果。

1.6油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量取出預(yù)置蓋玻片，PBS液洗滌3次，用4%多聚甲醛固定10 min，油紅O染液染色10 min，再用蘇木精染色5 min，10 mL·L-1HCl分色及返藍(lán)，雙蒸水沖洗后甘油明膠封片。倒置顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅染，細(xì)胞核呈藍(lán)染。

1.7高效液相色譜法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量參照文獻(xiàn)方法，收集細(xì)胞，加入生理鹽水200 μL，冰浴中超聲破碎細(xì)胞，用BCA 法測(cè)定蛋白含量后，加入三氯乙酸(6%)沉淀并去除蛋白，取上清進(jìn)行膽固醇檢測(cè)。取100 μL上清液，加入氫氧化鉀溶液(8.9 mol/L) 200 μL，水解膽固醇酯后作為細(xì)胞內(nèi)總膽固醇待測(cè)樣品。將樣品分別與內(nèi)標(biāo)液(豆甾醇)混勻，在用正己烷 ∶異丙醇(3 ∶2 ,V/V)溶液和無水乙醇抽提后真空干燥。上樣前用100 μL乙晴-異丙醇(70 ∶30，V/V) 溶解樣品，采用C-18 柱，溫度為室溫，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長為250 nm，以峰面積定量膽固醇，內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)，以mg·g-1細(xì)胞蛋白為單位。

1.8[3H]法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出細(xì)胞先在正常培養(yǎng)液中和7.4 μGBq×103/L[3H]膽固醇共同孵育24 h，用PBS液洗滌細(xì)胞后置含脂蛋白的無血清培養(yǎng)液中再培養(yǎng)24 h。PBS 液漂洗細(xì)胞3次，加入閃爍液裂解細(xì)胞，用液閃計(jì)數(shù)法檢測(cè)培養(yǎng)液和細(xì)胞中的[3H]膽固醇含量。膽固醇流出率=培養(yǎng)液中cpm+總cpm(培養(yǎng)液cpm+細(xì)胞cpm)×100%。

2　結(jié)果

2.1EGCG對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞毒性的觀察分別用0、12.5、25、50、100 μmol·L-1的EGCG處理THP-1 巨噬細(xì)胞24 h。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與0 μmol·L-1EGCG處理組相比，12.5～100 μmol·L-1EGCG各處理組細(xì)胞活力無明顯差異(Fig 1)，表明100 μmol·L-1濃度內(nèi)的EGCG對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞沒有明顯毒性。本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用12.5、25、50 μmol·L-1的EGCG作為細(xì)胞處理濃度。

Fig 1　Influence of different concentrations of EGCG on THP-1 macrophage viability after treatment 24 hours

2.2EGCG 對(duì)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞miR-33a表達(dá)的影響0、12.5、25、50 μmol·L-1的EGCG處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞24 h，Real time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，25、50 μmol ·L-1的EGCG處理后，細(xì)胞中miR-33a表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)，50 μmol·L-1EGCG處理組下調(diào)最為明顯(Fig 2)。隨后，用50 μmol·L-1的EGCG處理THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞不同時(shí)間，Real time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 h組相比，處理12 h組細(xì)胞miR-33a表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)，處理24 h組細(xì)胞miR-33a表達(dá)下調(diào)更為明顯(Fig 3)。

Fig 2　Influence of different concentrations of EGCG on miR-33a expression of THP-1

*P<0.05vs0 μmol·L-1EGCG treatment group

Fig 3　Influence of 50 μmol·L-1 EGCG on miR-33a expression of THP-1 macrophage-derived foam cells in different time point

*P<0.05vs0 h treatment group

2.3miR-33a在EGCG上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞ABCA1表達(dá)中的作用細(xì)胞隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組、50 μmol·L-1EGCG處理、50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組，處理24 h后，分別提取細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)，采用Real time PCR以及Western blot檢測(cè)。Fig 4和Fig 5結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，50 μmol·L-1EGCG處理組細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)均明顯上調(diào)(P<0.05)；而50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組與50 μmol·L-1EGCG單獨(dú)處理組相比，細(xì)胞ABCA1 mRNA和蛋白質(zhì)均明顯下調(diào)(P<0.05)。這提示使THP-1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞miR-33a過表達(dá)后，EGCG 上調(diào)細(xì)胞ABCA1表達(dá)的作用被明顯抑制。

Fig 4　Influence of miR-33a on EGCG increasing ABCA1 mRNA expression of THP-1 macrophage-derived foam cells

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

Fig 5　Influence of miR-33a on EGCG increasing ABCA1 protein expression of THP-1 macrophage-derived foam cells

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

2.4miR-33a在EGCG減少THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積中的作用油紅O結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，50 μmol·L-1EGCG處理組細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯減少，而加入80 nmol·L-1miR-33a mimic共同處理后，細(xì)胞內(nèi)的紅色脂滴又明顯增多(Fig 6)。HPLC檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，50 μmol·L-1EGCG處理組細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯均明顯減少；而50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic處理組與50 μmol·L-1EGCG單獨(dú)處理組相比，細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇、膽固醇酯的含量則明顯增加(Tab 1)。

