宋維秀，昂毛吉，朋毛卓瑪

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

西藏沙棘莖尖組織快繁技術(shù)初步研究

宋維秀，昂毛吉，朋毛卓瑪

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

本文以幼嫩莖尖為外植體，對(duì)西藏沙棘進(jìn)行了組織培養(yǎng)成苗技術(shù)研究。結(jié)果表明，西藏沙棘莖尖生長最適宜的基本培養(yǎng)基為1/2 MS；莖尖生長最佳生長調(diào)節(jié)劑濃度配比為：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.l mg/L；蔗糖濃度為2.0 mg/L時(shí)西藏沙棘莖尖生長苗高均值最大，達(dá)到2.82 cm。莖尖在增殖生長過程之中，適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)接周期能改善芽苗枯死現(xiàn)象。轉(zhuǎn)接周期為15 d時(shí)，芽苗枯死率最低為16.33%；當(dāng)轉(zhuǎn)接周期延長至30 d時(shí)，芽苗枯死率明顯升高，達(dá)到52.67%。

西藏沙棘；莖尖；外植體；組織快繁

西藏沙棘（Hippophae thibetana），胡頹子科沙棘屬小灌木，集中分布于青海、西藏、四川等地，具有獨(dú)特經(jīng)濟(jì)價(jià)值和水土保持作用的高寒地區(qū)鄉(xiāng)土造林樹種［1］。因其適宜干燥寒冷風(fēng)大的高原氣候特點(diǎn)，一般植株矮小，分布于海拔5 000 m以上高寒地區(qū)的植株高僅6～8 cm，且對(duì)土壤水分要求不嚴(yán)，不僅在潮濕的陰坡有分布，在土壤干旱的小陽坡地也有分布，其水平根系發(fā)達(dá)，萌蘗力強(qiáng)［2］。

西藏沙棘繁育主要通過種子和枝條扦插進(jìn)行繁殖［3］，而有性繁殖難以保持其種性，用無性繁殖技術(shù)通過枝條扦插繁殖成苗率也比較低，且扦插繁育多代后年齡效應(yīng)明顯，易受病毒侵染。這些繁殖技術(shù)都成為西藏沙棘良種繁育推廣的障礙［4-5］。實(shí)踐證明，組織快繁技術(shù)已經(jīng)成為苗木規(guī)?；a(chǎn)、開展基因遺傳育種、保存種質(zhì)資源研究的高效途徑之一［6-7］。迄今為止，西藏沙棘組織快繁技術(shù)國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道，因此對(duì)西藏沙棘進(jìn)行組織快繁技術(shù)研究具有一定的理論與實(shí)踐意義。本文以西藏沙棘莖尖為外植體，研究分析不同培養(yǎng)基種類、蔗糖濃度、生長調(diào)節(jié)劑（6-BA）濃度與生長素（NAA）濃度配比、轉(zhuǎn)接周期等對(duì)莖尖生長的影響，為西藏沙棘組織培養(yǎng)提供一定的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料來源于青海省湟源縣大石崖村，2013 年3月將野生西藏沙棘苗移栽至大田馴化，2013年10月將其移栽至花盆，并置于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)。

1.2 設(shè)計(jì)方法

1.2.1 外植體處理

經(jīng)過盆栽后，選擇西藏沙棘長勢較好的枝條，剪取1～2 cm帶有腋芽的莖尖，放入容器杯中依次用自來水、肥皂水、蒸餾水清洗。沖洗完畢后，將材料置于超凈工作臺(tái)上，接著用70%的酒精消毒10 s，再用0.1%HgC12溶液滅菌5～6 min，最后用無菌水沖洗4～5次。

1.2.2 基本培養(yǎng)條件

參照相關(guān)的文獻(xiàn)資料［8］，各試驗(yàn)中培養(yǎng)溫度均為（25±2）℃，相對(duì)濕度70%～80%，培養(yǎng)基pH值5～6，瓊脂粉2.25 g，每日光照12～14 h，光照強(qiáng)度1 000～5 000 1x，采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每處理15瓶，每瓶接種2～3個(gè)莖尖。

1.2.3 培養(yǎng)基篩選

參照西藏沙棘組織培養(yǎng)技術(shù)，以WPM、1/4MS、1/2MS為基本培養(yǎng)基［5］，每處理接種15瓶，25 d后觀察西藏沙棘嫩莖生長狀況。以西藏沙棘莖尖生長均值為試驗(yàn)指標(biāo)，采用單因素對(duì)比試驗(yàn)，篩選出最適宜于西藏沙棘莖尖生長的培養(yǎng)基。

1.2.4 生長調(diào)節(jié)劑篩選

按西藏沙棘組織培養(yǎng)中比較適宜的生長調(diào)節(jié)劑組合及濃度梯度配比［4］，在篩選出的基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的生長素組合，6-BA設(shè)置4個(gè)水平，分別為：0、0.5、1.0、2.0 mg/L；NAA設(shè)置3個(gè)水平，分別為：0、0.1、0.5 mg/L；20 d后觀察芽苗生長狀況。每處理均為15瓶，每瓶接種3～5個(gè)生長健壯的莖尖，選擇出適宜的6-BA和NAA濃度配比。

