曹涵文, 潘雙子, 吳瓏韜, 甘乾福, 石神炳, 梁學(xué)武

(1.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.建陽(yáng)市吉翔牧業(yè)有限公司,福建 南平 354200)

?

大熊貓糞便中纖維素降解菌的鑒定與作用機(jī)理

曹涵文1，2, 潘雙子2, 吳瓏韜2, 甘乾福2, 石神炳3, 梁學(xué)武1，2

(1.國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；3.建陽(yáng)市吉翔牧業(yè)有限公司,福建 南平 354200)

從大熊貓糞便中分離到4株纖維素降解菌，分別命名為NC016612、NC012914、NC021171和NC020990.通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA鑒定，分離的菌株分別為克雷伯菌、類芽孢桿菌、芽孢桿菌和白色鏈霉菌.采用3,5-二硝基水楊酸顯色法對(duì)菌株產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，結(jié)果表明，克雷伯菌、類芽孢桿菌、芽孢桿菌和白色鏈霉菌的酶活性分別為18.642、9.234、23.125和24.732 U·μg-1，類芽孢桿菌、芽孢桿菌和白色鏈霉菌對(duì)纖維素的降解具有協(xié)同作用.

熊貓; 纖維素降解菌; 篩選; 鑒定; 降解機(jī)理

纖維素是自然界中廣泛存在的一類結(jié)構(gòu)性碳水化合物，每年通過(guò)陸生及海洋藻類的光合作用，可產(chǎn)生0.85×1011t纖維素，相當(dāng)于世界總能值消耗的4倍，是地球上蘊(yùn)藏最為豐富的可再生資源之一.纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分,由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的鏈狀高分子化合物.天然的纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，主要由原纖維壓縮、聚合而成[1]，有序的結(jié)晶區(qū)域和無(wú)序的不定區(qū)域組成纖維素結(jié)構(gòu)單元原纖維[2].在有序的結(jié)晶區(qū)域中，分子排列整齊，延展性強(qiáng).在纖維素中不僅存在著分子內(nèi)氫鍵，還存在著分子間氫鍵，在秸稈中纖維被半纖維素和木質(zhì)素包裹并且通過(guò)結(jié)晶結(jié)構(gòu)與之相連，從而導(dǎo)致纖維素的水解與糖化受到顯著的抑制作用[3].影響纖維素水解的因素還包括原材料的多孔性、纖維的結(jié)晶度、木質(zhì)素和半纖維素的含量.當(dāng)今，隨著全球能源與糧食資源的大量消耗，人們迫切希望找到一種將纖維素加以利用的新方法.

大熊貓雖為肉食動(dòng)物，但其食物多以竹筍和竹葉為主，平均每只成年大熊貓每日進(jìn)食竹子量可達(dá)12.5 kg.大熊貓除消化竹子中90%以上的蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還能利用8%的纖維素和27%的半纖維素[4].黃河等[5]研究表明：大熊貓以竹葉為食時(shí)，對(duì)粗蛋白、粗脂肪和半纖維素的消化率分別為61.5%、50.3%和23.3%；而以竹筍為食時(shí)，消化率分別達(dá)71.9%、61.5%和29.6%，大熊貓對(duì)竹筍中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率高于竹葉.大熊貓雖然有著草食性哺乳動(dòng)物的進(jìn)食特點(diǎn)，卻擁有典型的肉食性哺乳動(dòng)物的消化系統(tǒng).從2010年公布的大熊貓基因組序列[6]中可以找到編碼與肉食性動(dòng)物消化系統(tǒng)相關(guān)酶的基因，但編碼纖維素酶的相關(guān)基因卻沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，因此，大熊貓對(duì)纖維素的消化必然要依賴腸道菌群的作用.孫飛龍等[7]研究了不同時(shí)期大熊貓腸道的菌群種類及分布，證明了其腸道對(duì)纖維素的消化需要依靠菌群的協(xié)作.本試驗(yàn)對(duì)大熊貓糞便中的纖維素降解菌進(jìn)行分離鑒定，并對(duì)其產(chǎn)酶特性進(jìn)行研究，旨在探索大熊貓腸道中能夠高效利用纖維素的菌株.

