宋丹，劉金星，師偉，張保成

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250011

盆腔炎性疾病動(dòng)物陰道上行感染建模方法的探討

宋丹1，劉金星2，師偉2，張保成1

1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南 250011

目前，國(guó)內(nèi)盆腔炎性疾病動(dòng)物模型多采用手術(shù)法建模，雖然成功率較高，但與臨床盆腔炎性疾病主要發(fā)病途徑有所差異，具有局限性。通過陰道上行感染建模，更接近于臨床致病特點(diǎn)，且國(guó)外已較成熟，而國(guó)內(nèi)較少，值得進(jìn)一步探討學(xué)習(xí)。本文從陰道上行感染的建模方法的機(jī)理、實(shí)驗(yàn)對(duì)象及感染源的選擇、模型評(píng)價(jià)指標(biāo)等方面，探討該建模方法。

盆腔炎性疾?。粍?dòng)物模型；陰道；上行感染

盆腔炎性疾病(pelvic inflammatory disease，PID)為女性常見生殖道感染性疾病，包括輸卵管炎癥、輸卵管卵巢膿腫以及盆腔腹膜炎、子宮內(nèi)膜炎等。該病分為急性和慢性兩種，急性盆腔炎由于致病菌從陰道上行感染導(dǎo)致子宮、輸卵管及周圍組織器官的炎癥。慢性盆腔炎多由于急性盆腔炎癥未能及時(shí)治愈，病情反復(fù)引起。探索建立PID模型，有利于探討相關(guān)的病理生理、藥物評(píng)價(jià)機(jī)制及臨床研究。

1 盆腔炎性疾病發(fā)病機(jī)制

1.1 下生殖道上行感染

女性陰道口向外與外界相通，向內(nèi)與盆腔內(nèi)生殖器相連，病原體如大腸桿菌、鏈球菌、淋球菌、支原體、衣原體等易直接和或間接經(jīng)過下生殖道粘膜逆行性感染，女性盆腔中靜脈多于動(dòng)脈,與附近器官、組織形成靜脈叢,以及周圍豐富的淋巴結(jié)和淋巴管，均使感染易于彌散，從而引起盆腔炎性疾病。下生殖道的創(chuàng)傷、經(jīng)期產(chǎn)后免疫力降低、性生活不潔或頻繁等均易引起下生殖道感染，上行感染引起盆腔炎性疾病。上行性感染是非妊娠期、及非產(chǎn)褥期盆腔炎性疾病感染的主要途徑[1]。

1.2 盆腔機(jī)械損傷

隨著婦科手術(shù)及檢查的發(fā)展，盆腔手術(shù)、婦科檢查、宮內(nèi)節(jié)育器放置術(shù)、輸卵管通液或造影術(shù)等,若術(shù)者操作不當(dāng),器械消毒不嚴(yán)，均有引起感染的風(fēng)險(xiǎn)。醫(yī)源性因素引起的PID逐漸增加。

1.3 其他疾病對(duì)盆腔炎發(fā)病的影響

盆腔周圍組織器官的其他炎癥，如闌尾炎、腹膜炎、結(jié)核病等遷延也可導(dǎo)致盆腔炎癥。從臨床感染途徑看，陰道上行感染建模法更符合臨床發(fā)病機(jī)制，對(duì)于模擬盆腔炎性疾病，研究其病理生理、藥物療效評(píng)價(jià)等更具有參考價(jià)值。目前，國(guó)內(nèi)盆腔炎性疾病后遺癥動(dòng)物建模多采用經(jīng)腹手術(shù)感染結(jié)合機(jī)械損傷為主，而國(guó)際上多采用陰道上行感染法，因其與臨床發(fā)病特點(diǎn)更相符，國(guó)內(nèi)也在逐漸引用。

