孫立廣，張洪春，趙秀云，王 瑞，向必坤，彭五星，孫玉曉，尹忠春，譚 軍*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；3.湖北省煙草公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445000）

煙草青枯病拮抗菌在有機(jī)肥中的定殖效率及田間防治效果

孫立廣1，張洪春1，趙秀云1，王 瑞2，向必坤2，彭五星3，孫玉曉3，尹忠春3，譚 軍2*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢 430070；2.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445000；3.湖北省煙草公司宣恩縣煙葉分公司，湖北 宣恩 445000）

為有效防治青枯病，采用多種拮抗菌復(fù)配菌劑添加至生物有機(jī)肥，施用于煙田，研究其對(duì)煙田土壤中有益微生物、病原微生物的影響及對(duì)青枯病的控制效果。結(jié)果顯示，30%茶枯+70%煙草秸稈粉碎物（生物有機(jī)肥C）中添加的拮抗菌有較好的定殖率，枯草芽胞桿菌JK-4、解淀粉芽胞桿菌JK-10菌株在生物有機(jī)肥C中的定殖率分別達(dá)到了945.7%、1970%，鏈霉菌LC-7菌株在生物有機(jī)肥C中定殖率達(dá)到496.7%，同時(shí)其防治青枯病的效果最好，在煙草旺長(zhǎng)期防治效果達(dá)到57.40%，在青枯病發(fā)病高峰期防治效果為37.11%。

煙草青枯病；生物有機(jī)肥；芽胞桿菌；鏈霉菌；防治效果

煙草青枯病是一種煙草土傳病害，其爆發(fā)會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1］。為防止青枯病發(fā)生，利用添加拮抗微生物的有機(jī)肥防治青枯病正成為研究熱點(diǎn)。目前有機(jī)肥與功能微生物（生防菌、促生菌等）相結(jié)合制成的微生物有機(jī)肥對(duì)各種土傳病害的防控表現(xiàn)出很好的效果［2-5］。但是單一菌種、單一功能的生防菌已不能滿足農(nóng)業(yè)發(fā)展的需求。本研究將篩選獲得的多種青枯雷爾氏菌的拮抗菌發(fā)酵菌液添加到不同種類的有機(jī)肥中，檢測(cè)定殖情況；同時(shí)將添加拮抗菌劑的有機(jī)肥施用于煙田，監(jiān)測(cè)煙田土壤中青枯雷爾氏菌及拮抗菌的數(shù)量變化以及青枯病發(fā)病情況，篩選出效果最佳的生物有機(jī)肥組合，期望有助于改變目前青枯病生防藥劑單一的現(xiàn)狀，獲得防治煙草青枯病的新途徑。

1　材料與方法

1.1材料

煙草青枯雷爾氏菌由發(fā)病煙草植株分離并在實(shí)驗(yàn)室保存。添加的拮抗菌為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存菌株，分別為鏈霉菌 LC-7菌株（Streptomyces sp.）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽胞桿菌（Bacillus methylotrophicus）JK-3菌株，枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）JK-4菌株，解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）JK-10菌株，已確認(rèn)有良好的抑制青枯雷爾氏菌的活性。平板噴霧法：挑取細(xì)菌單菌落，點(diǎn)樣至PDA培養(yǎng)基平板上，倒置放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在平板上噴霧接種對(duì)數(shù)期的青枯雷爾氏菌，放入28 ℃培養(yǎng)箱，24 h后觀察是否有抑菌圈。

設(shè)置的5種有機(jī)肥處理由湖北省恩施州煙草公司提供，分別為生物有機(jī)肥A：100%煙草秸稈粉碎物；B：30%菜枯+70%煙草秸稈粉碎物；C：30%茶枯+70%煙草秸稈粉碎物；D：30%菜枯+30%炭化谷殼+40%煙草秸稈粉碎物；E：30%茶枯+30%炭化谷殼+40%煙草秸稈粉碎物。

田間試驗(yàn)在宣恩縣曉關(guān)鄉(xiāng)古路村進(jìn)行，選擇煙草青枯病發(fā)生嚴(yán)重的黃棕壤進(jìn)行試驗(yàn)，供試品種為云煙87。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1拮抗菌共培養(yǎng)試驗(yàn) 采用平板對(duì)峙法，將拮抗菌分別點(diǎn)接在平板上，點(diǎn)接距離2 cm，在培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)5～7 d，觀察菌株生長(zhǎng)是否會(huì)互相影響。

