楊　明，楊　茜，單明慧，周紅利，蘇炳銀，李淑蓉△

1.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都　610500)；2.發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (成都　610500)

?

·論著·

白藜蘆醇在PD小鼠模型中對TLR3/TRIF信號通路及腦內(nèi)炎癥微環(huán)境的影響*

楊明1，楊茜1，單明慧1，周紅利2，蘇炳銀2，李淑蓉1△

1.成都醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室(成都610500)；2.發(fā)育與再生四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (成都610500)

目的建立1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP) 誘導(dǎo)的小鼠PD模型，探究白藜蘆醇(resveratrol,Res)對PD小鼠TLR3/TRIF信號通路及中腦黑質(zhì)炎癥微環(huán)境的影響。方法雄性C57/BL6小鼠30只， 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、MPTP組和MPTP+Res組，每組各10只。對照組腹腔注射相同體積生理鹽水；MPTP組腹腔注射生理鹽水新鮮配制的MPTP 30 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d，結(jié)束注射7 d后取材；MPTP+Res組： Res用乙醇溶解為50 mg/mL，用PBS以1∶4的體積比進(jìn)行稀釋，連續(xù)注射MPTP 7 d后，腹腔注射Res 28 d，結(jié)束注射7 d后取材。采用免疫組化及免疫熒光分別觀察小鼠中腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的變化及小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測中腦黑質(zhì)相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)。結(jié)果免疫組化結(jié)果顯示：與MPTP組相比，MPTP+Res組小鼠中腦黑質(zhì)TH標(biāo)記的多巴胺能神經(jīng)元的數(shù)量及形態(tài)未發(fā)生明顯變化；CD11b標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體相對變小，呈圓形及橢圓形，突起減少，變細(xì)、變長；而GFAP標(biāo)記的星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體變小，胞體呈圓形，突起變短。qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與MPTP組相比，MPTP+Res組小鼠中腦黑質(zhì)部位TLR3、IFN-β的mRNA表達(dá)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但TRIF的mRNA表達(dá)量未見明顯變化，促炎因子iNOS、TNF-α的mRNA表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而抗炎因子Arg-1的mRNA表達(dá)量明顯增加。結(jié)論Res可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及激活TLR3/TRIF信號通路，降低中腦黑質(zhì)的促炎因子的釋放，從而改善MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型中的炎癥微環(huán)境。

TLR3/TRIF信號通路；白藜蘆醇；小膠質(zhì)細(xì)胞；炎癥表型；星形膠質(zhì)細(xì)胞；多巴胺能神經(jīng)元

帕金森病(Parkinson′s disease, PD)是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其主要病變特征是黑質(zhì)致密部多巴胺(DA)神經(jīng)元變性缺失，使通過黑質(zhì)紋狀體束作用于紋狀體的DA減少，造成紋狀體內(nèi)DA和乙酰膽堿遞質(zhì)平衡失調(diào)而發(fā)病[1]。主要臨床表現(xiàn)為運(yùn)動遲緩、靜止性震顫和肌強(qiáng)直等癥狀。盡管PD病變部位明確、局限，但其病因及發(fā)病機(jī)制迄今未明，尚無有效的根治方法。近年來研究[2]表明，炎癥反應(yīng)在PD發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用。白藜蘆醇(resveratrol, Res)是一種非黃酮類多酚化合物[3]，在植物界廣泛分布。研究[4]表明，Res對炎癥的發(fā)生發(fā)展以及相關(guān)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生均有一定的抑制作用。Chen等[5]研究發(fā)現(xiàn)，Res對機(jī)體免疫系統(tǒng)有調(diào)控作用，認(rèn)為其對巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等釋放炎癥介質(zhì)有強(qiáng)烈的抑制作用，且體內(nèi)抗炎實(shí)驗(yàn)亦表現(xiàn)出一定的功效。樸花子等[6]研究表明，Res對脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一氧化氮和腫瘤壞死因子-α有一定的抑制作用，從而對急性腦缺血發(fā)作后的神經(jīng)功能起到一定的保護(hù)作用。本研究擬探討Res在1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)動物模型中抑制炎癥因子的釋放，并通過影響小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞對多巴胺神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用的可行性，為PD的預(yù)防及臨床治療提供線索。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組

