田 華，陳光勇，董 瑜，王 靜，王貽鴻，孔凡玉*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.云南省曲靖市煙草公司會澤分公司，云南 會澤 654200）

毀滅炭疽菌誘抗蛋白的分離純化及對煙草抗病促生作用

田 華1，2，陳光勇3，董 瑜3，王 靜1，王貽鴻1，2，孔凡玉1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3.云南省曲靖市煙草公司會澤分公司，云南 會澤 654200）

為明確誘抗蛋白能夠?qū)煵莓a(chǎn)生抗病促生作用，采用加熱、離心、硫酸銨分級沉淀、透析和凝膠色譜柱等方法，從毀滅炭疽菌（Colletotrichum destructivum）中分離純化出一種誘抗蛋白，并采用噴霧接種和摩擦接種的方法研究其預(yù)防保護(hù)作用。結(jié)果表明，經(jīng)SDS-PAGE顯示該誘抗蛋白分子量約為38 kD，且目的蛋白存在于Pro-P2-TX組份中；對煙株進(jìn)行煙草普通花葉病毒病的接種試驗，接種 3 d后，誘抗蛋白處理組煙草葉片枯斑數(shù)明顯少于清水對照組，對 TMV的誘抗效果為73.79%；該誘抗蛋白能夠明顯促進(jìn)煙草的生長，誘導(dǎo)處理40 d后，煙草的株高、葉寬和莖圍與清水對照相比明顯增加，其中株高增長72.43%，葉寬和莖圍分別增加61.06%和29.05%。因此，試驗結(jié)果說明毀滅炭疽菌誘抗蛋白具有誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗病性和促進(jìn)煙草生長的作用。

誘抗蛋白；毀滅炭疽菌；分離純化；誘導(dǎo)抗病性；煙草生長

煙草普通花葉病毒病由煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）引起，在世界各個煙區(qū)普遍發(fā)生，是造成煙草產(chǎn)量損失的重要因子之一。此病自苗床至大田整個生育期均可連續(xù)發(fā)生，傳播途經(jīng)簡單，危害面廣［1-2］，經(jīng)濟損失大，目前防治該病主要應(yīng)用化學(xué)藥劑，但是過多依賴化學(xué)藥劑會導(dǎo)致病原物產(chǎn)生抗藥性及環(huán)境污染［3］，所以生物防治逐漸成為防治植物病害的研究熱點。生物農(nóng)藥產(chǎn)品無毒，不引起病蟲害的抗藥性，在植物體和土壤中易分解，無殘留，可大幅度提高煙草質(zhì)量和國際競爭力。目前有許多生物抗病毒劑已經(jīng)投入到煙草生產(chǎn)的實用階段，但是預(yù)防和防治效果并不顯著，因此研究和開發(fā)有效的抗病毒病生物制劑是煙草生產(chǎn)上亟待解決的問題［4］。

激發(fā)子是一類能夠誘導(dǎo)寄主或非寄主植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的特殊化合物［5-6］，依據(jù)生物化學(xué)結(jié)構(gòu)，生物源激發(fā)子主要有寡糖和蛋白質(zhì)兩種類型［7］。近年來，利用蛋白質(zhì)類激發(fā)子控制植物病害的研究愈來愈受到重視。2001年美國Eden生物公司成功將梨火疫病原細(xì)菌（Erwinia amylovra）中的一種蛋白質(zhì)開發(fā)為抗病生防農(nóng)藥Messenger［8］，被稱為作物生產(chǎn)和食品安全的一次綠色革命。國內(nèi)學(xué)者已經(jīng)從交鏈孢菌（Alternaria spp.）、鐮刀菌（Fusarium spp.）等多種真菌中分離出一類蛋白質(zhì)激發(fā)子［9］，雖然來源不同，但都可以誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病性，并能促進(jìn)植株生長、改善品質(zhì)以及增加產(chǎn)量。其中邱德文用稻瘟菌蛋白質(zhì)激發(fā)子處理煙草普通花葉病毒病，其控制效果在75%以上［10］。李杰等［11］研究發(fā)現(xiàn)，極細(xì)鏈格孢菌66 kD誘抗蛋白可以誘導(dǎo)煙草抗TMV，枯斑抑制率可達(dá) 49%。用激活蛋白制劑處理煙株，能顯著促進(jìn)煙草生長，使煙草株高、葉面積和留葉數(shù)都顯著增加，并能明顯改善烤煙品質(zhì)［10］。卜冰武等［12］研究發(fā)現(xiàn)，大麗輪枝菌蛋白質(zhì)激發(fā)子能夠誘導(dǎo)棉花抗黃萎病，病害減輕率達(dá)35.04%。