2 陰道上行感染建模方法

通過臨床發(fā)病機(jī)制可以看出，逆行性感染是盆腔炎性疾病的主要感染途徑。因此，陰道上行感染法符合臨床致病特點(diǎn)。該建模方法主要是將病原體通過陰道接種病原體，病原體逆行性感染宮腔及其周圍器官、組織，進(jìn)而形成盆腔炎性疾病模型。該造模方法更接近于臨床上病原體沿生殖道載膜上行的感染途徑,易形成后遺癥表現(xiàn)，且不易導(dǎo)致缺血、壞死甚至菌血癥等急重癥,可重復(fù)性好，但接種感染率低，需反復(fù)試驗(yàn)，成模時(shí)間較長(zhǎng)。目前，國(guó)內(nèi)多采用開腹手術(shù)，將病原體直接接種于宮腔及輸卵管等，其操作中易引起腹腔感染，甚至導(dǎo)致動(dòng)物死亡及實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且局限于內(nèi)源性病原體的感染。近年來大量研究表明，外源性病原體引起的PID逐漸增加[2]。因此，該建模方法不能滿足臨床需要。

3 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

采用該法的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多為大鼠、小鼠及新西蘭白兔。其具有成本低，資源豐富，性情溫順，易于飼養(yǎng)和管理，且盆腔組織缺點(diǎn)是大鼠，尤其是小鼠體積較小，輸卵管短小、狹窄，不利于觀察研究。Taylor Robinson等[3]研究發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠具有先天性免疫缺陷，易被感染，對(duì)于非手術(shù)法建模，可以增加感染率，尤其對(duì)解脲支原體的定植最為敏感。兔的輸卵管與人類相似，比鼠類體積大，結(jié)構(gòu)更清晰，易于觀察，其缺點(diǎn)為接種感染死亡率相對(duì)較高；陰道接種病原體，易引起尿路交叉感染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，國(guó)外多用非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如猩猩，狒狒、獼猴等，其生殖系統(tǒng)結(jié)構(gòu)大小和形態(tài)與人類最接近[4]。通過反復(fù)直接接種沙眼衣原體致宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎或輸卵管炎模型，其致病特點(diǎn)和病理表現(xiàn)與人類更相近[5]。但其價(jià)格昂貴，資源有限，飼養(yǎng)管理成本高，因此較難推廣。

4 感染源

盆腔炎性疾病相關(guān)建模中，菌種的選擇隨著建模方法的進(jìn)步，經(jīng)歷了由簡(jiǎn)到繁的過程，由單一病原體到兩種混合菌，現(xiàn)在多用的為3種混合菌；由內(nèi)源性到外源性病原體，現(xiàn)在引入了內(nèi)外源性混合型病原體，越來越重視臨床感染機(jī)理和途徑，更符合臨床感染源的混合性和復(fù)雜性。陰道上行感染建模所選用的感染源可為單一菌液，也可為混合菌液，可為內(nèi)源性病原體，也可為外源性病原體。菌液選擇的原則是，在保證實(shí)驗(yàn)感染成功率的同時(shí)，引起避免動(dòng)物缺血、壞死甚至菌血癥，并盡量接近于臨床感染機(jī)制。目前造模的病原體，內(nèi)源性病原體以混合菌液為主，外源性病原體多為單一致病菌，混合菌液及外源性病原體感染率高，也與人類盆腔炎性疾病致病特點(diǎn)相似。

4.1 內(nèi)源性病原體感染法

內(nèi)源性病原體指寄居在生殖道內(nèi)的菌群，主要包括需氧菌，如金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸桿菌等；以及厭氧菌，如消化鏈球菌、消化球菌、脆弱類桿菌等，臨床以混合感染多見。

目前，國(guó)內(nèi)內(nèi)源性病原體陰道接種的報(bào)道較少，多見于手術(shù)法建模。李俊良等[6]用逆行宮腔插管灌注細(xì)菌法，將大腸埃希菌與金黃色葡萄球菌以1∶1制成1×107/L濃度混合菌液，向兔子宮插管注入細(xì)菌，觀察模型血象、慢性期炎癥因子及病理切片等均顯示急慢性盆腔炎性表現(xiàn)，14天后表現(xiàn)為慢性炎癥，49 d后已形成盆腔炎性疾病后遺癥表現(xiàn)，提示建模成功。