雄性C57/BL6小鼠30只，3～4月齡，體質(zhì)量22～25 g，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、MPTP組和MPTP+Res組，每組各10只。對照組：腹腔注射相同體積生理鹽水；MPTP組：腹腔注射生理鹽水新鮮配制的MPTP 30 mg/(kg·d)，連續(xù)7 d，結(jié)束注射7 d后取材。MPTP+Res組： Res用乙醇溶解為50 mg/mL， 用PBS以1∶4的體積比進(jìn)行稀釋，注射劑量25 mg/(kg·d)，采用連續(xù)注射MPTP 7 d后連續(xù)腹腔注射Res 28 d，結(jié)束注射7 d后取材。

1.2試劑和設(shè)備

MPTP(美國Sigma公司)、Res(美國Sigma公司)、兔抗TH多克隆抗體(美國Millipore公司)、兔抗CD11b單克隆抗體(英國Abcam公司)、小鼠抗GFAP單克隆抗體(英國Abcam公司)、熒光二抗(美國Life Technologies公司)、Reverse Transcription System試劑盒(美國Promega公司)、FastStar Universal SYBR Green Master(ROX) (瑞士Roche公司)、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)、PCR儀(美國BioRad公司)、冰凍切片機(jī)(德國LEICA公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3動物取材及切片

小鼠經(jīng)4%水合氯醛腹腔麻醉，0.9%生理鹽水50～100 mL灌注，待從右心耳流出的液體清澈時(shí)，更換4%多聚甲醛溶液100 mL進(jìn)行灌注，小鼠全身僵硬時(shí)灌注成功。在冰盒上分離取出腦組織，用4%多聚甲醛后固定過夜，再放入30%蔗糖溶液中至腦組織沉底。腦組織經(jīng)OCT包埋，取中腦黑質(zhì)部冰凍切片(片厚20 μm)，放在含4%多聚甲醛溶液的小皿內(nèi)備用。

1.4免疫組化染色觀察

免疫組化染色按常規(guī)方法，一抗分別用兔抗TH多克隆抗體、兔抗CD11b單克隆抗體、小鼠抗GFAP單克隆抗體，硫酸鎳銨-DAB顯色法顯色，透明、封片，鏡下觀察多巴胺能神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.5RT-PCR測定

采用頸椎脫臼法處死動物, 在冰盒上操作, 迅速斷頭取腦，在體視顯微鏡下分離中腦黑質(zhì)，盡量除去黑質(zhì)外的部分，迅速放入有液氮的碾缽中碾碎標(biāo)本，用TRIZOL 法抽提總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。按羅氏試劑盒說明書，采用RT-PCR測定相關(guān)炎癥因子的mRNA水平。

2　結(jié)果

2.1MPTP小鼠模型及Res處理小鼠TH的表達(dá)

TH免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組多巴胺能神經(jīng)元突起分布密集，著色較深(圖1A)。 MPTP組多巴胺能神經(jīng)元較對照組數(shù)量明顯減少，殘存神經(jīng)元形態(tài)不一，軸突變短、少，部分殘存神經(jīng)元萎縮，細(xì)胞核縮小，染色分布不均(圖1B)。MPTP+Res組小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量較MPTP組無明顯變化(圖1C)。

2.2星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP的表達(dá)

中腦黑質(zhì)GFAP免疫組化結(jié)果顯示，對照組中星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)正常，密度相對稀少，胞體相對較小，突起分支較細(xì)、較少，GFAP染色相對較淡(圖2A)。MPTP組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，突起相對變短，呈現(xiàn)明顯活化狀態(tài)(圖2B)。MPTP+Res組與MPTP組相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，突起變短， 胞體變小、變圓，趨向于靜息狀態(tài)(圖2C)。