1.2.5 蔗糖濃度篩選

蔗糖在植物組織培養(yǎng)基中起到能源物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)劑的作用，在適宜的培養(yǎng)基中加入不同濃度的蔗糖（1.0、2.0、3.0、4.0 mg/L），每種處理接種5～6瓶，20 d后觀察苗高的生長狀況，統(tǒng)計(jì)頂芽增高均值，通過頂芽增高生長的影響，確定最佳的蔗糖濃度。

1.2.6 轉(zhuǎn)接周期試管苗生長的影響

在芽苗生長過程中，不同轉(zhuǎn)接周期會(huì)對(duì)芽苗的生長有很大影響。為了克服轉(zhuǎn)接周期對(duì)芽苗枯死的影響，試驗(yàn)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，將培養(yǎng)周期分為20、25、30、40 d 4個(gè)不同時(shí)間周期，每處理轉(zhuǎn)接5～6瓶，以芽苗枯死率為試驗(yàn)指標(biāo)，觀察不同的培養(yǎng)周期對(duì)芽苗枯死率的影響。

芽苗枯死率（%）=枯死的芽苗個(gè)數(shù)/接種數(shù)×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Exce1和DPS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基篩選

組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基的篩選很重要。本試驗(yàn)在參照以往沙棘組織培養(yǎng)基篩選實(shí)驗(yàn)，分別選用了WPM、1/2MS、1/4MS 3種濃度的基本培養(yǎng)基［9］，不添加任何植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，蔗糖濃度為20%，20 d后觀察西藏沙棘莖尖生長狀況，試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 基本培養(yǎng)基對(duì)西藏沙棘莖尖苗高生長統(tǒng)計(jì)表

從表1中可以看出，1/2MS 培養(yǎng)基中沙棘莖尖生長健壯，芽色嫩綠，莖尖高均值最大，為2.82 cm；1/4MS培養(yǎng)基沙棘莖尖生長狀態(tài)一般；WPM培養(yǎng)基中沙棘莖尖長勢最差。1/2MS 培養(yǎng)基中沙棘莖尖高均值與1/4MS培養(yǎng)基沙棘莖尖高均值達(dá)到了5%顯著水平，但與WPM培養(yǎng)基沙棘莖尖高均值達(dá)到了極顯著差異。由此可見，西藏沙棘莖尖組織培養(yǎng)過程中，1/2MS為較適宜的基本培養(yǎng)基。

對(duì)莖尖高生長均值進(jìn)行新復(fù)極差法分析，見表2。從表2中可以看出，不同的培養(yǎng)基對(duì)莖尖生長的F值等于101.407，對(duì)應(yīng)的相同概率值P=0.000 1＜0.01，說明不同培養(yǎng)基對(duì)苗高有極顯著差異。

表2 基本培養(yǎng)基對(duì)西藏沙棘莖尖生長方差分析表

2.2 不同濃度 6-BA與NAA的不同組合對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的影響

莖尖經(jīng)過一段時(shí)間的生長必須要轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中才能更好地繼續(xù)生長，在增殖過程中，合適的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其組合，可以大大提高芽的增殖數(shù)量，擴(kuò)大繁殖系數(shù)［10］。分析不同濃度6-BA與NAA的不同組合對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的影響，并進(jìn)行方差分析和多重比較，結(jié)果見表3～表6。

表3 不同濃度的6-BA與NAA組合對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的影響

表4 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的方差分析

表5 不同濃度6-BA對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的多重比較

表6 不同濃度NAA對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的多重比較

從表4中方差分析結(jié)果可以看出，不同濃度的6-BA、NAA對(duì)西藏沙棘莖尖增殖影響差異極顯著，說明6-BA與NAA配合有交互作用。

用新復(fù)極差法進(jìn)行進(jìn)一步多重比較表明，F(xiàn)值等于11.129 0，對(duì)應(yīng)的相同的概率值P=0.038 36＜0.05的顯著水平，極差法測驗(yàn)結(jié)果表明，A1pha0.05（24）=0.210 4，A因素概率值 4.650 0，B因素概率值5.666 7，A×B均方差4.733 3大于臨界值0.210 4。因此得出：6-BA的適宜濃度為1.0 mg/L；NAA的適合濃度為0～0.1 mg/L；兩因素進(jìn)行交互分析得出1.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA為莖尖生長調(diào)節(jié)劑的最佳組合。

2.3 蔗糖濃度對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的影響

從表7可以看出，蔗糖濃度為2.0 mg/L時(shí)，苗高均值最大，為7.3 cm。經(jīng)多重比較得出，蔗糖濃度為2.0 mg/L時(shí)與其他3個(gè)蔗糖濃度存在極顯著差異，由此可見，2.0 mg/L的蔗糖濃度對(duì)苗高的生長最為適宜。

