李海霞，夏正明，張金玉，郭新宇，鄧偉民，夏薇，盛立紅

（1.廣州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州　510180；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東廣州　510260；3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州　510010）

益氣血補(bǔ)肝腎方對(duì)胚胎著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3和胞飲突表達(dá)的影響

李海霞1，夏正明2，張金玉3，郭新宇3，鄧偉民3，夏薇1，盛立紅1

（1.廣州市第一人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州510180；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東廣州510260；3.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東廣州510010）

【目的】觀察中藥益氣血補(bǔ)肝腎方對(duì)胚胎著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3表達(dá)的影響，探討其改善胚胎著床的分子基礎(chǔ)?！痉椒ā繉?0只雌鼠隨機(jī)分為正常組、模型組和治療組3組，每組30只，其中，治療組小鼠予以中藥益氣血補(bǔ)肝腎方治療（包括經(jīng)后增殖方8 mg/kg和促黃體方8 mg/kg），在妊娠第4天（Pd4）上午8∶00采用米非司酮誘導(dǎo)模型組和治療組小鼠胚胎著床障礙，12 h后處死小鼠（每組20只），剖腹取小鼠子宮，小心刮取子宮內(nèi)膜，采用Real-time PCR和Western Blot的方法分別在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)整合素β3在各組小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況。其余小鼠（每組10只）于Pd4剖腹取小鼠子宮，固定于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中，行掃描電鏡觀察?！窘Y(jié)果】Real-time RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示：模型組整合素β3 mRNA與蛋白表達(dá)顯著低于正常組（P＜0.05）；治療組可顯著升高整合素β3 mRNA與蛋白表達(dá)水平，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。胞飲突在模型組中的表達(dá)少于治療組和正常組，而胞飲突在治療組和正常組的表達(dá)相似。【結(jié)論】中藥益氣血補(bǔ)肝腎方可上調(diào)子宮內(nèi)膜中整合素β3的表達(dá)，對(duì)胞飲突在Pd4小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)有正調(diào)節(jié)作用。

益氣血補(bǔ)肝腎方；整合素β3；胞飲突；子宮內(nèi)膜容受性；胚胎著床；子宮/超微結(jié)構(gòu)；疾病模型，動(dòng)物；小鼠

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，受精率逐漸提高，而胚胎的著床率和臨床妊娠率卻長(zhǎng)期得不到很好的提高。胚胎著床的低效性使助孕技術(shù)的發(fā)展進(jìn)入了“瓶頸期”，影響了輔助生殖技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，胚胎著床是影響不孕癥患者治療結(jié)局的重要環(huán)節(jié)［1］。眾所周知，著床期子宮內(nèi)膜容受性的建立是影響胚胎種植率和臨床妊娠率的一個(gè)重要因素［2］。近年來(lái)，中醫(yī)中藥在輔助生殖技術(shù)中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，并在實(shí)際的臨床工作中逐漸顯現(xiàn)出成效［3］。本研究通過(guò)建立著床障礙的小鼠模型，觀察中藥益氣血補(bǔ)肝腎方對(duì)著床障礙小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜整合素β3和胞飲突表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明益氣血補(bǔ)肝腎方改善子宮內(nèi)膜容受性以促進(jìn)胚胎著床的分子基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　材料和方法