2.3小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b的表達(dá)

中腦黑質(zhì)CD11b免疫組化結(jié)果顯示，對照組中小膠質(zhì)細(xì)胞胞體較小，突起相對較小，染色相對淡染，呈現(xiàn)靜息狀態(tài)(圖3A)。MPTP組中小膠質(zhì)細(xì)胞活化明顯，胞體肥大，染色加深，突起增多、增粗(圖3B)。與MPTP組相比，MPTP+Res組中小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，胞體變小，突起相對變細(xì)減少，染色變淺，趨向于靜息狀態(tài)(圖3C)。

圖1免疫熒光染色檢測TH免疫陽性產(chǎn)物在中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá)(Scar bar=200 um)

注：圖A：對照組中小鼠中腦黑質(zhì)免疫熒光TH染色，多巴胺能神經(jīng)元呈紅色帶狀密集分布，突起分布密集，著色較深；圖B：MPTP組小鼠中腦黑質(zhì)免疫熒光TH染色，較對照組多巴胺神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，殘存神經(jīng)元形態(tài)不一，軸突變短、少，部分殘存神經(jīng)元萎縮，細(xì)胞核縮小，染色分布不均；圖C：MPTP+Res組小鼠中腦黑質(zhì)免疫熒光TH染色，較MPTP組多巴胺能神經(jīng)元無明顯變化

圖2GFAP免疫組化檢測中腦黑質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞(Scar bar=50 um)

注：圖A：靜息狀態(tài)下的星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)目較少，且胞體呈線形、梭形等，突起細(xì)長；圖B：注射MPTP后活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加，胞體呈圓形或橢圓形，染色加深，突起增多，變短、變粗；圖C：先注射MPTP后注射Res的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目相對減少，突起減少，染色變淡

圖3CD11b免疫組化檢測中腦黑質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞 (Scar bar=50 um)

注： 圖A：靜息狀態(tài)下的小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體較小，突起較長；圖B：注射MPTP后活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體明顯增大，染色加深，突起增多、增粗；圖C：先注射MPTP后注射Res的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量變少，胞體變小，突起相對變少、變長

2.4Res對TLR3/TRIF信號通路及相關(guān)炎癥因子的作用

中腦黑質(zhì)qPCR結(jié)果顯示，與對照組相比，MPTP組中促炎因子iNOS、TNF-α以及TLR3/TRIF信號通路相關(guān)蛋白TLR3、TRIF和IFN-β的mRNA表達(dá)水平均明顯升高。而抑炎因子Arg1 的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。MPTP+Res組中促炎因子iNOS、TNFα的mRNA表達(dá)水平均降低，而抑炎因子Arg1的mRNA表達(dá)水平相對升高，TLR3、IFN-β的mRNA表達(dá)水平均增高，而TRIF的mRNA表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4)。

圖4Res對MPTP誘導(dǎo)小鼠模型中SNpc炎癥因子表達(dá)水平的影響

注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;圖A-E中注射Res后促炎因子iNOS，TNF-α有明顯的抑制作用，對抑炎因子Arg1有升高作用，而促炎IL-1β、抑炎因子IL-10無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；圖F-H中，注射Res后TLR3、IFN-β表達(dá)水平增高，而TRIF表達(dá)水平無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3　討論

PD由多種因素共同作用而引起，近年研究[7]證實(shí)，神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)也參與了PD的發(fā)病。而小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)炎癥反應(yīng)具有重要調(diào)控作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活對神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，從而引起損傷。研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞可通過多種途徑被激活，MPTP可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元損傷。McGeer 等[8]對PD患者尸檢發(fā)現(xiàn)，黑質(zhì)致密部激活的小膠質(zhì)細(xì)胞聚集在Lewy小體周圍。同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞也參與MPTP導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷及炎癥反應(yīng)，MPTP引起PD損傷過程中，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過其細(xì)胞膜表面的單胺氧化酶-B(MAO-B)，把MPTP轉(zhuǎn)化為有毒的1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)，后者被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元[9]，進(jìn)而阻止線粒體膜蛋白復(fù)合物Ⅰ的電子傳遞，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的死亡[10]。PD等退行性疾病的炎癥反應(yīng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞激活相對小膠質(zhì)細(xì)胞較弱，其激活后產(chǎn)生的炎癥因子也較小膠質(zhì)細(xì)胞少，且星形膠質(zhì)細(xì)胞多在小膠質(zhì)細(xì)胞激活后繼發(fā)活化[11]。星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活后可產(chǎn)生TNF-α、IL-6、NO、IL-1β 等致炎因子。這些致炎因子以不同途徑啟動細(xì)胞內(nèi)某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致DA能神經(jīng)元的死亡[12]。