1　材料與方法

1.1樣品的采集

大熊貓糞便采集于福州動(dòng)物園，采集時(shí)去除表面雜質(zhì)，裝入自封袋中并編號(hào).取樣在滅菌的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，將糞樣用滅菌的刀片剖開(kāi)，于中心位置取樣，剩余糞樣置-20 ℃保存.

1.2纖維素降解菌的培養(yǎng)及篩選

纖維素降解菌采用察克貝氏培養(yǎng)基[8]培養(yǎng)，以羧甲基纖維素作為唯一碳源，其主要成分有10 g羧甲基纖維素、0.2 g MgSO4·7H2O、1 g K2HPO4、1 g NH4NO3、0.05 g FeCl3·6H2O、0.02 g CaCl2.將糞樣加到液體培養(yǎng)基中恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，將菌液分別稀釋至10-6、10-7和10-8，并涂布在平板上，于25 ℃倒置培養(yǎng)3 d.取純化后的菌液20 μL滴加到培養(yǎng)基中，待菌落長(zhǎng)出后，用剛果紅染色1 h，然后用1 mol·L-1無(wú)菌生理鹽水浸泡1 h.根據(jù)菌落產(chǎn)生透明水解圈直徑的大小，評(píng)定菌株的產(chǎn)酶能力.

1.3酶活性的檢測(cè)

取10只洗凈并烘干的10 mL試管，按表1所示加入低溫保藏的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，并對(duì)應(yīng)加入不同體積的檸檬酸緩沖液，得到不同含量的葡萄糖檸檬酸混合液.加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴6 min后流水沖洗冷卻，加入1.5 mL蒸餾水定容至5 mL.在波長(zhǎng)540 nm處以1號(hào)管(空白對(duì)照)為基準(zhǔn)，調(diào)儀器零點(diǎn)，測(cè)定不同葡萄糖含量的光密度(D)，結(jié)果如表1所示.以葡萄糖含量為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的D為橫坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線用于后續(xù)酶活性的測(cè)定.將發(fā)酵液于8 000 r·min-1、4 ℃條件下離心20 min，所得到的上清液即為粗酶液.分別以羧甲基纖維素和中性濾紙作為底物進(jìn)行培養(yǎng)，采用3,5-二硝基水楊酸顯色法[9]測(cè)定羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulose enzyme, CMCase)和濾紙酶(filter paper enzyme, FPase)的活性. 酶促反應(yīng)在25 ℃，pH為7的條件下進(jìn)行.酶活性單位(U)定義為：在pH為7，溫度為25 ℃的條件下, 每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol葡萄糖的還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活性單位.將初篩得到的 27 株菌株接種至20 mL的試管中制成菌懸液，然后接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，于25 ℃、150 r·min-1培養(yǎng) 3 d后測(cè)定發(fā)酵液的酶活性.

1.4菌落和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

形態(tài)學(xué)觀察包括細(xì)胞形態(tài)鑒定和菌落形態(tài)鑒定兩類.菌落形態(tài)鑒定主要是了解菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀和邊緣特征等.細(xì)胞形態(tài)鑒定主要是通過(guò)革蘭氏染色[10]，借助顯微鏡對(duì)細(xì)胞的大小、結(jié)構(gòu)、排列方式以及芽孢、鞭毛、細(xì)胞膜等進(jìn)行觀察[11].

1.5菌株的生理生化試驗(yàn)

參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[12]的方法對(duì)細(xì)菌的生理生化特性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定內(nèi)容主要包括糖醇的發(fā)酵試驗(yàn)、淀粉的水解試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)(接觸酶試驗(yàn))、硝酸鹽還原反應(yīng)和pH耐受試驗(yàn)等[13].

1.616S rDNA序列分析

采用試劑盒提取菌液中的DNA,利用微生物的16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[14]對(duì)其16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增.PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD19-T相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞.挑取轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒后進(jìn)行PCR驗(yàn)證[15]，經(jīng)驗(yàn)證確定轉(zhuǎn)入外源細(xì)菌16S rDNA片段的單菌落，最后將轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的已有序列進(jìn)行比對(duì).用NCBI建立遺傳進(jìn)化樹(shù)，確定所選菌株的種屬[16].

