晁生玉，張才駿，張居農(nóng)

(1.青海省海西動(dòng)物疫控中心，青海 德令哈 817099；2.青海大學(xué)，西寧 810016；3.石河子大學(xué)，832000)

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青海省果洛藏獒血液乳酸脫氫酶同工酶酶譜的研究

晁生玉1，張才駿2，張居農(nóng)3

(1.青海省海西動(dòng)物疫控中心，青海 德令哈 817099；2.青海大學(xué)，西寧 810016；3.石河子大學(xué)，832000)

采用聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳法對(duì)青海省果洛州39 只藏獒的血清乳酸脫氫酶(S-LDH)和紅細(xì)胞乳酸脫氫酶(RBC-LDH)同工酶酶譜及其多態(tài)性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1)被檢藏獒的S-LDH 經(jīng)電泳可分離出S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3、S-LDH4 和S-LDH5等5條區(qū)帶，呈現(xiàn)出S-LDH1A(20.51%)和S-LDH1a(79.49%)兩種電泳表型而表現(xiàn)出多態(tài)性；2)RBC-LDH 經(jīng)電泳可分離出RBC-LDH1、RBC-LDH2和RBC-LDH3等3條區(qū)帶，呈現(xiàn)出RBC-LDH2A(43.24%)和RBC-LDH2a(56.76%)兩種電泳表型；3)S-LDH同工酶5條區(qū)帶的相對(duì)電泳遷移率分別為53.0%、40.8%、25.5%、9.5%和3.8%。

藏獒；血清乳酸脫氫酶；紅細(xì)胞乳酸脫氫酶；同工酶

藏獒(Tibetan mastiff)是青藏高原一種特有的古老珍貴犬種，也是被公認(rèn)的惟一不懼怕暴力的犬種。因其對(duì)高原低氧、干旱、寒冷多變的氣候有極強(qiáng)的適應(yīng)性，且體大、兇悍、忠于主人以及護(hù)家性能強(qiáng)而深受廣大牧民群眾的喜愛，享有“東方神犬”的美稱，由此引起了國內(nèi)外許多學(xué)者的關(guān)注。

近年來，有關(guān)藏獒的生物學(xué)特性、繁殖性能、疾病防治方面的報(bào)道明顯增加[1～4]。有關(guān)藏獒的血液學(xué)特性也有頗多報(bào)道，如晁生玉等對(duì)青海省德令哈藏獒的血液生化指標(biāo)[5]，李動(dòng)等對(duì)果洛藏獒血清蛋白質(zhì)指標(biāo)[6]，鮑林等對(duì)青海藏獒的血鉀濃度進(jìn)行了研究[7]。LDH 是動(dòng)物體內(nèi)參與糖酵解的重要酶類，國內(nèi)外學(xué)者對(duì)各種家畜LDH 同工酶酶譜進(jìn)行了廣泛深入的研究，而晁生玉曾經(jīng)對(duì)德令哈藏獒的血液乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)同工酶酶譜[8]做過研究，但目前尚未見青海省果洛州藏獒血液LDH 同工酶酶譜方面的資料。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)果洛州藏獒的血清LDH 和紅細(xì)胞LDH 同工酶酶譜進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藏獒

選用青海省果洛州瑪沁縣牧民自繁的藏獒 39只，其中公藏獒 22只，母藏獒17 只，臨床健康，營養(yǎng)良好。實(shí)驗(yàn)用藏獒生活地的海拔高度在3 600～4 200 m。

1.2血樣的采集與處理

將藏獒側(cè)臥保定，剪毛消毒后，從其后肢外側(cè)小隱靜脈采取肝素鈉抗凝血和非抗凝血各3 mL，非抗凝血迅速送實(shí)驗(yàn)室分離出血清，供血清LDH(S-LDH)同工酶酶譜分析。抗凝血經(jīng)3 000 r/min 離心后傾去血漿，沉淀的紅細(xì)胞用0.154 mol/L(0.9%)氯化鈉溶液洗滌3 次，洗凈的紅細(xì)胞加入2 倍量蒸餾水，使紅細(xì)胞溶解，再次離心后制成透明紅色的紅細(xì)胞溶血液，供紅細(xì)胞LDH(RBC-LDH)同工酶酶譜分析。

1.3電泳

采用聚丙烯酰胺凝膠(PAG)垂直平板電泳法進(jìn)行 LDH 同工酶酶譜的分析。電泳時(shí)，分離膠濃度為60 g/L，用pH 8.9 的Tris-HCl 緩沖液配制，濃縮膠濃度為30 g/L，用pH 6.7 的Tris-HCl 緩沖液配制，電泳槽內(nèi)采用pH 8.3Tris-Gly 緩沖液。電泳時(shí)所用其他試劑按方丁等[9]描述的方法配制。電泳時(shí)使用DY-W2 型電泳儀(北京生化儀器廠出品)，DY-Ⅲ22A電泳槽(北京六一儀器廠出品)。電泳起始電流為15 mA，20 min 后增至25 mA，穩(wěn)流電泳5 h。

1.4孵育與顯色

電泳膠板在 37 ℃水浴條件下孵育，孵育液按方丁等[9]描述的方法配制。經(jīng)50～60 min，待紫色區(qū)帶清晰可見時(shí)，傾去孵育液，用蒸餾水沖洗電泳膠板后，在1.23 mol/L(7%)冰乙酸溶液中漂洗至膠板的背景呈無色為止。