1.2.2拮抗菌在有機(jī)肥中的定殖和存活率測(cè)定 5種不同有機(jī)肥分別在121 ℃高溫滅菌30 min。將培養(yǎng)的4種拮抗菌菌株發(fā)酵液按10%（V/W）的接種量分別加入到滅菌有機(jī)肥中，放置于 37 ℃培養(yǎng)箱中，每天手動(dòng)搖翻來(lái)進(jìn)行混勻，3 d后，取發(fā)酵的有機(jī)肥10 g，溶于90 mL無(wú)菌水中，系列梯度稀釋，選擇合適稀釋度涂布牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或高氏一號(hào)培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)3～5 d后，計(jì)算單菌落數(shù)量，計(jì)算每種拮抗菌在有機(jī)肥中的含菌量。

1.2.3將拮抗菌加入有機(jī)肥進(jìn)行二次發(fā)酵 將各個(gè)功能菌的菌株發(fā)酵液（109CFU/mL）按1%（V/W）的量分別加入到腐熟好的生物有機(jī)肥A-E中，固體發(fā)酵，發(fā)酵溫度30～45 ℃，發(fā)酵過(guò)程中每天翻堆一次，發(fā)酵5～7 d。分別將各個(gè)菌固體發(fā)酵獲得的菌劑等體積混合，并后熟2～3 d，后熟過(guò)程中翻堆2次，最后在溫度不超過(guò) 60 ℃的條件下將微生物有機(jī)肥的含水量蒸發(fā)至50%左右。獲得含有拮抗菌的生物有機(jī)肥BOF A-E。

1.2.4田間施用生物有機(jī)肥 分別以施用5種不同生物有機(jī)肥（BOF A-E）為5個(gè)處理，每個(gè)處理重復(fù)3次，每個(gè)小區(qū)植煙60株。移栽前將BOF肥料施于土壤中，施用量為200 g/株。同時(shí)以施用100%化肥的處理作為對(duì)照，養(yǎng)分差均用化肥補(bǔ)齊。所有處理氮磷鉀的施入總量相等。生物有機(jī)肥A-E施用量為200 g/株，移栽前均勻施撒于田間；移栽后的30和60 d，使用拮抗菌稀釋5倍的發(fā)酵液灌根處理，每株100 mL，肥料所施小區(qū)分別標(biāo)記為SF-1—SF-5。按常規(guī)施肥量施化肥，不使用有機(jī)肥，作為對(duì)照組，所施小區(qū)標(biāo)記為SF-6。

1.2.5病情調(diào)查 自移栽后出現(xiàn)第1株發(fā)病植株起，每隔15 d詳細(xì)調(diào)查病情狀況，并記錄直至煙草成熟期。青枯病的病情指數(shù)按照中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法調(diào)查。煙草青枯病的發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果按下式計(jì)算：

發(fā)病率=發(fā)病植株/調(diào)查植株總數(shù)×100%

病情指數(shù)=Σ［（病情級(jí)數(shù)×此級(jí)株數(shù)）/（最高級(jí)數(shù)×總株數(shù)）］×100

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.6煙田青枯雷爾氏菌和拮抗菌數(shù)量的檢測(cè)分別在田間施用有機(jī)肥30，60，90 d后以及青枯病發(fā)病高峰期取土壤樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室，10倍系列梯度稀釋后，涂布在TTC培養(yǎng)基上，培養(yǎng)后計(jì)算青枯雷爾氏菌的數(shù)量。同時(shí)分別用高氏一號(hào)培養(yǎng)基和NA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，計(jì)算放線菌和芽胞桿菌的數(shù)量。

2　結(jié)　果

2.1拮抗菌共培養(yǎng)試驗(yàn)

如圖1所示，平板上的不同菌株在生長(zhǎng)中并不會(huì)相互產(chǎn)生明顯的抑制作用，所有菌株的共培養(yǎng)試驗(yàn)均顯示各個(gè)拮抗菌之間的生長(zhǎng)并不會(huì)相互產(chǎn)生影響。