1.7菌株產(chǎn)酶條件的測(cè)定

取適量的菌液和液體培養(yǎng)基置于250 mL錐形瓶中進(jìn)行液體發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度、初始pH、接種量和裝液量不變的條件下，設(shè)置不同的培養(yǎng)時(shí)間作為梯度，測(cè)定菌液CMCase活性，并通過(guò)正交試驗(yàn)得出最佳的培養(yǎng)時(shí)間.同樣的方法可以得出，在單因素中達(dá)到最大酶活性時(shí)所需的培養(yǎng)溫度、pH、接種量和裝液量[17].

2　結(jié)果與分析

2.1纖維素降解菌的篩選結(jié)果

從初篩的菌落中選取大而明顯的水解圈所對(duì)應(yīng)的37株菌落，純化后接種在平板上，通過(guò)剛果紅染色及1 mol·L-1NaCl浸泡，發(fā)現(xiàn)有27株具有明顯的透明圈.透明圈效果如圖1所示.

2.2CMCase和FPAase活性的測(cè)定結(jié)果

2.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以葡萄糖含量為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的D為橫坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示.

2.2.2酶活性的測(cè)定結(jié)果CMCase和FPase活性的測(cè)定結(jié)果如表2所示.初篩所得到的菌株，能夠在以羧甲基纖維素為碳源的平板上產(chǎn)生透明圈，但一部分菌株不能很好地利用纖維素這種天然物質(zhì).根據(jù)CMCase和FPAase的活性，選擇生長(zhǎng)旺盛、產(chǎn)酶能力較強(qiáng)的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng).菌株經(jīng)過(guò)多次的傳代培養(yǎng)，其產(chǎn)酶能力依然穩(wěn)定，沒(méi)有呈現(xiàn)出退化跡象.

表2　產(chǎn)纖維素酶菌株的CMCase和FPase活性

2.3菌株的形態(tài)學(xué)觀察

分別將菌株NC016612、NC012914、NC021171和NC020990接種到羧甲基纖維素鈉平板上于30 ℃培養(yǎng)72 h，菌落形態(tài)及革蘭氏染色效果如圖3～6所示.

菌株NC016612菌落呈橢圓形，直徑0.3～6 μm，呈乳白色，邊緣整齊，表面不光滑，中凸，有光澤；革蘭氏染色鑒定呈陰性，短鏈狀排列(圖3).菌株NC012914菌落呈圓球狀，白色，表面不光滑呈毛狀分布，邊緣不整齊，濕潤(rùn)，無(wú)可溶性色素；革蘭氏染色鑒定呈陰性，細(xì)胞呈桿狀(圖4).菌株NC021171菌落呈圓球狀，乳白色，直徑0.5～10 μm，邊緣不規(guī)則，表面不光滑，中凸，無(wú)光澤；革蘭氏染色鑒定呈陽(yáng)性，呈對(duì)或鏈狀排列，具有方端或圓端(圖5).菌株NC020990菌落呈團(tuán)狀，乳白色，邊緣不整齊，外沿透明度較高，且呈現(xiàn)絲狀交錯(cuò)排列，能夠產(chǎn)生水溶性和脂溶性色素；該菌株為放線菌目，有較長(zhǎng)的孢子絲，孢子不運(yùn)動(dòng)，外鞘上常有刺狀或毛發(fā)等狀飾(圖6).

2.4菌株的生理生化特性

2.4.1菌株NC016612的生理生化特性菌株NC016612有莢膜，不運(yùn)動(dòng)，屬于兼性厭氧菌，同時(shí)存在呼吸和發(fā)酵兩種代謝類型，最適生長(zhǎng)溫度為35～37 ℃，最適pH約為7.2.由表3可知：菌株NC016612除不能利用衛(wèi)矛醇外，棉籽糖、麥芽糖、海藻糖、纖維二糖、蜜二糖、乳糖和蔗糖都可作為其生長(zhǎng)繁殖的碳源；能夠很好地利用葡萄糖產(chǎn)酸、產(chǎn)氣，且可以利用葡萄糖作為唯一碳源；氧化酶反應(yīng)呈陰性，V-P反應(yīng)呈陽(yáng)性，能夠利用間-肌醇并能與尿素發(fā)生水解反應(yīng)，不產(chǎn)生鳥(niǎo)氨酸脫羧酶，硫化氫反應(yīng)呈陰性.初步鑒定該菌株為克雷伯菌.

