周福興， 陳　穎， 劉高偉， 劉海霞 ，李　娜 ，馬　芮，陳必良

(1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產科，陜西 西安710032；2.第四軍醫(yī)大學藥學院天然藥物學教研室，陜西 西安 710032)

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高血糖通過HBP途徑增加SD大鼠子宮內膜細胞內β-catenin穩(wěn)定性

周福興1， 陳穎2， 劉高偉1， 劉海霞1，李娜1，馬芮1，陳必良1

(1.第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產科，陜西 西安710032；2.第四軍醫(yī)大學藥學院天然藥物學教研室，陜西 西安 710032)

目的探討高血糖通過HBP途徑增加子宮內膜細胞內β-catenin穩(wěn)定性的相關機制。方法50只SD雌性大鼠隨機分為正常對照組、禁食組、高糖高脂組、葡萄糖胺組和葡萄糖組。高糖高脂組給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，其他組普通飼料喂養(yǎng)。8周后將高糖高脂組和正常對照組大鼠處死；禁食組禁食24h后處死；葡萄糖胺組禁食24h后給予葡萄糖胺 2.50g/kg灌胃，3h后處死；葡萄糖組禁食24h后給予葡萄糖5g/kg灌胃，3h后處死。分別取各組大鼠子宮內膜組織，檢測相關蛋白和基因表達水平。結果HSHF組和NC組相比，各飼養(yǎng)周空腹血糖水平均明顯升高(t值2.34～2.78，均P<0.05)。GLU組和FASTING組相比，血糖水平明顯升高(t=3.46，P<0.05)，而GLN組和FASTING組相比血糖水平無統(tǒng)計學差異(t=0.84，P>0.05)。Westernblot檢測結果相對表達量分析顯示，GLN組和GLU組子宮內膜組織內β-catenin、O-GlcNAc表達量均明顯高于FASTING組(t值3.44～5.08，均P<0.05)，而GLN組和GLU組之間β-catenin、O-GlcNAc表達量均無統(tǒng)計學差異(t值分別為0.75、0.66，均P>0.05)。RT-PCR檢測HSHF組Ctnnb1表達水平與NC組相比無統(tǒng)計學差異(t=0.43，P>0.05)，而β-catenin特異性靶基因CyclinD1和Axin2表達水平HSHF組明顯高于NC組(t值分別為4.48、5.26，均P<0.05)。結論高血糖能夠通過HBP途徑，使β-catenin的O-GlcNAc化增加，從而增加其穩(wěn)定性，使進入細胞核內的β-catenin增多，持續(xù)作用于下游靶基因引起細胞異常增殖分化。

高血糖；內膜癌；WNT/β-catenin；O-GlcNAc

[Keywords]hyperglycemia;endometrialcancer;WNT/β-catenin;O-GlcNAc

子宮內膜癌是女性三大惡性腫瘤之一。2014年美國女性內膜癌的新增病例為52 630例，死亡病例為8 590例[1]，在女性常見的惡性腫瘤中占第4位，生殖系統(tǒng)腫瘤中占第1位。中國女性子宮內膜癌的患病率僅次于宮頸癌，位于生殖系統(tǒng)腫瘤第2位。隨著人們生活水平的提高，飲食結構的西方化改變，國內子宮內膜癌的發(fā)病率逐年上升，并呈現年輕化，高侵襲性，低分化等特點，嚴重危害女性生命健康[2]。 肥胖[3]和糖尿病[4-5]是子宮內膜癌的兩大危險因素。而高血糖作為二者共同特征，已發(fā)現與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關[6-7]，但是血糖升高是否與子宮內膜癌的發(fā)生相關目前尚不清楚。因此，本研究重點探索高血糖對子宮內膜細胞通路的影響及可能的分子機制。實驗以高糖高脂喂養(yǎng)的SD大鼠為切入點，研究高血糖狀態(tài)下子宮內膜分子通路變化的情況。通過建立高糖高脂喂養(yǎng)的SD大鼠模型，模擬人類高血糖狀態(tài)下內膜組織WNT/β-catenin通路異常狀態(tài)，探討高血糖狀態(tài)下氧連接的氮乙酰葡萄糖胺(Nacetylglucosamine，O-GlcNAc)化對β-catenin異常升高的作用。