本研究結(jié)果表明，Res干預(yù)對于小鼠中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的形態(tài)及數(shù)量無明顯影響。但是，MPTP+Res組與MPTP組相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少，胞體變小，突起變短變細(xì)，向靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變；小膠質(zhì)細(xì)胞從MPTP誘導(dǎo)的活化狀態(tài)向靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變，即細(xì)胞數(shù)量減少，胞體變小，染色變淡，突起減少。說明MPTP誘導(dǎo)的損傷過程中，Res可促使星形膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞由活化狀態(tài)向靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變，可能改變PD的炎癥微環(huán)境。

此外，相關(guān)炎癥因子mRNA的檢測結(jié)果表明，Res對PD小鼠中促炎因子iNOS、TNF-α有明顯的抑制作用，而對抑炎因子Arg1的產(chǎn)生有一定的促進(jìn)作用。已有研究[12]認(rèn)為Res對炎癥的發(fā)生發(fā)展以及炎癥因子的釋放均有明顯的抑制作用。Machado等[13]研究表明，iNOS基因敲除的小鼠能夠降低黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元對MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷的敏感性，并且在MPTP小鼠模型中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶抑制劑能夠在較大程度上逆轉(zhuǎn)多巴胺能神經(jīng)元的死亡[14]。本研究與已有研究結(jié)果一致，這種作用的產(chǎn)生可能與TLR3/TRIF信號通路相關(guān)。本研究證實(shí)，Res可改變MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)微環(huán)境，并且此種作用可能是通過激活TLR3/ TRIF信號通路而引發(fā)的。

總之，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測Res可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化及激活TLR3/TRIF信號通路，降低促炎因子在腦組織中的表達(dá)，對星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥刺激減弱，使星形膠質(zhì)細(xì)胞也向靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變，形成一個(gè)良性循環(huán)，整體上降低局部腦組織的炎癥微環(huán)境。但是，Res抑制PD炎癥反應(yīng)的具體作用靶點(diǎn)需要進(jìn)一步探討。本研究提示Res可以作為一種有效的PD抗炎思路，為PD的治療及預(yù)防提供一個(gè)新的視角。

[1]Dexter DT, Jenner P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2013, 62: 132-144.

[2]Prinz M, Priller J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease[J]. Nature Reviews Neuroscience, 2014, 15(5): 300-312.

[3]Cookson MR.The biochemistry of Parkinson′s disease [J].Annu Rev Biochem, 2005,74:29-52.

[4]Shao W, Zhang S, Tang M,etal. Suppression of neuroinflammation by astrocytic dopamine D2 receptors via αB-crystallin[J]. Nature, 2013, 494(7435): 90-94.

[5]Chen G, Liu W, Li J,etal. Novel 1,2-diphenylethene derivatives for treatment of immune diseases: US2004010 2517A1[P]. 2004-01-17.

[6]樸花子, 張成鎬,樸日龍.白藜蘆醇對脂多糖誘導(dǎo)一氧化氮和腫瘤壞死因子生成的影響[J].中藥藥理與臨床,2006,22(5):12-14.

[7]Bruttger J, Karram K, W?rtge S,etal. Genetic cell ablation reveals clusters of local self-renewing microglia in the mammalian central nervous system[J]. Immunity, 2015, 43(1): 92-106.