表3　菌株NC016612的生理生化特性1)

1)+表示≥90%的菌株呈陽(yáng)性；-表示≥90%的菌株呈陰性.

2.4.2菌株NC012914的生理生化特性菌株NC012914周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)，屬于兼性厭氧菌或嚴(yán)格好氧菌.由表4可知：菌株NC012914能夠利用各種糖類產(chǎn)酸，接觸酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，而氧化酶反應(yīng)則呈陰性，不能產(chǎn)生吲哚，硝酸鹽反應(yīng)呈陰性，不能利用檸檬酸鹽、琥珀酸鹽，但能利用乙酸鹽；不能利用淀粉和尿素，酪酸反應(yīng)呈陽(yáng)性；在pH為5.6的條件下，菌株能夠生長(zhǎng)；在50 ℃高溫條件下菌株死亡；耐鹽性較好，溶菌酶反應(yīng)呈陰性.初步鑒定該菌株為類芽孢桿菌.

表4　菌株NC012914的生理生化特性1)

1)+表示≥90%的菌株呈陽(yáng)性；-表示≥90%的菌株呈陰性.

2.4.3菌株NC021171的生理生化特性菌株NC021171能夠產(chǎn)生芽孢，周生鞭毛，運(yùn)動(dòng)，屬于化能異養(yǎng)菌，具有發(fā)酵或呼吸兩種代謝類型.由表5可知：菌株NC021171能夠利用D-葡萄糖，但不產(chǎn)氣；能夠利用酪朊、明膠和淀粉，不能利用檸檬酸鹽和丙酸鹽；酪氨酸水解反應(yīng)、苯丙氨酸脫氨酶和卵黃卵磷脂酶反應(yīng)均呈陰性；硝酸鹽還原反應(yīng)呈陽(yáng)性；生長(zhǎng)、繁殖的溫度為10～30 ℃,在高于30 ℃的條件下，該菌株生長(zhǎng)受限；接觸酶和V-P反應(yīng)均呈陽(yáng)性.初步鑒定該菌株為芽孢桿菌.

2.4.4菌株NC020990的生理生化特性菌株NC020990屬于放線菌，其最適生長(zhǎng)溫度為25～44 ℃，耐堿不耐酸.由表6可知，從碳源的利用情況來(lái)看，菌株NC020990能夠利用D-葡萄糖、D-木糖、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露醇和蔗糖，能夠使明膠液化，但不能水解淀粉，分解葡萄糖不產(chǎn)酸.初步鑒定該菌株為鏈霉菌.

表5　菌株NC021171 的生理生化特性1)

1)+表示≥90%的菌株呈陽(yáng)性；-表示≥90%的菌株呈陰性.

表6　菌株NCNC020990的生理生化特性1)

1)+表示≥90%的菌株呈陽(yáng)性；-表示≥90%的菌株呈陰性.

2.5菌株的遺傳進(jìn)化樹(shù)

采用試劑盒提取菌株DNA，以27F和1492R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，菌株NC016612、NC012914、NC021171和NC020990通過(guò)PCR擴(kuò)增16S rDNA片段的長(zhǎng)度均約為1 500 bp(圖7).采用臨近序列分析法構(gòu)建菌株的遺傳進(jìn)化樹(shù)，每個(gè)菌株均選取親緣關(guān)系最近的20個(gè)菌株序列進(jìn)行比較.結(jié)果(圖8)顯示，菌株NC016612屬于克雷伯菌屬，與克雷伯菌菌株KCTC染色體的同源性為98%；圖9顯示，菌株NC012914屬于類芽孢桿菌屬，與類芽孢桿菌菌株JDR-2的同源性為96%；圖10顯示，菌株NC021171屬于芽孢桿菌屬，與芽孢桿菌菌株INLA3E的同源性為97%；圖11顯示，菌株NC020990屬于白色鏈霉菌，與白色鏈霉菌菌株A3(2)的同源性為99%.