根據(jù)前人的研究，本試驗從毀滅炭疽菌（Colletotrichum destructivum）中分離純化出一種38 kD的誘抗蛋白，觀察其對TMV的誘抗效果以及對煙草的促生作用，為以后的田間防治應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1供試材料

供試植株及菌株：煙草品種是小黃金 1025，TMV普通株系（TMV-U1）毒源以及枯斑寄主材料是三生煙（Nicotiana tabacum var. samsun NN），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供；毀滅炭疽菌由本實驗室4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL（PDA液體培養(yǎng)不加瓊脂）。

1.2試驗方法

1.2.1毀滅炭疽菌菌絲的培養(yǎng) 將保存的毀滅炭疽菌菌種接種于 PDA培養(yǎng)基活化后，用打孔器分別打取直徑為5 mm的3個菌餅接種于PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)3 d。真空抽濾收集菌絲體，抽濾過程中用雙蒸水洗滌4次，凍存于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫?3］。

1.2.2毀滅炭疽菌誘抗蛋白的粗提 將凍存的菌絲體用液氮研磨為粉狀，加入到 30 mmol/L的HEPES緩沖液（pH 7.1）中，緩沖液的體積為PDA培養(yǎng)基的十分之一，混合后沸水浴 30 min，4 ℃，13 000 r/min離心20 min，收集上清液。在上清液中加入0.1%的活性碳和0.1%的魚精蛋白［14］置于冰盒中緩慢攪拌10 min，然后4 ℃，13 000 r/min離心20 min，收集上清。將收集的上清進(jìn)行30%的硫酸銨沉淀，4 ℃，13 000 r/min離心30 min，收集上清棄沉淀。再將上清進(jìn)行 70%的硫酸銨沉淀，4 ℃，13 000 r/min離心30 min，收集沉淀，再次溶解于HEPES緩沖液中，4 ℃條件下透析2 d，冷凍干燥，獲得毀滅炭疽菌粗蛋白，并采用SDS-PAGE電泳檢測蛋白分子量。

1.2.3毀滅炭疽菌誘抗粗蛋白的純化 Sephacryl S200凝膠色譜柱分離純化：根據(jù)蛋白混合物中各組分的分子量分布，選用Sephacryl S200（分離范圍5-250 kD）凝膠色譜柱對其進(jìn)行分離純化。首先對蛋白液進(jìn)行離心，上清冷凍干燥。干燥后樣品用于Sephacryl S200凝膠滲透柱層析。取蛋白樣品適量，用流動相溶解后過0.22 μm濾膜備用，按下列色譜條件進(jìn)行純化：Sephacryl S200凝膠滲透色譜柱（2.6×100 cm，柱體積500 mL）；流動相：磷酸鹽緩沖液（含100 mmol/L NaCl，pH 7.4）；流速：0.5 mL/min；柱溫：室溫；紫外檢測波長：280 nm。合并收集各洗脫組分，離心濃縮，上清冷凍干燥。

采用Sephacryl S200凝膠滲透色譜獲得的組份，為了減少上樣體積，對其進(jìn)行濃縮。濃縮后每個組份洗出大量的鹽，上清部分通過Sephadex G10進(jìn)行脫鹽，鹽析部分透析除鹽。

Sephadex G10凝膠色譜柱除鹽：將 Sephacryl S200凝膠滲透色譜獲得組份的上清液過0.22 μm濾膜備用，各個組分3次上樣，每次上樣約2 mL。色譜條件：Sephadex G10凝膠滲透色譜柱（1.6×100 mm，柱體積 180 mL）；流動相：H2O；流速：0.6 mL/min；柱溫：室溫；紫外檢測波長：280 nm；每管收集4 mL。合并收集各組分，調(diào)節(jié)磷酸鹽緩沖液至終濃度為 20 mmol/L，冷凍干燥后于-50 ℃冰柜中保存。