1材料與方法

1.1動物

8～10周齡雌性SD大鼠(第四軍醫(yī)大學動物中心)50只，體重180～200g。

1.2主要試劑

O-GlcNAc抗體(RL2,Abcam公司)，β-catenin抗體(Abcam公司)，葡萄糖胺(Sigma公司)，RNA提取試劑盒(TaKaRa公司)。

1.3動物分組及模型的建立

將所有實驗大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為5組：正常對照組(normalcontrolgroup，NC組)、禁食組(fastinggrop，FASTING組)、高糖高脂組(highsugarandhighfatgroup，HSHF組)、葡萄糖胺組(glucosaminegroup，GLN組)和葡萄糖組(glucosegroup，GLU組)。HSHF組喂養(yǎng)高糖高脂飼料(普通飼料中加入10%的豬油、20%的蔗糖、2.5%的膽固醇、1%的膽酸鈉，特洛菲公司)，其他組喂養(yǎng)普通飼料喂養(yǎng)(65%碳水化合物，11% 脂肪，24%蛋白)，自由飲水。NC組和HSHF組連續(xù)喂養(yǎng)8周后處死。FASTING組禁食24h后處死；GLN組禁食24h后給予葡萄糖胺 2.50g/kg灌胃，3h后處死；GLU組禁食24h后給予葡萄糖5g/kg灌胃，3h后處死。

1.4觀察指標及檢測方法

觀察大鼠一般狀態(tài)包括精神活動狀態(tài)，皮毛色澤，凈飲食量，二便等狀況。每周稱量并記錄體重。檢測空腹血糖：夜間禁食12h，尾部取血檢測空腹血糖。內膜組織取材前陰道涂片確定大鼠生理周期，在動情期處死大鼠，取子宮角，迅速刮取子宮內膜置于液氮中凍存，用于蛋白免疫印跡(westernblot，WB)和實時定量PCR(real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR)檢測。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白的表達水平

提取內膜組織蛋白，測定蛋白含量后，按每孔30ug總蛋白量上樣進行電泳分離，0.30A橫流電轉2h，5%脫脂奶粉室溫搖床封閉抗體2h，分別加入一抗孵育液中(β-catenin1:4 000稀釋，RL2 1:1 000稀釋)4℃孵育過夜。0.25%PBST洗膜10min×3次，用含辣根過氧化物酶標記的相應二抗室溫孵育2h，洗膜10min×3次，滴加化學發(fā)光底物進行檢測，ImageJ軟件分析圖像。

1.6 RT-PCR檢測相關基因表達水平

TaKaRaRNA提取試劑盒(TaKaRaMiniBESTUniversalRNAExtractionKit)提取內膜組織RNA，測濃度，逆轉錄后進行RealTimePCR檢測，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)作為內參，進行相對表達量分析。引物設計與合成如下：Ctnnb1，正義：5′-GTGCAATTCCTGAGCTGACC-3′，反義：5′-CGGGCTG￣TTTCTACGTCATT-3′；CyclinD1，正義：5′-TCAAGTGTG￣ACCCGGACTG-3′，反義：5′-GACCAGCTTCTTCCTCCACTT-3′；Axin2，正義：5′-TCCTTACCGCATGGGGAGTA-3′，反義：5′-GTGGGTTCTCGGGAAGTGAG-3′。

1.7統(tǒng)計學方法

2結果

2.1各組血糖值比較

HSHF組和NC組相比，各飼養(yǎng)周空腹血糖水平均明顯升高(t值2.34～2.78，均P<0.05)。GLU組和FASTING組相比，血糖水平明顯升高(t=3.46，P<0.05)，而GLN組和FASTING組相比血糖水平無統(tǒng)計學差異(t=0.84，P>0.05)(圖1)。

圖1各組血糖值比較(a為NC組和HSHF組飼養(yǎng)周空腹血糖水平對比；b為FASTING組、GLU組和GLN組大鼠血糖水平的比較)

Fig.1Comparisonofbloodglucoselevelsamongdeffrentgroups(a:fastingbloodglucoselevelsinNCgroupandHSHFgroup;b:BloodglucoselevelsinFASTING,GLUandGLNgroups)

2.2子宮內膜組織內β-catenin和O-GlcNAc表達比較

Westernblot檢測結果顯示，HSHF組子宮內膜組織內β-catenin表達量明顯高于NC組，O-GlcNAc化水平也增高。相對表達量分析顯示，GLN組和GLU組子宮內膜組織內β-catenin、O-GlcNAc表達量均明顯高于FASTING組(t值3.44～5.08，均P<0.05)，而GLN組和GLU組之間β-catenin、O-GlcNAc表達量均無統(tǒng)計學差異(t值分別為0.75、0.66，均P>0.05)(圖2)。