2.6纖維素降解菌的酶活性

在最適的培養(yǎng)條件下，4株纖維素降解菌的CMCase活性如表7所示.

3　討論

大熊貓以竹葉等高纖維物質(zhì)為食，卻具有典型的肉食類動(dòng)物的消化系統(tǒng)，近年來(lái)也報(bào)道過(guò)大熊貓捕捉小型哺乳動(dòng)物為食的案例，但肉食動(dòng)物的消化系統(tǒng)對(duì)高纖維類物質(zhì)難以消化利用.Zhu et al[18]對(duì)野生大熊貓腸道菌群的宏觀基因組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)編碼纖維素和半纖維素酶的基因，該研究結(jié)果在分子水平上為大熊貓利用腸道微生物消化竹子中的纖維素和半纖維素提供了證據(jù).

表7　最適培養(yǎng)條件下菌株的CMCase活性

研究發(fā)現(xiàn)，大熊貓腸道菌群主要由厚壁菌門的芽胞桿菌綱和梭菌綱細(xì)菌組成.大熊貓消化道短、進(jìn)食時(shí)間長(zhǎng)、腸道蠕動(dòng)快等原因造成其腸道內(nèi)環(huán)境氧成分含量較高，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)大熊貓腸道菌群的研究主要集中在克雷伯桿菌、大腸埃希氏菌和空腸彎曲桿菌等致病菌[19]以及這些致病菌對(duì)大熊貓生理和病理方面的影響.Zhu et al[18]通過(guò)富集培養(yǎng)的方法獲得了具有降解纖維素能力的梭菌屬菌株P(guān)D-2，該研究在菌種篩選時(shí)，專一性地采用了厭氧培養(yǎng)的方式，發(fā)現(xiàn)以梭菌屬為代表的厭氧纖維素分解菌對(duì)纖維素底物具有較強(qiáng)的粘附作用，并且能夠發(fā)酵纖維素和纖維二糖生成乙醇、乙酸、H2和CO2等產(chǎn)物，但由于大熊貓腸道較短，含氧量比其他哺乳動(dòng)物高的實(shí)際生理環(huán)境下[20]，嚴(yán)格厭氧細(xì)菌的生長(zhǎng)和定植受到限制，從而有利于以芽胞桿菌屬為代表的好氧或兼性厭氧菌的定植.

本試驗(yàn)從福州熊貓基地健康大熊貓的糞便中分離到4株纖維素降解菌，其中，菌株NC020990(白色鏈霉菌)、NC021171(芽孢桿菌)、NC016612(克雷伯菌)和NC012914(類芽孢桿菌)在最適培養(yǎng)條件下的CMCase活性分別為24.732、23.125、18.642和9.234 U·μg-1，并首次從大熊貓糞便中篩選出白色鏈霉菌，其具有較強(qiáng)的降解纖維類物質(zhì)的能力.

[1] FAN L T, LEE Y H, BEARDMORE D H. Major chemical and physical features of cellulose materials as substrates for enzymatic hydrolysis [J]. Adv Biochem Eng Biotech,1980,14:101-105.

[2] 雷恒毅,王春銘.城市污泥堆肥高溫菌群的篩選、特性與應(yīng)用研究[D].廣州:中山大學(xué),2006.

[3] MCMILLAN J D. Pretreatment of lignocellulosic biomass [M]∥HIMMEL M E, BAKERJ O, OVEREND R P. Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production. Washington, DC: American Chemical Society, 1994:292-324.

[4] 樊程,李雙江,李成磊,等.大熊貓腸道纖維素分解菌的分離鑒定及產(chǎn)酶性質(zhì)[J].微生物學(xué)報(bào),2012,52(9):1 113-1 121.