透析除鹽：將濃縮液析出的鹽部分透析，以 5 mmol/L PBS為透析外液，透析袋截留量為1 000 Da，透析至透析外液電導(dǎo)值不再變化，透析內(nèi)液分裝凍干，并將各個組分分管冷凍干燥后于-50 ℃冰柜中保存。

純化組分的SDS-PAGE檢測：每個組份各取一管凍干樣品，加入200 μL水溶解，取20 μL溶液加入5 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×），100 ℃，3 min。然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.4誘抗蛋白對TMV的誘抗效果 采用BCA[15]蛋白定量分析試劑盒將蛋白液濃度稀釋為6 mg/mL。當(dāng)三生煙長至6~8片時，用純化后濃度為6 mg/mL的誘抗蛋白進(jìn)行整株噴霧處理，葉面均勻掛滿霧滴不流淌即可，以噴施等量HEPES緩沖液和清水做為對照。誘導(dǎo)處理3 d后，采用常規(guī)的摩擦接種和半葉法[16]接種病毒，用消毒棉棒蘸取少量病毒汁液，輕輕摩擦葉片，僅使葉片表皮細(xì)胞造成微傷口，每株接種 3片展開葉。接種后噴清水沖洗殘留汁液，25 ℃培養(yǎng)，3 d后調(diào)查枯斑數(shù)，并計算誘抗效果。每個處理5株，共3次重復(fù)。誘抗效果=（清水對照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù)）/清水對照枯斑數(shù)×100%

1.2.5誘抗蛋白對煙草的促生作用 采用 BCA[15]蛋白定量分析試劑盒將蛋白液濃度稀釋為6 mg/mL。當(dāng)小黃金煙草長至6~8片時，每隔7 d用6 mg/mL的誘抗蛋白進(jìn)行整株噴霧處理，葉面均勻掛滿霧滴不流淌即可，以噴施等量HEPES緩沖液和清水做為對照。40 d后，定株調(diào)查株高、葉寬和莖圍。設(shè)3次重復(fù)，每處理共90株。

1.3數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft excel 2003和DPS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，并采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗。

2　結(jié)　果

2.1毀滅炭疽菌誘抗蛋白的粗提

毀滅炭疽菌菌絲經(jīng)過加熱、離心、硫酸銨分級沉淀和冷凍干燥后，分離提取獲得誘抗粗蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測顯示誘抗粗蛋白分子量大小約為38 kD（圖1）。

圖1　誘抗粗蛋白SDS-PAGE電泳圖（1、2、3：誘抗蛋白，M：低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白）Fig. 1 Crude protein in SDS-PAGE（1, 2, 3: protein elicitor, M: marker）

2.2毀滅炭疽菌誘抗粗蛋白的純化

Sephacryl S200凝膠色譜柱分離純化：按上述色譜條件進(jìn)行純化后，其色譜圖如圖2所示。從圖中可以看出，在洗脫體積400 mL之前，4次洗脫重現(xiàn)性較好，但在洗脫體積450 mL左右每次洗脫色譜圖均有所差別，但大體趨勢類似。按峰收集了4個組分，分別命名為Pro-P1 TX、Pro-P2 TX 、Pro-P3 TX、Pro-P4 TX。合并收集后，每個組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，等待凍干后通過Sephadex G10色譜柱脫鹽。

圖2　蛋白樣品的Sephacryl S200分離圖（上樣4次）Fig. 2 Sephacryl S200 separation of the protein elicitor

Sephadex G10凝膠色譜柱除鹽：將Pro-P1、Pro-P2、Pro-P3和Pro-P4進(jìn)行Sephadex G10脫鹽處理 ，每個組分3次上樣的重現(xiàn)性良好，蛋白樣品與鹽可以很好的分離。收取60～75 mL處濃縮后的洗脫液，加入 100 mmol/L的 PBS緩沖液至終濃度為 20 mmol/L，冷凍干燥后于-50 ℃柜中保存。