圖2Westernblot檢測子宮內膜組織內β-catenin、O-GlcNAc表達結果

Fig.2Expressionsofβ-cateninandO-GlcNAcinendometriumtissuesdetectedbyWesternblot

2.3正常對照組高糖高脂組RT-PCR檢測結果比較

RT-PCR檢測HSHF組Ctnnb1表達水平與NC組相比無統(tǒng)計學差異(t=0.43，P>0.05)，而β-catenin特異性靶基因CyclinD1和Axin2表達水平HSHF組明顯高于NC組(t值分別為4.48、5.26，均P<0.05(圖3)。

圖3RT-PCR檢測NC組和HSHF組中Ctnnb1,CyclinD1和Axin2的表達水平。

Fig.3ExpressionsofCtnnb1,CyclinD1andAxin2detectedbyRT-PCR

3討論

3.1WNT/β-catenin通路正常和異常狀態(tài)下對細胞生長發(fā)育的作用

WNT/β-catenin通路是真核生物一條保守的分子通路，能夠調節(jié)多種細胞進程如細胞生存、凋亡、轉移等[8-9]。β-catenin是這條通路中的核心蛋白，正常代謝過程中合成的β-catenin蛋白在胞質中會被酶解復合體降解，只有少部分β-catenin能進入細胞核內，與靶基因結合來調控細胞生理活動[10]。因此當細胞胞質內的β-catenin異常增加，會使進入細胞核內的β-catenin增多，持續(xù)作用于核內的靶基因，誘導細胞異常增殖分化發(fā)生癌變[11]。β-catenin編碼基因的突變、酶解復合體突變和β-catenin本身結構改變都可以造成β-catenin的異常增加[11]。近些年，越來越多的研究表明WNT/β-catenin通路異常與內膜癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關系，之前對子宮內膜癌的研究多集中于β-catenin編碼基因突變和酶解復合體突變如APC的突變[12-13]，對于β-catenin本身結構改變所致的突變研究較少，所以本實驗著重于β-catenin本身結構改變導致通路突變的研究。

3.2氮乙酰葡萄糖胺化對于WNT/β-catenin通路的作用

O-GlcNAcylation是一種翻譯后修飾，與磷酸化類似，能夠使β-catenin蛋白O-GlcNAc化，使其結構改變而不被酶解復合體識別[14]。O-GlcNAc化所需的GlcNAc基團是由己糖胺合成途徑(hexosaminebiosynthesispathway，HBP)途徑的終產物UDP-GlcNAc提供的，HBP途徑是糖代謝的一個小分支，正常情況下細胞內有大約5%的葡萄糖用于HPB途徑產生UDP-GlcNAc[14]。目前已有研究表明血糖升高可導致HBP途徑活躍，進而通過O-GlcNACylation影響包括WNT/β-catenin在內的一系列通路[15-17]。那么高血糖會不會通過HBP使β-catenin升高而誘導內膜癌的發(fā)生呢？本研究主要通過檢測高糖高脂喂養(yǎng)的SD大鼠子宮內膜β-catenin表達變化探究其與高血糖之間的可能的相關關系。

3.3血糖通過HBP途徑影響β-catenin的氮乙酰葡萄糖胺化水平

實驗結果顯示，HSHF組大鼠子宮內膜組織β-catenin的表達量和O-GlcNAc化水平明顯高于NC組。HSHF組血糖升高，相應的HBP途徑增強，使UDP-GlcNAc合成增多，進而蛋白的O-GlcNAc化也增多。β-catenin也隨著血糖的升高而表達增加，提示我們β-catenin可能與HBP途徑相關,這與之前的文獻報道相符[14]。葡萄糖胺是HBP途徑的中間產物，能夠直接進入HBP途徑參與下一步反應[15]，本實驗發(fā)現給饑餓24h的SD大鼠灌胃葡萄糖胺后，子宮內膜的β-catenin和O-GlcNAc的表達量明顯高于FASTING組，同樣的結果在出現在GLU組；但是相應的血糖濃度GLN組和FASTING組比并沒有升高，而GLU組明顯升高，這支持了我們之前的假設即升高的血糖可以通過HBP途徑作用于β-catenin的使其表達量增高。結合文獻報道的β-catenin的O-GlcNAc化能改變其結構[14,15-16]，提示血糖通過HBP途徑產生UDP-GlcNAc，作用于β-catenin使其結構改變，穩(wěn)定性增加使其在細胞內含量增加。