[5] 黃河,張志和,侯蓉.糞樣在大熊貓研究上的應(yīng)用[J].動(dòng)物學(xué)雜志,2012,47(6):156-163.

[6] LI R Q, FAN W, TIAN G, et al. The sequence anddenovoassembly of the giant panda genome [J]. Nature, 2010,463:311-317.

[7] 孫飛龍,劉敬賢,席丹,等.大熊貓腸道疾病致病菌[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2002,6(2):20-23.

[8] 付麗麗.作物秸稈纖維素降解菌的分離與篩選[D].杭州:浙江大學(xué),2012.

[9] 胡國(guó)全,鄧宇,徐恒,等.極端嗜熱厭氧纖維素菌的分離、鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及其酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào),2004,10(2):197-201.

[10] 孫紀(jì)全,黃星,何健,等.異丙隆降解菌Y57的分離鑒定及其降解特性[J].中國(guó)環(huán)境科學(xué),2006,26(3):315-319.

[11] 周生飛.高效降解棉酚菌種篩選、降解機(jī)理及固體發(fā)酵工藝研究[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[12] 布坎南 R E.伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,1988.

[13] 解林奇.多菌靈降解菌系篩選、組成分析及其降解效果[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2012.

[14] BAKER G C, SMITH J J, COWAN D A. Reviewandre-analysis of domain-specific 16S primers [J]. Journal of Microbiological Methods, 2003,55(3):541-555.

[15] 呂莉華.瘤胃纖維素降解菌Real-Time PCR熒光定量方法的建立及其初步應(yīng)用[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[16] 孫一博.高效纖維素降解菌的篩選鑒定及特性研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2013.

[17] 張曉輝,郭春華,江曉霞.飼用木聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選及部分酶學(xué)性質(zhì)的研究[J].獸藥與飼料添加劑,2007,12(2):4-6.

[18] ZHU L F, WU Q, DAI J Y, et al. Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome [J]. PNAS, 2011,108:17 714-17 719.

[19] SUN F L, LIU J X, XI D, et al. Pathogens of intestinal diseases in giant panda [J]. J Econ Anim, 2002,6(2):20-23.

[20] 張志和,何光昕,王行亮,等.大熊貓腸道正常菌群的研究[J].獸類學(xué)報(bào),1995,15(3):170-175.

(責(zé)任編輯:施曉棠)

Identification and mechanism of cellulose-degradation bacteria from panda′s excrement

CAO Hanwen1，2, PAN Shuangzi2, WU Longtao2, GAN Qianfu2, SHI Shenbing3, LIANG Xuewu1，2

(1.National Engineering Research Center of Juncao Technology, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.College of Animal Science and Technology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002,China; 3.Jixiang Graziery Limited Company in Jianyang, Nanping, Fujian 354200, China)

To screen intestinal bacteria that effectively digest high-cellulose foodstuff that the giant panda routinely feed on, 4 kinds of bacteria were isolated from the excrements, and were tentatively named as NC016612, NC012914, NC021171, NC020990. Subsequent morphology observation, physiological and biochemical analysis, and 16S rDNA identification indicated that 4 strains belonged to klebsiella, paenibacillus, bacillus, streptomyces albus, respectively. Then enzyme activities of strains under optimal production condition were detected by 3, 5-2 nitro salicylic acid method. The results showed that the enzyme activities were 18.642, 9.234, 23.125, 27.732 U·μg-1for klebsiella, paenibacillus, bacillus, streptomyces albus, respectively, and paenibacillus, bacillus, streptomyces albus interacted synergistically to degrade cellulose.

the giant panda; cellulose-degradation bacteria; screening; identification; degradation mechanism

2015-05-24

2015-07-04

福建省2011計(jì)劃項(xiàng)目(K80DN8002)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD15B01).

曹涵文(1989-)，男，碩士研究生.研究方向：反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng).Email：751261399@qq.com.通訊作者梁學(xué)武(1960-)，男，研究員，碩士生導(dǎo)師.研究方向：反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與現(xiàn)代奶(肉)牛生產(chǎn).Email：faulxw2000@163.com.

Q93-3

A

1671-5470(2016)03-0302-08

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2016.03.011