李　芹，王　剛，鄧存良

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染科(瀘州　646000)

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胰島素和高糖對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響*

李芹，王剛，鄧存良△

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 感染科(瀘州646000)

目的探討胰島素和高糖對(duì)肝纖維化的影響。方法體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)，分為正常對(duì)照組、高滲透壓對(duì)照組、高糖組、(低、中、高)胰島素組、高糖+(低、中、高)胰島素組。細(xì)胞培養(yǎng)24 h和48 h，用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8法)檢測HSC的增殖情況，并計(jì)算細(xì)胞增殖率；細(xì)胞培養(yǎng)48 h，用免疫印跡法檢測HSC NF-κB p65蛋白表達(dá)。結(jié)果培養(yǎng)24 h，各組HSC增殖率與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)48 h，高、中胰島素組HSC增殖率明顯高于正常對(duì)照組和高滲透壓對(duì)照組(P<0.05)；高糖組、(低、中、高)胰島素組、高糖+(低、中、高)胰島素組HSC p65蛋白表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組及高滲透壓對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論胰島素能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠HSC增殖，其機(jī)制可能與p65蛋白表達(dá)增加有關(guān)。

胰島素；高糖；肝纖維化；肝星狀細(xì)胞；p65

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是常見的以葡萄糖和脂肪代謝紊亂、血漿葡萄糖水平增高為特征的代謝性疾病，臨床以2型糖尿病居多。糖尿病患者的生活質(zhì)量與糖尿病的各種并發(fā)癥密切相關(guān)。高血糖作為糖尿病的重要表現(xiàn)，被認(rèn)為是引起糖尿病并發(fā)癥的主要原因，其與肝纖維化的關(guān)系已成研究熱點(diǎn)[1]。研究[2]表明，機(jī)體血糖含量與肝纖維化程度呈正相關(guān)，高血糖是非酒精性肝病的主要危險(xiǎn)因素。因此，探索糖尿病性肝纖維化的發(fā)生途徑具有重要臨床意義。研究[3]發(fā)現(xiàn)，肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)是導(dǎo)致肝纖維化的主要細(xì)胞，其激活、增殖被認(rèn)為是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。高血糖及高胰島素血癥是2型糖尿病的重要特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究高糖及高胰島素與肝纖維化的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)以不同濃度胰島素加高糖及單純不同濃度胰島素作用于HSC，檢測NF-κB信號(hào)通路中的p65蛋白表達(dá)量變化，以探討糖尿病性肝纖維化的發(fā)生機(jī)制。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)試劑

大鼠HSC(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室)；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)；小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(美國CST 公司)；兔抗大鼠NF-κB p65 單克隆抗體(美國Epitomics公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

Model 680酶標(biāo)儀、紫外凝膠成像儀、濕轉(zhuǎn)儀和Mini-P3垂直電泳儀均為美國Bio-rad公司生產(chǎn)。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

共9組，分別為：25 mmol/L甘露醇組作為高滲透壓對(duì)照組；5.6 mmol/L葡萄糖組作為正常對(duì)照組；高糖組(25 mmol/L)；(低、中、高)濃度胰島素組：5.6 mmol/L葡萄糖+胰島素(10-9、10-8、 10-6mol/L)； 高糖(25 mmol/L)+(低、中、高)胰島素組(10-9、10-8、 10-6mol/L)。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇成功的大鼠HSC，正常糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至70%融合，胰酶消化，培養(yǎng)基終止消化，接種于96孔平底培養(yǎng)板，培養(yǎng) 12 h，細(xì)胞同步于 G0期。棄上清，按組加干預(yù)物(7復(fù)孔/組)各100 μl，分別作用24、48 h。

1.5HSC吸光度值的測定

培養(yǎng)24、48 h后，去培養(yǎng)基，每孔加CCK-8液10 μL，以加培養(yǎng)液的空白孔調(diào)零，繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h。酶標(biāo)儀測波長為450 nm的吸光度值(OD值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。繪制生長曲線圖。計(jì)算各組細(xì)胞的增殖率。細(xì)胞增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.6HSC NF-κB p65蛋白量測定

分組培養(yǎng)48 h后，用冷PBS液沖洗培養(yǎng)瓶2次， 用細(xì)胞刮使細(xì)胞脫落，形成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)細(xì)胞，6 500轉(zhuǎn)/min離心15 min，離心半徑5 cm，棄上清，留細(xì)胞沉淀，應(yīng)用免疫印跡法測蛋白量，按細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞總蛋白，-70 ℃保存。按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，配制成6.12 mL BCA工作液，將樣品加入96孔板，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20 μL。各孔加200 μL BCA工作液，37 ℃靜置30 min。選562 nm波長測OD值。據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(r>0.99)計(jì)算蛋白濃度。按SDS-PAGE試劑盒配制凝膠兩塊，蛋白電泳后，1塊用于考馬斯亮藍(lán)染色，另1塊用于轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)。將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜漂洗4次，封閉1 h。然后一抗孵育過夜，再二抗孵育1 h，再洗膜4次， 鑷子夾膜的一角，下緣用吸水濾紙吸出膜上的TBST溶液，將PVDF膜置于滴有發(fā)光試劑的保鮮膜上，孵育5 min，將PVDF膜置于紫外凝膠成像儀，系統(tǒng)自動(dòng)顯影曝光，掃描，軟件分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖率

經(jīng)兩因素重復(fù)方差分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h(F=0.261，P=0.982)和48 h(F=0.192，P=0.695)，高糖和胰島素之間均無交互作用。培養(yǎng)24 h，各組HSC增殖率與正常對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；培養(yǎng)48 h，高、中胰島素組HSC增殖率明顯高于正常對(duì)照組和高滲透壓對(duì)照組(P<0.05)(圖1)。