3.4高血糖引起的β-catenin的增加能夠進一步激活下游的靶基因

為了驗證β-catenin高表達是由于穩(wěn)定性增加導致的，而非β-catenin編碼基因Ctnnb1表達量增加導致的，本實驗對HSHF組和NC組的Ctnnb1的表達量進行了比較，HSHF組的Ctnnb1轉錄水平未發(fā)現明顯的增加，提示β-catenin細胞內異常增高可能是由于其降解減少引起的。同時β-catenin的特異性靶基因Axin2和Cyclin1的表達量在HSHF組中明顯增高，說明高血糖引起的β-catenin的變化能夠進一步激活下游的靶基因，調節(jié)細胞的生長增殖。

綜上所述，本研究發(fā)現高血糖能夠通過HBP途徑使β-catenin的O-GlcNAc化水平增加，導致穩(wěn)定性增加使進入細胞核內的β-catenin增多，激活下游靶基因。而β-catenin激活的下游靶基因是否能進一步引起細胞的異常增殖分化還需要進一步研究，同時高血糖對于β-catenin的影響是否也對人類的子宮內膜產生類似的影響還需要進一步研究。

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[專業(yè)責任編輯：張忠明]

Glucose enhances the stability of β-catenin via hexosamine biosynthetic pathway in endometrium of SD rats

ZHOU Fu-xing1, CHEN Ying2, LIU Gao-wei1, LIU Hai-xia1, LI Na1, MA Rui1, CHEN Bi-liang1

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China;2.DepartmentofNaturalMedicine,SchoolofPharmacy,FourthMilitaryMedicalUniversity,ShaanxiXi’an710032,China)

ObjectiveToinvestigatethemechanismofhyperglycemiaenhancingthestabilityofβ-catenininendometrialcellsviahexosaminbiosyntheticpathyway(HBP).MethodsFemaleSDratswererandomlydividedinto5groups:normalcontrol(NC)group,fasting(FASTING)group,highsugarandhighfat(HSHF)group,glucosamine(GLN)groupandglucose(GLU)group.RatsintheHSHFgroupweregivenhighglucoseandhighfatdiet,whiletheothergroupsweregivennormaldiet.After8weeks’feedingratsinHSHFgroupandNCgroupwereexecutedandendometriumofthemwerecollected.RatsinFASTINGgroupwereexecutedafter24h.GLNgroupandGLUgroupwaslavagedwithglucosamine(2.50g/kg)andglucose(5g/kg)afterfastingfor24hours.Threehourslatertheratswereexecuted.Thenendometriumofratsineachgorupwascollectedtodetectexpressionsofproteinandgenes.ResultsComparedwithNCgroup,fastingbloodglucoselevelincreasedremarkablyinHSHFgroup(tvalueranged2.34-2.78,bothP<0.05).ComparedwithFASTINGgroup,glucoselevelofGLUgroupenhancedsignificantly(t=3.46,P<0.05),butGLNgroupwasnotsignificantlydifferent(t=0.84,P>0.05).Westernblotdetectionresultsshowedthattheexpressionsofβ-cateninandO-GlcNAcinGLNgroupandGLUgroupwereremarkablyhigherthanthoseinFASTINGgroup(tvalueranged3.44-5.08,respectively,allP<0.05),butthedifferencesinGLNgroupandGLUgroupwerenotsignificant(tvaluewas0.75and0.66,respectively,bothP>0.05).RT-PCRdetetionrevealedthatthedifferenceinCtnnb1expressionwasnotsignificantbetweenHSHFgroupandNCgroup(t=0.43, P>0.05),buttheexpressionsofCyclinD1andAxin2wereremarkablyhigherinHSHFgroupthaninNCgroup(tvaluewas4.48and5.26,respectively,bothP<0.05).ConclusionHyperglycemiacanenhanceO-GlcNAclevelofβ-cateninviaHBP,andthuselevateitsstabilitytohelptheaccululationofβ-catenin,whichcausesabnormalproliferationbyconsitentactionondownstreamtargetgenes.

2015-06-29

周福興(1989-)，男，碩士研究生，主要從事婦科腫瘤的研究。

陳必良，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.01.005

R711.7

A

1673-5293(2016)01-0014-04