4.2 外源性病原體感染法

外源性病原體主要為性傳播疾病的病原體，包括沙眼衣原體、淋病奈瑟菌及解脲支原體等。國(guó)外對(duì)外源性病原體感染法研究較成熟，是相關(guān)建模的常用方法。

4.2.1 支原體

有學(xué)者認(rèn)為UU致病性與其濃度有關(guān)。李華等[7]對(duì)比發(fā)現(xiàn)濃度≥106copy/g時(shí),感染力較強(qiáng),而低濃度UU3感染率較低。而劉淑榮[8]研究發(fā)現(xiàn)在白兔生殖道中，血清8型的致病濃度為≥104 copy/g。張連娣等[9]采用陰道上行感染的方法造模，發(fā)現(xiàn)小鼠最適宜感染血清8型菌液的濃度為2.5×105 CCU/mL。鄭冰潔等[10]通過對(duì)比1型和8型在小鼠下生殖道感染模型中的致病性，發(fā)現(xiàn)兩者均可導(dǎo)致急慢性炎癥病理改變，以子宮病變?yōu)橹?，且Up1可導(dǎo)致宮腔粘連。劉淑榮[8]的研究表明，血清3型、8型混合型菌液致病性、定植率最強(qiáng)，其次是血清8型，血清3型最弱。早期國(guó)外學(xué)者曾用解脲支原體接種多種哺乳動(dòng)物未定植成功，而Taylor Rbinson等[3]用雌激素預(yù)處理后，建模成功。Tuffrey采用孕激素預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)孕激素可抑制雌鼠的發(fā)情周期而提供更多的靶細(xì)胞被感染，增加解脲支原體感染率，縮短建模周期。這說明激素處理對(duì)病原體的定植有影響，對(duì)PID相關(guān)建模給予借鑒和啟示。

4.2.2 沙眼衣原體(CT)

目前，多選用鼠肺炎衣原體株（MoPn）陰道上行感染法進(jìn)行盆腔炎動(dòng)物建模。Liston P[11]，韓建德等[12]采用 2× 106 IFU沙眼衣原體感染液陰道內(nèi)接種感染的方法誘發(fā)小鼠盆腔炎癥及后遺癥。實(shí)驗(yàn)表明,此方法可以成功建立CT生殖道感染小鼠模型,陰道內(nèi)感染后,可上行感染上生殖道，實(shí)驗(yàn)21 d，出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng),3～7周內(nèi)，轉(zhuǎn)為炎癥后遺癥表現(xiàn),可應(yīng)用于急慢性生殖道炎癥的建模。王樂丹等[13]分別用106、104、102數(shù)量IFU的CT-E型株陰道內(nèi)接種雌鼠,表明l06 IFU是建立模型的適宜感染量。

表1 盆腔炎性疾病動(dòng)物模型病理觀察指標(biāo)及積分標(biāo)準(zhǔn)（Philips評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)）

5 評(píng)價(jià)指標(biāo)

目前，國(guó)內(nèi)外尚無盆腔炎性疾病模型評(píng)價(jià)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)，文獻(xiàn)中多以子宮。輸卵管及其周圍組織結(jié)構(gòu)的炎性改變及結(jié)構(gòu)異常作為評(píng)價(jià)原則，通過形態(tài)學(xué)、病理學(xué)、血液流變學(xué)、細(xì)菌學(xué)等,動(dòng)態(tài)檢測(cè)動(dòng)物模型炎性改變的過程。

5.1 大體形態(tài)學(xué)

肉眼觀察盆腔腹腔及臟器有無積液、粘連等情況，雙側(cè)子宮及附件區(qū)形狀、色澤、大小、粗細(xì)、彈性，粘連、包塊情況。

5.2 組織病理學(xué)

多采用病理觀察指標(biāo)及積分標(biāo)準(zhǔn)（Philips評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)）[14]，取子宮置于10%中性甲醛溶液中固定,常規(guī)HE染色,于光鏡下鏡檢,攝片。見表1。

5.3 血液流變學(xué)

主要檢測(cè)全血黏度、紅細(xì)胞聚集率、紅細(xì)胞壓積、血小板聚集率等，模型組動(dòng)物血液流變學(xué)呈“濃、黏、凝、聚”的狀態(tài)[15]。