1.1主要藥物、試劑與儀器益氣血補(bǔ)肝腎方（包括經(jīng)后增殖方和促黃體方），由廣東一方制藥廠生產(chǎn)。其中，經(jīng)后增殖方（批號(hào)：Q1201005）含有：炙甘草6 g、黨參15 g、當(dāng)歸6 g、川芎6 g、白芍12 g、白術(shù)12 g、茯苓12 g、菟絲子15 g、熟地黃12 g、杜仲15 g、鹿角霜10 g、山萸肉10 g、川椒3 g，煎成20 mL，制成顆粒劑10 g，相當(dāng)于生藥量134 g；促黃體方（批號(hào)：Q1203026）含有：熟地黃15 g、山藥15 g、枸杞子15 g、山萸肉10 g、菟絲子15 g、鹿角膠10 g、龜板12 g、黨參15 g、白術(shù)15 g、扁豆15 g、薏苡仁15 g、茯苓15 g，煎成20 mL，制成顆粒劑10 g，相當(dāng)于生藥量167 g；將米非司酮片（湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：150703）碾碎，溶解于丙二醇（國(guó)產(chǎn)分析純）中，配成濃度為0.8 mg/mL的懸混液。整合素β3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó) Abcam公司（批號(hào)：ab75872）；整合素β3引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成。ABI PRISM7900熒光定量PCR儀為美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2動(dòng)物模型復(fù)制［4-5］及處理SPF級(jí)昆明小鼠，雌性小鼠未交配，雄性小鼠證明有生育能力，鼠齡6～8周，體質(zhì)量20～25 g，由本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：0060092/0060933。雌雄分籠飼養(yǎng)，小鼠被適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，進(jìn)入實(shí)驗(yàn)階段，自然光照，自由取水和攝食。將符合條件的雌鼠隨機(jī)分為3組：正常組、模型組和治療組，每組30只。每日17∶00按雌雄比2∶1合籠，次日晨8∶00檢查雌鼠陰栓，發(fā)現(xiàn)陰栓者記為妊娠第1天（Pd1），依次計(jì)算妊娠天數(shù)。從進(jìn)入實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，治療組每日上午給予經(jīng)后增殖方灌胃（劑量為8 mg/kg），從Pd1開(kāi)始，改為促黃體方灌胃（劑量為8 mg/kg）。正常組和模型組則灌服等體積生理鹽水。于Pd4 8∶00在治療組和模型組小鼠頸背部皮下注射米非司酮0.1 mL/只（0.8 mg/mL），正常組則注射等容積丙二醇。12 h后將小鼠60只（每組20只）頸椎脫臼處死小鼠，剖腹取小鼠子宮，小心剝離子宮內(nèi)膜，須在解剖顯微鏡下剔除著床點(diǎn)胚胎；然后刮取蛻膜化的子宮內(nèi)膜，立即放入事先經(jīng)高壓消毒的微量離心管（Eppendorf，EP）中。每只小鼠的子宮內(nèi)膜裝進(jìn)1個(gè)EP管，－80℃保存?zhèn)溆谩Ｆ溆嘈∈?0只（每組10只），于Pd4剖腹取小鼠子宮，以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，縱形剖開(kāi)，固定于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中，行掃描電鏡檢查。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)

1.3.1總RNA提取常規(guī)Trizol法提取總RNA，按說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。各組小鼠子宮內(nèi)膜總RNA以一定比例稀釋，在紫外分光光度計(jì)上檢測(cè)其純度，D260/D280比值為1.8～2.0。各組總RNA保存于－70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)采用逆轉(zhuǎn)錄酶合成整合素β3 cDNA第一鏈。反應(yīng)體系：總體系20 μL。取RNA模板1 μL于微量離心管中，依次加入5×RT Buffer 4 μL，脫氧核糖核酸三磷酸（dNTP）mix 2 μL，Oligo（dT）181 μL，RiboLockTMRnaseInhibitor1μL，ReverTra Ace 1 μL，加Rnase free water至20 μL，輕混勻，稍離心。反應(yīng)條件：65℃、5min，42℃、60 min，70℃、10 min。所得cDNA第一鏈保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)整合素β3 mRNA的表達(dá)將逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA按1∶10稀釋，依次加入以下反應(yīng)體系：SYBR Green Qpcr SuperMix-UDC 5 μL，F(xiàn)orward primer 0.2 μL，Reverse primer 0.2 μL，焦碳酸二乙酯（DEPC）-treated water 2.6 μL，cDNA 2 μL。引物序列：整合素β3引物：上游引物5'-TTCAATGCCACCTGCCTCAA-3'，下游引物5'-CCTTGGCCTCGATACTAAAGCTCA-3' （100 bp）；內(nèi)參照 β-actin引物：上游 5'-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3'，下游5'-TCG GGG CAT CGG AAC CGC TCA-3'（404 bp）。PCR反應(yīng)條件為：50℃、2 min，滅活UTG活性，95℃、10 min，酶熱啟動(dòng)，95℃、15 s變性，60℃、1 min，退火及延伸，35個(gè)循環(huán)。根據(jù)各組樣品的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的循環(huán)數(shù)（Ct值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣本的模板拷貝數(shù)。以整合素β3 mRNA/β-actin mRNA的拷貝數(shù)之比值（p）表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4免疫印跡分析法將適量小鼠子宮內(nèi)膜組織置于勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。加入含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的三去污裂解液400 μL于勻漿器中冰上勻漿，并重復(fù)碾磨，使組織盡量碾碎；裂解30 min后，用移液器將裂解液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中；然后在4℃下12 000 r/min，離心5 min，取上清提取蛋白。用考馬斯亮蘭法測(cè)定蛋白濃度后，各組樣品（分別取50 μg蛋白），以100 mg/L十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，350 mA進(jìn)行恒流電轉(zhuǎn)移1 h，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜（PVDF膜）上。再根據(jù)濾膜面積以0.1 mL/cm2的量加入含50 g/L脫脂奶粉的 Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBST，含體積分?jǐn)?shù)0.1%Tween-20）封閉，室溫1 h。加入用50 g/L脫脂奶粉的TBST稀釋的一抗，室溫振搖，與膜共同孵育1 h，然后4℃過(guò)夜（兔抗整合素β3單克隆抗體濃度為1∶200，兔抗β-actin單克隆抗體濃度為1∶500）。洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，與膜共同孵育1 h，室溫振搖（兔抗鼠多克隆抗體濃度為1∶1 000、羊抗兔多克隆抗體濃度為1∶3 000），充分洗滌后采用電化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影曝光。用Bio-Rad圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行光密度掃描，然后用Quantity One軟件進(jìn)行分析，以整合素β3/β-actin相對(duì)光密度值（p）作為整合素β3蛋白的相對(duì)表達(dá)值。