1.5遷移率測(cè)定

用相對(duì)遷移率(Rf)表示，按張才駿等[10]記載的方法進(jìn)行，即區(qū)帶移動(dòng)距離(d)與指示線移動(dòng)距離(D)之比(Rf=d/D)。

2　結(jié)果

2.1S-LDH 同工酶酶譜

被檢藏獒的 S-LDH 全部由5條同工酶區(qū)帶組成，從陽極到陰極依次為S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3、S-LDH4 和S-LDH5。各同工酶區(qū)帶的Rf：S-LDH1 為53.0%，S-LDH2 為40.8%，S-LDH3 為25.5%，S-LDH4 為9.5%和S-LDH5 為3.8%。

2.2S-LDH 的多態(tài)性

根據(jù) S-LDH 同工酶區(qū)帶著染強(qiáng)度，果洛藏獒的 S-LDH1 同工酶存在高活性的S-LDH1A 和低活性的S-LDH1a 兩種表型而表現(xiàn)出多態(tài)性(見圖1)。8 只果洛藏獒的S-LDH1 同工酶為高活性者，占20.5%(8/39)，31 只果洛藏獒的S-LDH1 為低活性者，占79.5%(31/39)。

2.3RBC-LDH 同工酶酶譜

被檢藏獒的 RBC-LDH 全部由3條同工酶區(qū)帶組成，從陽極到陰極依次為RBC-LDH1、RBC-LDH2 和RBC-LDH3。它們的Rf 分別與S-LDH1、S-LDH2、S-LDH3 相當(dāng)。在3種同工酶中以RBC-LDH1 的染色強(qiáng)度最強(qiáng)(見圖1)。

2.4RBC-LDH 的多態(tài)性

根據(jù) RBC-LDH 同工酶區(qū)帶著染強(qiáng)度，果洛藏獒的 RBC-LDH2同工酶存在高活性的RBC-LDH2A 和低活性的RBC-LDH2a 兩種電泳表型而表現(xiàn)出多態(tài)性。16 只藏獒為高活性的RBC-LDH2A 型，其RBC-LDH2 區(qū)帶濃染且寬，占43.24%(16/37)，21 只藏獒為低活性的RBC-LDH2a 型，其RBC-LDH2 區(qū)帶淡染且窄，占56.76%(21/37)。

藏獒 S-LDH和 RBC-LDH電泳模式圖1.RBC-LDH2A 型：2.RBC-LDH2a 型；3.S-LDH1a 型；4.S-LDH1A 型。

3　討論

3.1關(guān)于 S-LDH 同工酶

據(jù)報(bào)道[9]，動(dòng)物的 S-LDH 從陽極到陰極通常有 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和LDH5 五種同工酶。由于動(dòng)物的種類不同，每種同工酶的比例可能有所差別。有關(guān)犬的 S-LDH，袁忠濱等[10]采用醋酸纖維素薄膜電泳法對(duì)新疆土種犬的 S-LDH 活性及其同工酶進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)犬的S-LDH 也由 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4 和 LDH5 五種同工酶組成，五種同工酶的活性從高到低依次為LDH5、LDH1、LDH2、LDH3 和LDH4。晁生玉等[8]對(duì)德令哈藏獒 S-LDH 的研究也發(fā)現(xiàn)，藏獒的 S-LDH 同樣由 LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5五種同工酶組成。S-LDH同工酶的活性從高到低依次為LDH3、LDH1、LDH2、LDH4 和LDH5。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)果洛藏獒的S-LDH 也由五種同工酶組成。從區(qū)帶的著染強(qiáng)度來看，各種 S-LDH 同工酶活性的排序與晁生玉等[8]的排序相同。

3.2RBC-LDH 同工酶

據(jù)Серов等[11]在綿羊、Yegorov 等[12]在卡拉庫爾羊和希薩羊以及張才駿等[13，14]在藏羊和青海細(xì)毛羊中的的研究結(jié)果，綿羊的RBC-LDH 具有多態(tài)性，并證實(shí)它們受常染體位點(diǎn)一對(duì)共顯性等位基因的控制。張才駿等[15]還發(fā)現(xiàn)牦牛的RBC-LDH 也存在多態(tài)性。晁生玉等[8]對(duì)德令哈藏獒RBC-LDH 的研究發(fā)現(xiàn)，藏獒的RBC-LDH 同工酶也存在多態(tài)性，但其多態(tài)性出現(xiàn)在RBC-LDH2 同工酶中，即存在高活性的RBC-LDH2A(57.89%)和低活性的RBC-LDH2a(42.11%)兩種表型而表現(xiàn)出多態(tài)性，以RBC-LDH2A為優(yōu)勢(shì)表型。本實(shí)驗(yàn)對(duì)果洛藏獒RBC-LDH 的研究結(jié)果與晁生玉等[8]對(duì)德令哈藏獒RBC-LDH的研究結(jié)果相同，也存在高活性的RBC-LDH2A(43.24%)和低活性的RBC-LDH2a(56.76%)兩種表型而表現(xiàn)出多態(tài)性，但以RBC-LDH2a 為優(yōu)勢(shì)表型。然而，經(jīng)χ2 檢驗(yàn)，果洛藏獒的RBC-LDH2 的表型頻率與德令哈藏獒的沒有顯著的差異(P>0.05)。但藏獒RBC-LDH2 多態(tài)性的遺傳規(guī)律尚待進(jìn)一步加以研究證實(shí)。

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2016-05-26

晁生玉(1966-)，男，畜牧師。

E-mail：csy@163.com

張居農(nóng)(1954-)，男，教授。

E-mail：zjnprof@sina.com

S829.2

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1005-2739(2016)05-0016-04