Tab 1　Influence of miR-33a on EGCG reducing cholesterol content within THP-1 macrophage-derived foam cells(n=3)

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

Fig 6　Influence of miR-33a on EGCG reducing lipid droplets impact within THP-1 macrophage-derived foam cells

A:Control;B:EGCG;C:EGCG+miR-33a

2.5miR-33a在EGCG促THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫膽固醇流出中的作用Fig 7結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，50 μmol·L-1EGCG處理使細(xì)胞膽固醇流出明顯增加(P<0.05)。而加入80 nmol·L-1miR-33a mimic共同處理細(xì)胞后，EGCG促膽固醇流出作用被明顯抑制(P<0.05)。

Fig 7　Influence of miR-33a on EGCG promoting cholesterol efflux from THP-1 macrophage-derived foam cells

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsEGCG treatment group

3　討論

綠茶是中國傳統(tǒng)的保健養(yǎng)生飲品，茶多酚是綠茶中最主要的生物活性成分，主要由兒茶素、花色素、黃酮類和酚酸類4種物質(zhì)組成[7]。EGCG是茶葉中含量最多的兒茶素，具有多種藥理學(xué)作用，其中就包括抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。EGCG抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的主要機(jī)制包括[7-8]：在腸道內(nèi)和膽固醇形成沉淀物，并抑制腸道內(nèi)酶的作用，二者共同降低腸道膽固醇的吸收；具有較強(qiáng)的抗低密度脂蛋白氧化作用，而氧化低密度脂蛋白是促使動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵因素。最近有研究[6]報(bào)道EGCG還可以上調(diào)巨噬細(xì)胞ABCA1的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出，抑制巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成，有可能是EGCG抗動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)新機(jī)制。但EGCG調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)的分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡釋。

miRNA與mRNA結(jié)合后誘導(dǎo)后者降解是新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)基因表達(dá)的重要分子機(jī)制，miRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)是機(jī)體內(nèi)一個(gè)廣泛存在的基因表達(dá)調(diào)控方式，涉及到諸多生理過程和病理過程。其中miRNA調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)是目前脂質(zhì)代謝研究領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。目前已知參與脂質(zhì)代謝基因表達(dá)調(diào)控的miRNAs包括miR-33、miR-122、miR-27a、miR-27b、miR-144和miR-370等，靶基因包括ABCA1、NPC1、ABCG1、SREBP和PPARγ等[9]。其中miRNA33通過調(diào)控ABCA1表達(dá)，影響膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。

miRNA在調(diào)節(jié)別的基因表達(dá)的同時(shí)，其自身的產(chǎn)生也受到內(nèi)源性和外源性因素的調(diào)控。近來，一些天然化合物如姜黃素、白藜蘆醇、異黃酮、番茄素和EGCG等[10]被報(bào)道能夠調(diào)節(jié)miRNAs的表達(dá)。其中包括EGCG通過調(diào)節(jié)miRNA16進(jìn)而調(diào)節(jié)Bcl-1抑制細(xì)胞凋亡，但未見EGCG對(duì)miRNA33a表達(dá)調(diào)節(jié)的報(bào)道，EGCG是否是通過調(diào)控miRNA 33a，進(jìn)而調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用呢？

我們的研究表明，在不影響細(xì)胞活性狀況下，EGCG呈濃度和時(shí)間依賴性下調(diào)miRNA33a表達(dá)，EGCG能明顯上調(diào)ABCA1 mRNA 和蛋白的表達(dá)，且這種上調(diào)作用能被過表達(dá)miRNA33a所弱化，表明EGCG確實(shí)可通過抑制miRNA33a的生成上調(diào)ABCA1表達(dá)。進(jìn)一步的研究證實(shí)，EGCG可減少THP-1 巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中的脂質(zhì)蓄積，且這種作用也可被細(xì)胞中轉(zhuǎn)入過量miRNA33a所弱化。細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出實(shí)驗(yàn)證明，EGCG減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇蓄積是與其促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出有關(guān)，細(xì)胞中轉(zhuǎn)入過量miRNA33a可以抑制膽固醇流出。這和上述的EGCG促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出關(guān)鍵蛋白ABCA1表達(dá)相一致。

綜上所述，我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG是通過減少miRNA33a的生成，進(jìn)而上調(diào)ABCA1表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞中膽固醇流出，這可能是EGCG抗動(dòng)脈粥樣硬化作用的分子機(jī)制。但很顯然，EGCG是否還可以通過調(diào)節(jié)其它miRNAs的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)ABCA1表達(dá)，影響巨噬細(xì)胞膽固醇代謝有待進(jìn)一步研究。

(致謝:本文部分工作在南華大學(xué)心血管疾病研究所完成，特此感謝！)

[1]Rayner K J, Suarez Y, Davalos A, et al. MiR-33 contributes to the regulation of cholesterol homeostasis[J].Science,2010, 328(5985): 1570-3.