圖1　拮抗菌共培養(yǎng)結(jié)果Fig. 1 Antagonistic bacteria co-culture results

2.2拮抗菌在有機(jī)肥中的定殖

從表1可以看出，拮抗菌株在大部分有機(jī)肥中的定殖率均比較高，均顯示了較好的定殖結(jié)果。從總體來(lái)看，有機(jī)肥C的定殖結(jié)果最好，所有拮抗菌都有較高的定殖率，其中 JK-3的定殖率達(dá)到了4595%，JK-3的定殖率在所有組別中最高。其次有機(jī)肥B與有機(jī)肥E也有較好的定殖結(jié)果，但在這兩種肥料中，LC-7的定殖率則明顯低于有機(jī)肥C。在有機(jī)肥A與有機(jī)肥D中，3種細(xì)菌的定殖率都比較高，但LC-7卻不能在其中很好的定殖?？梢?jiàn)，在拮抗菌定殖試驗(yàn)中，有機(jī)肥C可以很好地促進(jìn)各拮抗菌的生長(zhǎng)，其次是有機(jī)肥B與有機(jī)肥E。

表1　拮抗菌株在5種生物有機(jī)肥中的定殖Table 1 Colonization of antagonistic strains in five bio-organic fertilizers

2.3土壤中青枯雷爾氏菌和拮抗菌的檢測(cè)

分別在移栽后30、60、90 d以及青枯病發(fā)病高峰期進(jìn)行采樣檢測(cè)。

2.3.1土壤中青枯雷爾氏菌數(shù)量 從表2可以看出，在發(fā)病高峰期，添加拮抗菌和生物有機(jī)肥的5個(gè)小區(qū)土壤中青枯雷爾氏菌數(shù)量明顯少于對(duì)照組的數(shù)量，其中 SF-1處理組土壤中的青枯雷爾氏菌數(shù)量最少。處理組 SF-1在各個(gè)時(shí)期土壤青枯雷爾氏菌數(shù)量如圖2所示，由于青枯雷爾氏菌在各個(gè)土樣中不同時(shí)期含量的變化波動(dòng)范圍較大，縱坐標(biāo)采用菌含量的對(duì)數(shù)值?？梢钥闯鲈?0至90 d青枯雷爾氏菌在土壤中的含量呈上升趨勢(shì)，但90 d至發(fā)病高峰期明顯下降，說(shuō)明添加拮抗菌的有機(jī)肥在生長(zhǎng)后期可以抑制煙田土壤中青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)?？梢?jiàn) 5種添加了拮抗菌劑的有機(jī)肥均可以有效地降低土壤中青枯雷爾氏菌的數(shù)量，預(yù)防青枯病的發(fā)生。

表2　不同處理發(fā)病高峰期土壤中青枯雷爾氏菌數(shù)量Table 2 The number of Ralstonia solanacearum in different soil samples in peak period

圖2　SF-1處理不同時(shí)期土壤中青枯雷爾氏菌數(shù)量Fig. 2 The number of R. solanacearum in different periods in SF-1 soil

2.3.2土壤中拮抗菌的跟蹤監(jiān)測(cè) 土壤中鏈霉菌LC-7的檢測(cè)結(jié)果如圖3。在發(fā)病高峰期，SF-3處理組檢測(cè)到的菌含量最高，同時(shí)期 SF-3處理組的青枯雷爾氏菌數(shù)量明顯少于對(duì)照組，能很好的抑制青枯雷爾氏菌的生長(zhǎng)。放線菌能產(chǎn)生多種抗生素，對(duì)抑制土壤中病原菌的繁殖起到了關(guān)鍵作用。放線菌數(shù)量最高的 SF-3土樣各個(gè)時(shí)期的放線菌數(shù)量如圖4所示。在發(fā)病高峰期，放線菌數(shù)量明顯增加，這有利于抑制土壤中病原菌的生長(zhǎng)和繁殖。

圖3　不同處理發(fā)病高峰期土壤中鏈霉菌數(shù)量Fig. 3 The number of Streptomyces strain LC-7 peak period in soil samples

圖4　SF-3處理不同時(shí)期土壤中放線菌數(shù)量Fig. 4 The number of Actinomycetes in different periods in SF-3 soil