1.5掃描電鏡觀察子宮內(nèi)膜胞飲突各組小鼠于Pd4剖腹取子宮，PBS沖洗，縱形剖開(kāi)，固定于體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液中，行掃描電鏡觀察小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突的表達(dá)。

1.6統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)法；組內(nèi)均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1結(jié)果顯示：模型組Pd4整合素β3 mRNA表達(dá)顯著低于正常組（P＜0.05）；治療組可顯著升高整合素β3 mRNA表達(dá)水平，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1　各組小鼠Pd4子宮內(nèi)膜中整合素β3 mRNA的表達(dá)比較Figure 1　Endometrial integrin β3 mRNA expression level in the mice of different groups on Pd4?。ā纒，N=3）

2.2各組免疫印跡結(jié)果圖2、圖3結(jié)果顯示：模型組整合素β3蛋白表達(dá)較正常組顯著降低（P＜0.05）；治療組可顯著升高整合素β3蛋白表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2　各組整合素β3蛋白表達(dá)凝膠電泳圖Figure 2　Endometrial integrin β3 protein expression level in the mice of different groups detected by gel electrophoresis

圖3　各組小鼠Pd4子宮內(nèi)膜中整合素β3蛋白的表達(dá)比較Figure 3　Gel electrophoresis results of endometrial integrin β3 protein expression in the mice of different groups on Pd4?。ā纒，N=3）

2.3胞飲突在各組小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)圖4結(jié)果顯示：胞飲突在模型組中的表達(dá)少于治療組和正常組，而胞飲突在治療組和正常組的表達(dá)相似。提示益氣血補(bǔ)肝腎方對(duì)胞飲突在Pd4小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)有正調(diào)節(jié)作用，可改善子宮內(nèi)膜容受性，促進(jìn)胚胎著床。

3　討論

3.1整合素β3、胞飲突與子宮內(nèi)膜容受性胚胎著床是許多物種生殖過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。成功的著床需具備有接受性的子宮內(nèi)膜、正常并具有發(fā)育潛能的胚胎以及母—胎界面的對(duì)話。在胚胎著床的窗口期，子宮在一個(gè)極短的時(shí)期允許胚胎著床，在人類，這一時(shí)期相當(dāng)于月經(jīng)周期的第20～24天，即子宮在這一特定時(shí)期對(duì)胚胎具有接受性。子宮內(nèi)膜容受性的建立是其中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)［6］。