表7 不同蔗糖濃度對(duì)西藏沙棘莖尖高生長的影響

對(duì)苗高均值進(jìn)一步進(jìn)行方差分析（表8），可以看出，不同的蔗糖濃度對(duì)苗高生長的F值等于28.330對(duì)應(yīng)的相同的概率值為P=0.000 4＜0.01，說明不同濃度的蔗糖對(duì)苗高生長有極顯著差異。

表8 不同蔗糖濃度對(duì)西藏沙棘莖尖高生長均值方差分析

2.4 轉(zhuǎn)接周期對(duì)克服芽苗枯死現(xiàn)象的影響

在西藏沙棘組織培養(yǎng)的整個(gè)過程中，不斷出現(xiàn)芽苗逐漸變褐、干枯、繼而死亡的現(xiàn)象。為了盡可能避免這一現(xiàn)象的發(fā)生，試驗(yàn)以1/4MS為基本培養(yǎng)基，將外植體的轉(zhuǎn)接周期分為15 d、20 d、25 d、30 d，統(tǒng)計(jì)芽苗枯死狀況，試驗(yàn)結(jié)果見表9。

表9 培養(yǎng)周期對(duì)西藏沙棘芽苗枯死率的影響

從表9可以看出，轉(zhuǎn)接周期為15 d時(shí)，芽苗枯死率最低，為16.33%，與其他轉(zhuǎn)接周期相比，存在極顯著性差異。用Duncan新復(fù)極差法對(duì)轉(zhuǎn)接周期對(duì)西藏沙棘芽苗枯死率進(jìn)行方差分析（見表10），結(jié)果表明，不同的培養(yǎng)周期對(duì)芽苗枯死率的F值343.412 0對(duì)應(yīng)的P=0.000 1＜0.01，存在極顯著性差異，由此可見，縮短轉(zhuǎn)接周期，加快轉(zhuǎn)接頻率有助于改善芽苗的生長狀況，能夠在一定程度上克服芽苗的枯死現(xiàn)象。

表10 西藏沙棘芽苗枯死狀況方差分析表

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

西藏沙棘莖尖生長最適宜的基本培養(yǎng)基1/2 MS；莖尖生長中生長調(diào)節(jié)劑6-BA與生長素NAA濃度配比最佳組合為：6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度為2.0 mg/L時(shí)西藏沙棘莖尖生長高均值最大，達(dá)到2.82 cm； 莖尖的轉(zhuǎn)接周期為15 d時(shí)，芽苗枯死率最低；轉(zhuǎn)接周期超過30 d時(shí)，芽苗枯死率最高，達(dá)到52.67%。

3.2 討論

沙棘組織快繁技術(shù)已經(jīng)很成熟，運(yùn)用也很廣泛，但對(duì)于青海省野生西藏沙棘組織培養(yǎng)技術(shù)研究國內(nèi)外尚未見報(bào)道，西藏沙棘的組織培養(yǎng)技術(shù)還在摸索階段，還有大量的工作要做。

西藏沙棘作為高寒地區(qū)經(jīng)濟(jì)樹種之一，雖然資源豐富，資源品質(zhì)優(yōu)良，但野生資源引種開發(fā)難度大。因此在西藏沙棘組織培養(yǎng)中外植體的選取顯得至關(guān)重要，不同時(shí)間取材對(duì)外植體的誘導(dǎo)效果不同。從各種研究中可以看出，沙棘組織培養(yǎng)中外植體的取材時(shí)間最好選擇在萌動(dòng)和發(fā)育早期［10］。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)期選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w，才能培養(yǎng)出更好的幼苗，從而進(jìn)行大規(guī)模繁育，在西藏沙棘莖尖的組織培養(yǎng)過程中，消毒和滅菌環(huán)節(jié)也很重要，它們是組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)［11］，關(guān)系到芽苗的正常生長。

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（責(zé)任編輯：楊婷婷）

Preliminary Study on Rapid Propagation Techniques with on stem-tip tissue Hippophae thibetana

SONG Weixiu，ANG Maoji，PENG Maozhuoma
（College of Agriculture&Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016，Qinghai，China）

In this paper young and tender stem tips were used as explants to study tissue culture techniques for growing seedlings of Hippophae thibetana.The results showed that the optimal basic culture medium is 1/2 MS；the optimal growth regulator concentration ratio for Hippophae thibetana stem tips growth is 6-BA1.0mg.L-l+NAA0.lmg.L-l；The mean stem-tip height increment reached maximum of 2.82 cm with sucrose concentration of 2.0mg.L-1；In the stem-tip proliferation process，appropriate switching cycles could lessen dieback of bud seedlings；The dieback rate reached minimum of 16.33%with the replanting interval of 15d and increased significantly to 52.67%when the replanting interval extended to 30 d.

Hippophae thibetana；Stem tips；Explants；Rapid propagation with tissue culture techniques

S793.6

A

2095-0152（2016）03-0023-04

2016-03-16

2016-04-26

青海大學(xué)中青年基金項(xiàng)目“青海省野生西藏沙棘生物化學(xué)特性及組織快繁技術(shù)研究”（編號(hào)：2012-QNY-Z）。

宋維秀（1973-），女，副教授，主要從事林木種苗理論與技術(shù)研究。E-mail：songweixiu2003@sina.com