發(fā)病高峰期不同處理組土壤中的芽胞桿菌含結(jié)果如圖5所示，其中SF-1處理組含菌量最多，達(dá)到了 8.9×108CFU/g土，其他處理組芽胞桿菌的含量也基本保持在相同的水平，都達(dá)到了107這個(gè)數(shù)量級(jí)。含菌量最多的 SF-1處理組各個(gè)時(shí)期芽胞桿菌的數(shù)量如圖6所示，相比于90 d時(shí)，發(fā)病高峰期芽胞桿菌的數(shù)量有所下降，但仍維持在一個(gè)較高的水平。

圖6　SF-1處理不同時(shí)期土壤中芽胞桿菌數(shù)量Fig. 6 The number of Bacillus in different periods in SF-1soil

2.4青枯病田間防治效果

對(duì)各個(gè)處理在不同時(shí)期的青枯病發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查并統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表3。從表中可以看出，5種添加了拮抗菌劑的有機(jī)肥均可以抑制煙草青枯病。在團(tuán)棵期，對(duì)照組的發(fā)病率為53.70%，而處理組中最高的發(fā)病率為 38.89%（SF-5），最低只有24.07%（SF-3）。隨著時(shí)間推移，處理組的防效略有下降。在成熟期，最高的防治效果為SF-3處理組，防效達(dá)到了37.11%。

隨著進(jìn)入發(fā)病高峰期，各個(gè)小區(qū)內(nèi)的煙草發(fā)病率都呈上升的趨勢(shì)。如圖7所示，施用生物有機(jī)肥C的SF-3土樣，在各個(gè)時(shí)期發(fā)病率都低于其他處理組，表現(xiàn)出較好的抗病能力。

表3　田間試驗(yàn)中各時(shí)期青枯病發(fā)病率和防治效果 %Table 3 The incidence and control efficacy of bacterial wilt at different periods in field experiments %

各處理組的防治效果如圖8所示，施用有機(jī)肥土樣的煙草在初期防治效果均超過(guò)了30%，隨著煙草的生長(zhǎng)，施用不同有機(jī)肥的土樣在煙草生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出了不同的變化趨勢(shì)，隨著發(fā)病高峰期的到來(lái)，防治效果有所下降但仍保持在一定水平，其中生物有機(jī)肥C在高峰期防治效果最佳，達(dá)到37.11%。

圖7　田間試驗(yàn)中煙草各時(shí)期青枯病的發(fā)病率Fig.7 The incidence of tobacco bacterial wilt in field experiments in different periods

圖8　田間試驗(yàn)中生物有機(jī)肥對(duì)青枯病的防治效果Fig. 8 The control efficacy of bio-organic fertilizers on tobacco bacterial wilt in field experiments

3　討　論

生物有機(jī)肥可以促進(jìn)土壤養(yǎng)分的釋放，增加土壤肥力，利于植物的吸收，同時(shí)產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子可以有效地抑制植物病蟲(chóng)害的發(fā)生并促進(jìn)植物穩(wěn)健生長(zhǎng)［6］。生物有機(jī)肥的防病效果，已經(jīng)突破了它傳統(tǒng)上增加肥力作用，受到了廣泛的關(guān)注［7-8］。

研究了5種不同生物有機(jī)肥添加復(fù)合拮抗菌劑后對(duì)煙草青枯病的防治效果發(fā)現(xiàn)，添加了復(fù)合拮抗菌劑的生物有機(jī)肥都能夠減少土壤中青枯雷爾氏菌的數(shù)量，同時(shí)一定程度上減少了煙草青枯病的發(fā)生，雖然隨著時(shí)間推移各處理組青枯病發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但在發(fā)病高峰期仍表現(xiàn)出穩(wěn)定的防效，其中，SF-3處理組在發(fā)病高峰期對(duì)青枯病防治效果最高，達(dá)到37.11%。生物有機(jī)肥由于添加了煙草青枯菌復(fù)合拮抗菌劑，包括芽孢桿菌、鏈霉菌等［9-13］，這些有益菌在土壤中定殖并大量繁殖后，可以在煙草植株的根際成為優(yōu)勢(shì)菌株，產(chǎn)生的抗生素類物質(zhì)對(duì)病原菌具有一定的抑制作用，因此可以減少青枯病的發(fā)病。其中芽胞桿菌通過(guò)空間和營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、溶菌作用以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性幾種方式綜合達(dá)到防治效果［14］，而鏈霉菌則會(huì)產(chǎn)生抗生素［15］。徐福樂(lè)等［16］利用添加復(fù)合菌劑的生物有機(jī)肥對(duì)番茄青枯病的防治效果達(dá)到了69%，另外添加的有益菌還會(huì)分泌多種代謝產(chǎn)物，有助于煙草的生長(zhǎng)，提高抗病能力［17-18］。除此之外生物有機(jī)肥還會(huì)增加煙草植株過(guò)氧化物酶等酶活性的提高，增強(qiáng)抵御病蟲(chóng)害的能力，降低病害的發(fā)生［19］。試驗(yàn)中觀察各處理組的發(fā)病情況，可以明顯看出與對(duì)照組相比，各處理組的發(fā)病時(shí)間均向后推遲，施用有機(jī)肥C的SF-3土樣在煙草旺長(zhǎng)期的發(fā)病率為30%，大大低于對(duì)照組的71%。丁傳雨等［20］的研究也發(fā)現(xiàn)生物有機(jī)肥能夠延緩青枯病的發(fā)病時(shí)間。