2.2NF-κB p65蛋白表達(dá)量

培養(yǎng)48 h，經(jīng)兩因素重復(fù)方差分析發(fā)現(xiàn)，高糖和胰島素之間無交互作用(F=2.044，P=0.937)，高糖組、(低、中、高)胰島素組、高糖+(低、中、高)胰島素組HSC p65蛋白表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組及高滲透壓對(duì)照組(P<0.05)(圖2和圖3)。

圖1胰島素和高糖對(duì)HSC增殖的影響

注：*與正常對(duì)照組和高滲透壓組比較，P<0.05

圖2培養(yǎng)48 h HSC p65蛋白表達(dá)電泳圖

注：1：正常對(duì)照組；2：高糖組；3：高胰島素組；4：高糖+高胰島素組；5：中胰島素組；6：高糖+中胰島素組；7：低胰島素組；8：高糖+低胰島素組；9：高滲透壓對(duì)照組

圖3培養(yǎng)48 h HSC p65蛋白表達(dá)相對(duì)量

注：*與正常對(duì)照組和高滲透壓組比較，P<0.05

3　討論

我國糖尿病患病率呈逐年遞增趨勢，目前患病人數(shù)已躍居世界第一[4]。與糖尿病相關(guān)的各種并發(fā)癥的患病人數(shù)也相應(yīng)增加，特別是糖尿病性肝病逐漸引起臨床重視。糖尿病以2型糖尿病居多，多數(shù)患者存在胰島素抵抗，高糖及高胰島素血癥在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具重要作用。研究[5-6]表明，高血糖能促進(jìn)肝纖維化發(fā)生，加重肝纖維化程度，且患者血糖含量與肝纖維化程度呈正相關(guān)，高糖是非酒精性肝病的重要危險(xiǎn)因素。但本研究發(fā)現(xiàn)，高糖對(duì)HSC增殖無明顯影響，而胰島素可促進(jìn)HSC增殖。

有關(guān)糖尿病致肝纖維化的機(jī)制，目前尚不清楚，相關(guān)研究主要圍繞HSC活化和增殖進(jìn)行。研究[7-8]表明，HSC在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。 NF-κB具有多向性調(diào)節(jié)作用，可阻止HSC凋亡和促進(jìn)HSC增殖，從而加速炎癥反應(yīng)，促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。 NF-κB有多種形式，但發(fā)揮主要作用的是由p50和p65組成的異源二聚體，故本研究選擇p65蛋白進(jìn)行觀察。在2型糖尿病和肝源性糖尿病中大多存在胰島素抵抗，高血糖和高胰島素血癥成為糖尿病性肝病的重要特點(diǎn)[9]。胰島素對(duì)HSC生長的影響已有少量報(bào)道，常遠(yuǎn)鴻等[10]研究發(fā)現(xiàn)，胰島素能促進(jìn)HSC增殖，故本研究做了高糖加高胰島素作用于HSC的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)48 h，高糖組、(低、中、高)胰島素組、高糖+(低、中、高)胰島素組HSC p65蛋白表達(dá)量均明顯高于正常對(duì)照組及高滲透壓對(duì)照組(P<0.05)，表明高糖與胰島素均

能刺激HSC p65蛋白表達(dá)增加，HSC的增殖可能與p65蛋白表達(dá)增加有關(guān)。本研究還表明，胰島素能激活HSC，且這種激活呈濃度依賴性。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，高糖對(duì)HSC增殖無明顯影響，而胰島素可促進(jìn)HSC增殖，高糖與胰島素均能促進(jìn)HSC p65蛋白表達(dá)，HSC的增殖可能與p65蛋白表達(dá)增加有關(guān)。

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The Effect of Insulin and High Glucose on Proliferation of Hepatic Stellate Cell in Rats and Expression of Protein p65

LiQin,WangGang,DengCunLiang△.

DepartmentofInfectiousDiseases，TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China

ObjectiveTo investigate the effect of insulin and high glucose on hepatic fibrosis. Methods Hepatic stellate cells (HSC) of rats were cultured in vitro and divided into five groups including the normal control group, the hyperosmosis control group, the high glucose group, the insulin groups of low, intermediate, and high doses respectively, and the mixed groups of high glucose and insulin of low, intermediate, and high doses respectively. Cell counting kit CCK-8 was applied to measure the proliferation of HSC after the cells were cultured for 24 and 48 hours respectively and count their proliferation rate. Western blotting was used to detect the HSC protein p65 in each group after the cells were cultured for 48 hours. ResultsThe proliferation rate of HSC in the normal control group after 24 hours was not significantly different from that in the other groups respectively (P>0.05). The proliferation rates in the insulin groups of high and intermediate doses were significantly higher after 48 hours than in the normal control group and the hyperosmosis control group (P<0.05). The expression levels of HSC p65 protein in the high glucose group, the insulin groups of low, intermediate, and high doses respectively, and the mixed groups of high glucose and insulin of low, intermediate, and high doses respectively were significantly higher than those in the normal control group and the hyperosmosis control group (P<0.05). ConclusionInsulin can induce the HSC proliferation in rats in vitro, which may be correlated with the expression increase of Protein p65.

Insulin; High glucose; Hepatic fibrosis; Hepatic stellate cell; p65

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.003

四川省科技廳資助項(xiàng)目(No:2014TSX-0036)

鄧存良， E-mail：dengcunl64@vip.sina.com

R587.1

A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160825.0835.028.html