圖4　各組Pd4小鼠子宮內(nèi)膜胞飲突表達(dá)比較（掃描電鏡，×5 000）Figure 4　Observation of the formation of pinopodes in mice endometrium of different groups at Pd4 under scanning electron microscope（×5 000）

整合素分子是一組由多種跨膜糖蛋白受體組成的家族，廣泛存在于細(xì)胞表面，可介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及細(xì)胞與細(xì)胞之間的粘附，并參與細(xì)胞內(nèi)外信息傳遞。研究［7］證實(shí)，整合素β3在子宮內(nèi)膜的表達(dá)呈高度時(shí)空特異性，分泌中晚期，表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮，此時(shí)恰與人植入窗期一致，子宮內(nèi)膜容受性最佳。Lessey等［8］研究發(fā)現(xiàn)，整合素β3在著床窗的出現(xiàn)與子宮內(nèi)膜孕激素受體（PR）表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)。國(guó)外學(xué)者通過(guò)對(duì)66名婦女接受體外受精與胚胎移植（IVF-ET）前后子宮內(nèi)膜行整合素β3檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)IVF-ET術(shù)后妊娠的婦女子宮內(nèi)膜整合素β3的表達(dá)顯著高于非妊娠組。提示種植窗期子宮內(nèi)膜整合素β3表達(dá)減少所導(dǎo)致的子宮內(nèi)膜容受性低下，是IVF-ET失敗的原因之一［9］。胚胎和子宮內(nèi)膜的同步發(fā)育與相互協(xié)調(diào)對(duì)于胚胎的植入是至關(guān)重要的。其中子宮內(nèi)膜容受性是一個(gè)關(guān)鍵性的因素。Srinivasan等［10］采用免疫組織化學(xué)、免疫細(xì)胞化學(xué)及流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)整合素β3在小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了整合素β3是子宮內(nèi)膜容受性的標(biāo)志，并且是胚胎著床過(guò)程中所不可缺少的。Lessey等［8］認(rèn)為，整合素有助于子宮內(nèi)膜由非粘附到粘附狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，為胚泡的粘附、植入做準(zhǔn)備。此外，植入期滋養(yǎng)層的侵入性受整合素表達(dá)或分布的影響。認(rèn)為整合素β3除影響子宮內(nèi)膜容受性外，還能決定胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入能力。整合素的異常表達(dá)與子宮內(nèi)膜容受性缺陷有關(guān)。更為特異的是，經(jīng)治療后最終成功妊娠的患者在分泌期整合素β3的表達(dá)顯著增高，支持整合素β3作為子宮內(nèi)膜容受性分子標(biāo)記一說(shuō)［11］。

胞飲突（pinopode）是在掃描電子顯微鏡（scanning electronic microscopy，SEM）下可見(jiàn)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞表面大而平滑的泡狀突起，由Nelson首先在小鼠子宮內(nèi)發(fā)現(xiàn)。有研究證實(shí)，胞飲突出現(xiàn)的時(shí)間與“種植窗”出現(xiàn)的時(shí)間相吻合，且表達(dá)在囊胚著床的部位，參與了胚胎著床的過(guò)程，為子宮內(nèi)膜容受性的形態(tài)學(xué)標(biāo)志。胞飲突的出現(xiàn)時(shí)間與子宮內(nèi)膜“著床窗”出現(xiàn)的時(shí)間相吻合，為子宮內(nèi)膜容受性的形態(tài)學(xué)標(biāo)志［2，12］。