生物有機(jī)肥中添加的有益菌無(wú)毒害，不污染環(huán)境，成功定殖后可以長(zhǎng)期發(fā)揮作用，而且可以改變土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)［21］，使病原菌數(shù)量減少，同時(shí)生物有機(jī)肥能夠提供植株生長(zhǎng)所需的各種微量元素和大量有機(jī)物質(zhì)，提高土壤供肥能力。施用生物有機(jī)肥對(duì)改善土壤質(zhì)量［22］，提高土壤更新恢復(fù)能力，防治土傳病害具有十分重要的意義［23-24］。

4　結(jié)　論

施用的5種生物有機(jī)肥可以在一定程度上降低青枯病的發(fā)病率。拮抗菌定殖率、發(fā)病率統(tǒng)計(jì)等結(jié)果說(shuō)明，有機(jī)肥C為最佳的有機(jī)肥配比，最適宜拮抗菌定殖，可以較好地防治青枯病。生物有機(jī)肥的使用將對(duì)保護(hù)環(huán)境，提高煙草產(chǎn)量，保證煙草產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展做出貢獻(xiàn)。其施用方式與施用量還需進(jìn)一步研究。

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Colonization Rate of Several Antagonistic Bacteria against Tobacco Bacterial Wilt in Organic Fertilizers and Control Efficacy in Field

SUN Liguang1， ZHANG Hongchun1， ZHAO Xiuyun1， WANG Rui2， XIANG Bikun2，PENG Wuxing3， SUN Yuxiao3， YIN Zhongchun3， TAN Jun2*
（1. College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China； 2. Enshi Tobacco Company of Hubei Province， Enshi， Hubei 445000， China； 3. Xuanen Tobacco Company of Hubei Province， Xuanen， Hubei 445000， China）

For effective prevention and treatment of bacterial wilt， a variety of antagonistic bacterial agents were added to bio-organic fertilizers and applied to tobacco fields. The effects of composite microbial agents added in the bioorganic fertilizers on tobacco beneficial soil microbes， pathogenic microorganisms， and on bacterial wilt control were studied. The results showed that 30%+70% of the dry tea pulverized tobacco stalks （bio-organic fertilizer C） added with antagonistic bacteria had better colonization， with colonization rate of Bacillus subtilis JK-4 and Bacillus amyloliquefaciens strain JK-10 reached 945.7% and 1970% in the biological organic fertilizer C. The Streptomyces strain LC-7 set in bio-organic fertilizer C with a colonization rate of 496.7 percent. The best prevention of bacterial wilt was obtained with this treatment， with a control effect of 57.40% during the fast growing period of tobacco and a control effect of 37.11% at the peak of incidence of bacterial wilt.

tobacco bacterial wilt； bio-organic fertilizer； Bacillus； Streptomyces； control efficacy

S435.72

1007-5119（2016）04-0048-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2016.04.009

中國(guó)煙草總公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目“基于宏基因組學(xué)的植煙土壤健康評(píng)價(jià)研究與應(yīng)用”（110201402016）；湖北省煙草公司重點(diǎn)項(xiàng)目“煙草秸稈生物有機(jī)肥原料多元化研究與開(kāi)發(fā)”（027Y2015-004）

孫立廣，男，碩士，研究方向?yàn)橥寥牢⑸?。E-mail：18607188382@qq.com。*通信作者，E-mail：1139560054@qq.com

2015-07-16

2016-08-03