SDS-PAGE：各個組份加水溶解后，其中 Pro-P1 TX和Pro-P2 TX相當(dāng)于濃縮10倍，Pro-P3 TX 和 Pro-P4 TX相當(dāng)于濃縮 15倍。結(jié)果顯示，Pro-P1～P4 TX樣品經(jīng)電泳可以看到微弱的電泳條帶，且從P1到P4電泳遷移率增大，表明從P1到P4，蛋白的分子量降低；其中在Pro-P2 TX（lane 2）中發(fā)現(xiàn)了目的蛋白條帶，其他組分中未發(fā)現(xiàn)；目的蛋白在濃縮時出現(xiàn)鹽析現(xiàn)象，并存在于濃縮后的沉淀中；經(jīng)追蹤檢測，目的蛋白存在于Pro-P2-TX組分中（圖3）。

圖3　蛋白樣品SDS-PAGE圖（1~4: Pro-P1~P4 TX; M: 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白）Fig. 3 Purification of the protein in SDS-PAGE (1~4: Pro-P1~P4 TX; M: Marker )

2.3誘抗蛋白對TMV的誘抗效果

純化后的誘抗蛋白對TMV有一定的誘抗作用，TMV采用半葉法接種3 d后，可以觀察到，誘抗蛋白處理組的枯斑數(shù)明顯少于HEPES緩沖液和清水對照組的枯斑數(shù)（表1）。誘抗蛋白液處理組枯斑數(shù)平均每半葉為10.22個，清水和HEPES緩沖液對照組枯斑數(shù)為39.00和34.78，差異顯著，而HEPES緩沖液與清水處理的煙株枯斑數(shù)無顯著差異，誘抗蛋白對TMV的誘抗效果為73.79%，說明誘抗蛋白對TMV有一定的預(yù)防保護(hù)作用。

表1　誘抗蛋白對TMV的誘抗效果Table 1 Anti-tobacco TMV activity induced by the protein elicitor

2.4誘抗蛋白對煙草的促生作用

純化后的誘抗蛋白能夠明顯促進(jìn)煙草的生長，表現(xiàn)為株高、葉寬和莖圍的增加。誘抗蛋白誘導(dǎo)處理40 d后，與清水對照相比，誘抗蛋白處理組煙草株高約為17.14 cm，增長72.43%，葉寬約為10.11 cm，增長61.06%，莖圍約為0.63 cm，增長29.50%，且差異顯著（表2）。

表2　誘抗蛋白對煙草的促生作用 cmTable 2 Facilitating the growth of tobacco induced by the protein elicitor cm

3　討　論

毀滅炭疽菌誘抗蛋白是本研究小組從毀滅炭疽菌中分離純化出的一種蛋白質(zhì)類激發(fā)子。由于誘抗蛋白是一類耐熱性的蛋白質(zhì)類激發(fā)子，因此在分離提取的過程中，本研究小組采取了加熱離心的方法，首先去除其中大部分的非耐熱性雜蛋白質(zhì)。由于誘抗蛋白的分子量較小，一般為30~70 kDa[9]，所以利用30%硫酸銨分級沉淀的方法，可以去除掉一些大分子的蛋白質(zhì)。整個分離提取過程要在4 ℃低溫條件下進(jìn)行，以有效抑制蛋白酶對粗蛋白組分的分解作用。色素有紫外吸收作用，核酸可以擾亂蛋白溶液pH值，所以本試驗通過加入活性炭和魚精蛋白［13］的方法，離心沉淀去除了大部分的色素和核酸物質(zhì)，所有這些分離提取技術(shù)為后續(xù)的蛋白純化鑒定了一定的基礎(chǔ)。SDS-PAGE是一種常用的電泳技術(shù)，經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢測，其具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質(zhì)，而且通過電泳還可以同時得到關(guān)于分子量的情況［17］。所以本實驗室采用SDS-PAGE技術(shù)對分離純化得到的蛋白組分進(jìn)行檢測，得到目的蛋白存在于Pro-P2-TX組分中，分子量大小約為38 kDa。