[8]McGeer PL, McGeer EG.Glial reactions in Parkinson′ s disease [J]. Mov Disord,2008, 23(4): 474-483.

[9]Biber K, Müller T, Boddeke E,etal. Central nervous system myeloid cells as drug targets: current status and translational challenges[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2016, 15(2): 110-124.

[10] Liu B, Hong JS. Role of microglia in inflammation-mediated neurodegenerative diseases: mechanisms and strategies for therapeutic intervention[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2003, 304(1): 1-7.

[11] Sekar A, Bialas AR, de Rivera H,etal. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4[J]. Nature, 2016, 530(7589): 177-183.

[12] Wolter F, Ulrich S, Stein J. Molecular mechanisms of the chemopreventive effects of resveratrol and its analogs in colorectal cancer: key role of polyamines?[J]. The Journal of Nutrition, 2004, 134(12): 3219-3222.

[13] Machado CJ, Whitaker AM, Smith SE,etal. Maternal immune activation in nonhuman primates alters social attention in juvenile offspring[J]. Biological Psychiatry, 2015, 77(9): 823-832.

[14] Spillantini MG, Schmidt ML, Lee VM,etal. α-Synuclein in Lewy bodies[J]. Nature, 1997, 388(6645): 839-840.

The Effect of Resveratrol on TLR3/TRIF Signaling Pathway and Cerebral Inflammatory Microenvironment in the Brain of PD Mice

YangMing1,YangXi1,ShanMinghui1,ZhouHongli2,SuBingyin2,LiShurong1△.

1.DepartmentofPathologyandPathophysiology,ChengduMedicalCollege,Chengdu610500,China; 2.KeyLaboratoryofDevelopmentandRegenerationofSichuanProvince,Chengdu610500,China

ObjectiveTo construct the animal model of PD mice induced by MPTP and explore the effect of resveratrol on the TLR3/TRIF signaling pathway and the inflammatory microenvironment of the midbrain substantia nigra in PD mice. Methods30 male C57/BL6 mice were divided into the control group, MPTP group and MPTP+Res group in accordance with the random number table, and each group consists of 10 mice. The rats of the control group received 30 mg/kg normal saline daily by intraperitoneal injection, those of MPTP group were administered with the same amount of MPTP daily in the same way for 7 days in succession, and those of MPTP+Res group were injected with MPTP for 7 days in succession and then they were injected with resveratrol for 28 days in succession. Immunohistochemistry and immunofluorescence were adopted to observe the changes of dopaminergic neurons in the substantia nigra, the microglial cells and the activation state of astrocytes. Real-time fluorescence quantitative PCR technique was used to detect the mRNA expression of inflammatory factors in the substantia nigra. ResultsFirstly, the immunohistochemistry results showed that the number and morphology of dopamine neurons in the substantia nigra TH in MPTP+Res group did not change significantly, the CD11b labeled microglia cells were relatively small, round and oval while the projections became less, thinner, and longer. The GFAP labeled astrocytes were smaller, the cells were round, and the projections became shorter. Secondly, the results of the qPCR experiment showed that TLR3, IFN β mRNA expressions of midbrain substantia nigra parts in the mice of MPTP+Res group increased significantly (P<0.05), but TRIF mRNA expression was not significantly changed. Proinflammatory factors of iNOS and TNF-α mRNA expression reduced significantly (P<0.05). The mRNA expression increased significantly in the anti-inflammatory factor Arg-1. ConclusionResveratrol may decrease the release of proinflammatory factors in the midbrain substantia nigra and improve the inflammatory microenvironment in MPTP-induced mouse model by inhibiting the activation of microglia and astrocytes and activating TLR3/TRIF signaling pathway.

TLR3/TRIF signaling pathway; Resveratrol; Microglia; Inflammatory phenotype; Astrocytes; Dopaminergic neurons

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.04.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No:31371215；31540032)

李淑蓉，E-mail：lsrsus@163.com

R364；R965

A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.r.20160728.1751.014.html