[2]Mao M, Lei H, Liu Q, et al. Effects of miR-33a-5P on ABCA1/G1-mediated cholesterol efflux under inflammatory stress in THP-1 macrophages[J].PLoSOne，2014, 9(10):e109722.

[3]魏芳，劉浩，張配，等.EGCG對(duì)三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB231的增殖抑制作用及機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2013，29(5)：280-4.

[3]Wei F，Liu H，Zhang P, et al. The inhibitory action of EGCG on the proliferation in the triple-negative breast cancer cell MDA-MB231 and its mechanism[J].ChinPharmacolBull, 2013 , 29(5):280-4.

[4]Hong Z, Xu Y, Yin J F, et al. Improving the effectiveness of (-)-epigallocatechin gallate(EGCG) against rabbit atherosclerosis by EGCG-loaded nanoparticles prepared from chitosan and polyaspartic acid[J].JAgricFoodChem,2014，62(52):12603-9.

[5]Xu X, Pan J, Zhou X.Amelioration of lipid profile and level of antioxidant activities by epigallocatechin-gallate in a rat model of atherogenesis[J].HeartLungCirc,2014,23(12):1194-201.

[6]Jiang J, Mo Z C, Yin K, et al. Epigallocatechin-3-gallate prevents TNF-α-induced NF-κB activation thereby upregulating ABCA1 via the Nrf2/Keap1 pathway in macrophage foam cells[J].IntJMolMed,2012,29(5):946-56.

[7]葛建，林芳，李明揆，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)生物活性研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，38(2)：156-63.

[7]Ge J, Lin F, Li M K, et al. Research progress on biological activity of epigallocatechin-3-gallate(EGCG)[J].JAnhuiAgricUniver, 2011,38(2):156-63.

[8]唐偉軍，陳美芳，江俊麟，等.表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用[J].中國動(dòng)脈硬化雜志，2006，14(1)：21-4.

[8]Tang W J, Chen M F, Jiang J L, et al. Epigallocatechin gallate preventing low density lipoprotein-induced endothelial dysfunction[J].ChinJArterioscler, 2006,14(1):21-4.

[9]Novák J,Bienertová-Va?kü J,Kára T,NoVák M.MicroRNAs involved in the lipid metabolism and their possible implications for atherosclerosis development and treatment[J].MediatorsInflamm,2014,2014:275867.

[10]Li Y, Kong D, Wang Z, et al. Regulation of microRNAs by natural agents: an emerging field in chemoprevention and chemotherapy research[J].PharmRes,2010;27(6):1027-41.

EGCG upregulated ABCA1 expression by decreasing miR-33a generation to reduce lipid accumulation of macrophage-derived foam cells

YANG Hong-xia1，GAO Ya2, JIANG Heng-bo1,Liu Lu-shan2

(1.HunanYongzhouVocationalTechnicalCollege，YongzhouHunan425000,China;2.InstituteofCardiovascularDiseases,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China)

AimTo investigate whether EGCG regulates ABCA1 expression by influencing the expression of miR-33a to promote cholesterol efflux from macrophages.MethodsTHP-1 macrophage-derived foam cells were established by co-incubated with oxLDL, and then treated with EGCG, and miR-33a expression was detected with Real-time PCR. THP-1 macrophage-derived foam cells were randomly divided into the following groups: control group, 50 μmol·L-1EGCG treatment group, 50 μmol·L-1EGCG+80 nmol·L-1miR-33a mimic treated group. Real-time PCR and Werstern blot was used to detect ABCA1 mRNA and protein expression, Oil Red O staining and high performance liquid chromatography were used to detect intracellular lipid content, and [3H] assay was used to determine cellular cholesterol efflux.ResultsEGCG could downregulate miRNA33a expression in a dose-and time-dependent fashion within safe doses. EGCG significantly upregulated ABCA1 mRNA and protein expression, which could be inhibited after miRNA33 mimic transfected into cells, however. EGCG may reduce lipid accumulation in THP-1 macrophage-derived

ABCA1; microRNA; macrophage; EGCG; foam cell; lipid metabolism

2016-04-10,

2016-06-12

生物流變科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金課題(No CQKLBST-2014-002)

楊紅霞(1980-)，女，碩士，副教授，研究方向:心血管藥理，E-mail:13574696288@163.com;

高亞(1990-)，女，碩士生，研究方向:心血管疾病發(fā)病機(jī)制與防治;

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.018

A

1001-1978(2016)09-1279-06

R282.71；R329.24；R342.22；R344.81；R543.5

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-23 14:29:00網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.036.html

劉錄山(1974-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:心血管疾病發(fā)病機(jī)制與防治，E-mail:liuls2000@163.com

foam cells, and this effect could also be weakened after miRNA33 mimic transfected. EGCG could reduce the accumulation of intracellular cholesterol,which was related with EGCG promoting intracellular cholesterol efflux, and excess miRNA33a transfected into cells could inhibit intracellular cholesterol efflux.ConclusionEGCG may upregulate ABCA1 expression by reducing miRNA33a generation, resulting in the promotion of cholesterol efflux from macrophages, which may be one of the molecular mechanisms of EGCG anti-atherosclerotic effect.