3.2益氣血補(bǔ)肝腎方改善著床障礙小鼠子宮內(nèi)膜的容受性中藥治療不孕有悠久的歷史，中醫(yī)對(duì)各種原因的不孕癥有不同的辨證論治方法。益氣血補(bǔ)肝腎方中的經(jīng)后增殖方著重于益氣血，同時(shí)促進(jìn)子宮內(nèi)膜的的正常生長(zhǎng)，方中用黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓、甘草健脾益氣，熟地黃、肉桂、當(dāng)歸、白芍、川芎補(bǔ)血和血，全方使氣血旺盛，沖任得滋，胎孕易成。促黃體方著重于補(bǔ)肝腎。當(dāng)婦女受孕后，胎元的健康成長(zhǎng)就需要腎水的封藏功能和脾土承載功能的正常運(yùn)行，故此期的治療主要著重于補(bǔ)肝滋腎水兼以健脾，使雌激素及孕酮維持較高水平，調(diào)補(bǔ)肝腎為主，以維持黃體功能，促使胚胎的著床。全過(guò)程先補(bǔ)益氣血，后滋補(bǔ)肝腎，共達(dá)調(diào)經(jīng)種子之效［13］?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)許多中藥能興奮下丘腦—垂體—性腺系統(tǒng)，顯示激素樣作用，能改善組織供血及子宮內(nèi)膜的微環(huán)境，增強(qiáng)子宮內(nèi)膜的容受性，提高著床率及臨床妊娠率。經(jīng)后增殖方及促黃體方中的許多中藥都有這樣的功效，研究［14-15］表明，益氣血補(bǔ)肝腎方能顯著提高卵泡液轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）和促黃體生成素（LH）水平，能適當(dāng)提高垂體降調(diào)節(jié)后人絨毛膜促性腺激素（HCG）日的LH水平，減少促性腺激素（Gn）用量和使用天數(shù)，從而提高胚胎的著床率。前期的研究［16］表明，經(jīng)后增殖方及促黃體方能誘導(dǎo)超促排卵小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3的表達(dá)，提高超促排卵小鼠的胚胎著床率，提示該方可能具有改善子宮內(nèi)膜容受性的作用。

本研究中，采用米非司酮建立胚胎著床障礙的小鼠模型，旨在研究中藥益氣血補(bǔ)肝腎方對(duì)著床障礙小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜整合素β3表達(dá)的影響，從而闡明其改善胚胎著床的分子基礎(chǔ)，為臨床實(shí)踐提供更充分的理論依據(jù)。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示：經(jīng)米非司酮的作用，在Pd4模型組小鼠子宮內(nèi)膜整合素β3 mRNA的表達(dá)較正常組顯著降低，治療組可顯著升高整合素β3 mRNA的表達(dá)，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。免疫印跡檢查結(jié)果顯示整合素β3的表達(dá)趨勢(shì)與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果無(wú)顯著性差異。本研究結(jié)果提示：中藥益氣血補(bǔ)肝腎方可上調(diào)著床障礙小鼠圍著床期子宮內(nèi)膜中整合素β3及胞飲突的表達(dá)，改善子宮內(nèi)膜容受性，使內(nèi)膜與胚胎趨于同步化，從而促進(jìn)胚胎著床。

［1］Carson D D，Bagchi I，Dey S K，et al.Embryo implantation ［J］.Develop Biology，2000，223（2）：217.

［2］Diedrich K，F(xiàn)auser B C，Devroey P，et al.The role of the endometrium and embryo in human implantation［J］.Hum Reprod Update，2007，13（4）：365.

［3］陸柳如，吳克明.中醫(yī)藥在體外受精—胚胎移植技術(shù)中的研究現(xiàn)狀［J］.中國(guó)中藥雜志，2015，40（16）：3142.

［4］劉艷娟，黃光英，陸付耳，等.小鼠胚泡著床障礙模型的建立［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（11）：1315.

［5］白玉濤，張玉玲，代娟，等.ICR小鼠著床障礙模型的建立［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，43（3）：63.

［6］Psychoyos A.Hormonal control of ovoimplantation［J］.Vitam Horm，1973，31，201.

［7］Oodi J，Creus M，Quinto L，et al.Within-subject betweencycle variability of histological dating， alphaVbeta3 integrin expression，and pinopod formation in the human endometrium ［J］.J Clin Endocrinol Metab，2003，88（5）：2119.

［8］Lessey B A.Endometrial integrins and the establishment of uterine receptivity［J］.Hum Reprod，1998，13（3）：247.

［9］Thomas K，Thomson A，Wood S，et al.Endometrial integrin expression in women undergoing in vitro fertilization and association with subsequent treatment outcome［J］.Fertil Steril，2003，80 （3）：502.

［10］Srinivasan K R，Blesson C S，F(xiàn)atima I，et al.Expression of alphaVbeta3 integrin in rat endometrial epithelial cells and its functional role during implantation［J］.Gen Comp Endocrinlol，2009，160（2）：124.