TMV是煙草整個生育期比較嚴(yán)重的病害，本研究小組用分離純化后的誘抗蛋白處理煙草植株，使煙草植株產(chǎn)生誘導(dǎo)抗病性，其誘抗效果為73.79%，說明該誘抗蛋白可以有效的預(yù)防TMV的發(fā)生。目前提高煙葉的生產(chǎn)質(zhì)量與產(chǎn)量，增加煙農(nóng)的收入，成為整個煙草煙草行業(yè)亟待解決的問題，本試驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)該誘抗蛋白處理后，煙草植株的株高、葉寬和莖圍較對照有明顯的增加。誘抗蛋白作為一種生物防治方法，不存在化學(xué)農(nóng)藥的弊端，比如抗藥性和食品安全等問題。為了更廣泛的利用誘抗蛋白，本實驗室還需要進(jìn)一步的研究誘抗蛋白對煙草其他病蟲害以及對不同品種植物的誘抗作用，同時需要增加田間的試驗，以期為病害生物防治提高更有效的方法。

前人研究發(fā)現(xiàn)真菌源蛋白質(zhì)類激發(fā)子可以通過不同的代謝途徑實現(xiàn)信號傳導(dǎo)，引起基因表達(dá)，激活植物自身防御系統(tǒng)和生長系統(tǒng)，促進(jìn)植物生長，提高作物產(chǎn)量和產(chǎn)品品質(zhì)［18］。袁肖寒研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘抗蛋白處理后，水稻過氧化物酶、多酚氧化酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性及過氧化氫含量有了顯著變化［19］。PR-1a、PR-1b和NPR1基因都是病程相關(guān)蛋白基因，基因 PR-1常作為植物系統(tǒng)抗性的重要特征以及水楊酸信號傳導(dǎo)（Salicylic acid，SA）途徑的標(biāo)記基因［20］，NPR1是植物系統(tǒng)獲得抗性（Systemic acquired resistance， SAR）信號途徑中的一個關(guān)鍵的調(diào)控因子［21］。所以本研究小組在以后的試驗中，應(yīng)該對該誘抗蛋白的作用機理進(jìn)行探索，包括相關(guān)防御酶的活性變化，相關(guān)抗性基因的表達(dá)以及誘抗蛋白信號傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵作用因子等，為該誘抗蛋白真正廣泛應(yīng)用于病害防治，并開發(fā)成一種新型的生物農(nóng)藥打下良好的基礎(chǔ)。

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Purification of a Protein Elicitor from Colletotrichum destructivum and Its Biological Activity in Inducing Tobacco Resistance and Facilitating Growth

TIAN Hua1，2， CHEN Guangyong3， DONG Yu3， WANG Jing1， WANG Yihong1，2， KONG Fanyu1*
（1.Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China； 2.Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100081， China， 3. Huize Branch of Qujing， Yunnan Province Tobacco Company， Huize，Yunnan 654200， China）

To functionally investigate the mechanisms of disease resistance and tobacco growth， we have isolated a protein elicitor from mycelium of Colletotrichum destructivum by heating， centrifugation， precipitation， dialysis and gel chromatography column. We then measured the prevention and protection effects of this protein using spray and friction inoculation methods. The results showed that the protein elicitor appeared in Pro-P2-TX and the molecular weight was approximately 38 kD on silver-stained SDS- PAGE. The inhibitory effect to tobacco mosaic virus （TMV） was 73.79%. The protein elicitor could remarkably increase the individual plant height by 72.43%， leaf width by 61.06% and stem circumference by 29.05% respectively. Taken together， the protein elicitor has the role of inducing tobacco resistance and facilitating growth.

protein elicitor； Colletotrichum destructivum； inductive resistance； isolation and purification； tobacco growth

S435.72

1007-5119（2016）04-0068-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.012

福建省煙草公司南平市公司科技項目“煙草根莖病害系統(tǒng)控制技術(shù)”（201203）

田 華，女，在讀碩士，研究方向為煙草病害防治。E-mail：376609425@qq.com。*通信作者，E-mail：kongfanyu123@163.com

2016-02-24

2016-04-12