［11］AchacheH，RevelA.Endometrialreceptivitymarkers，the journey to successful embryo implantation［J］.Hum Reprod Update，2006，12（6）：731.

［12］Quinn C E，Casper R F.Pinopodes：a questionable role in endometrial receptivity［J］.Hum Reprod Update，2009，15（2）：229.

［13］鄧偉民，邵玉，張金玉，等.中藥益氣血補(bǔ)肝腎法對(duì)輔助生育胚胎種植率的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25（2）：106.

［14］葛明曉，趙彥鵬，張金玉，等.益氣血補(bǔ)肝腎法對(duì)垂體降調(diào)節(jié)超促排卵周期性激素水平及臨床結(jié)局的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27（5）：457.

［15］葛明曉，張金玉，趙彥鵬，等.益氣血補(bǔ)肝腎中藥對(duì)體外受精—胚胎移植周期中卵泡液轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和性激素水平的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2011，31（3）：327.

［16］ 李海霞，謝妍，郭新宇，等.經(jīng)后增殖方和促黃體方能誘導(dǎo)超促排卵小鼠子宮內(nèi)膜中整合素β3的表達(dá)［J］.生殖與避孕，2012，32（11）：695.

【責(zé)任編輯：黃玲】

Effect of Yiqixue Buganshen Recipe on Endometrial Integrin β3 Expression and Pinopode Formation in Mice with Embryo Implantation Dysfunction

LI Haixia1，XIA Zhengming2，ZHANG Jinyu3，GUO Xinyu3，DENG Weimin3，XIA Wei1，SHENG Lihong1
（1.Medical Reproduction Center，Guangzhou First People's Hospital，Guangzhou 510000 Guangdong，China；2.The Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510000 Guangdong，China；3.Medical Reproduction Center，Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Region，Guangzhou 510000，Guangdong，China）

ObjectiveTo observe the effect of Yiqixue Buganshen Recipes（YBR），the compound recipes of Chinese herbal medicine with the actions of replenishing Qi and blood and tonifying liver and kidney，on the endometrial integrin β3 of the mice with embryo implantation dysfunction，and to explore the molecular mechanism of YBR in improving embryo implantation.Methods Ninety mice were divided normal group，model group，and YBR group，30 mice in each group.YBR group was given Jinghou Zengzhi granules 8mg/kg for promoting post-menstruation proliferation and Cuhuangti granules 8mg/kg for promoting the formation of corpora luteum.At 8∶00 am of pregnant day 4（Pd4），subcutaneous injection of mifepristone was used for inducing embryo implantation dysfunction in the model group and YBR group.Twenty mice from each group were executed 12 hours after subcutaneous injection of mifepristone，and the uterus was isolated for the detection of mice endometrial integrin β3 mRNA and protein expression with real-time RT-PCR and Western blotting method respectively.Ten mice from each group at Pd4 were executed，and the uterus was isolated and then fixed in 2.5%glutaraldehyde solution for the detection of the formation of pinopode in mice endometrium under scanningelectron microscope.Results The detection by real-time PCR and Western blotting method revealed that integrin β3 mRNA and protein expression levels of the model group were significantly lower than those of the normal group（P＜0.05），and YBR group had higher integrin β3 mRNA and protein expression levels than the model group（P＜0.05）.The formation of pinopodes in the model group was less than the normal group and YBR group，but the number of formed pinopodes in YBR group was similar to that in the normal group.Conclusion YBR can up-regulate the expression of integrin β3 in the endometrium of mice with embryo implantation dysfunction，and have positive regulatory effect on the formation of pinopodes on Pd4.

Yiqixue Buganshen Recipe；integrin β3；pinopode；endometrial receptivity；embryo implantation；uterus/ultrastructure；disease models，animal；mice

R285.5

A

1007-3213（2016）05-0688-05

10．13359/j．cnki．gzxbtcm．2016．05．017

2016-05-01

李海霞（1978-），女，碩士研究生，主治醫(yī)師；E-mail:278941085@qq.com

張金玉（1965-），女，主任醫(yī)師；E-mail:haixialitj@sina.com

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào):30973929）；國(guó)家青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào):81403249）；廣東省中醫(yī)藥管理局課題（編號(hào):20141045）