5.4 炎癥指標(biāo)

主要檢測(cè) TNF-α、IL-6、白細(xì)胞介素、TGF、MMPs、VEGF等。

6 結(jié)語

建立合理的PID動(dòng)物模型，可以深入研究相關(guān)疾病的病理生理特點(diǎn)，臨床藥物療效檢驗(yàn)評(píng)價(jià)，輔助臨床研究等。感染源、致病途徑、病理特點(diǎn)等于臨床PID接近的動(dòng)物模型，更具有指導(dǎo)性、客觀性。陰道上行感染更接近臨床致病途徑，該建模方法值得研究推廣。

（

）

[1]謝幸，茍文麗，主編．婦產(chǎn)科學(xué)[M]．8版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：259．

[2]劉朝暉，廖秦平．盆腔炎性疾病致病微生物及治療方案研究[J]．實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2010，26（7）：522-524．

[3]Taylor Robinson D，F(xiàn)urr PM．Observations on experimental colonisation of mice by ureaplasmas of human origin[J].Med Microbiol，2002(51):866－870．

[4] Miyairi I，Ramsey KH，Patton DL．Duration of untreated Chlamydialgenital infection and factors associated with clearance:review of animal studies[J]．J Infect Dis，2010，201 (Suppl 2):S96-S103．

[5]Patton DL，Sweeney YT，Paul KJ．A summary of preclinical topical microbicide rectal safety and efficacy evaluations in a pigtailed macaque model[J]．Sex Transm Dis，2009，36(6):350-356．

[6]李俊良，王建六,王世軍,等．康婦炎膠囊對(duì)兔盆腔炎性疾病后遺癥模型治療的初步研究[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志，2010,11(6):443-446．

[7]李華，張洪文，陳蒲香，等.解脲脲原體血清型3在小鼠生殖道中的致病性[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2009，44（3）：204-208.

[8]劉淑榮．解脲支原體血清型3和8在母兔生殖道中的致病性研究[D].湖南:中南大學(xué)，2011．

[9]張連娣，蔡寶宏，梁學(xué)林，等．小鼠生殖道解脲支原體感染動(dòng)物模型的建立與形態(tài)學(xué)研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，11(2):163－164．

[10]鄭冰潔,尹躍平,韓燕,等.解脲脲原體血清型1和8型在小鼠生殖道感染模型中致病性探討,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所參比實(shí)驗(yàn)室[R].中國(guó)浙江杭州:中華醫(yī)學(xué)會(huì)等，2013.

[11]Liston P,Fong WG,Kelly NL,et al.Identification of XAF1 as an antagonist of XIAP anti-Caspase activity[J]. Nat Cell Biol,2001,3(2):128-133.

[12]韓建德,陳木開,李斌,等.沙眼衣原體致小鼠輸卵管炎的病理研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版,2005,26(5):520-522,532.

[13]王樂丹,顏林志,孟銳鋒,等.沙眼衣原體感染小鼠生殖道模型的初步研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2011,27(8): 692-695.

[14]向海燕,王羽倫,侯連兵,等.金剛藤分散片對(duì)大鼠慢性盆腔炎血液流變學(xué)與病理組織形態(tài)學(xué)的影響[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志,2007,17(2):38-41.

[15]陳瑞雪，李麗靜，王紅玉，等.復(fù)方盆炎寧對(duì)氣虛血瘀型盆腔炎大鼠血液流變學(xué)的影響[J].中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2006,12（3）：183-184.

Explore the Vagina Uplink Infection Method to Make Pelvic Inflammatory Disease Animal Model

SONG Dan1,LIU Jin-xing2,SHI Wei2,ZHAN Bao-cheng1
1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Ji'nan,Shandong Province，250011 China;2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine Hospital,Ji'nan,Shandong Province，250011 China

At present,We usually used the surgery method to make the animal model of pelvic inflammatory disease at home.Although the success rate is higher,it’s different from the main clinical pathogenic way and has its limitations.The vaginal uplink infection modeling is closer to the clinical pathogenic characteristicsand has more mature abroad,meanwhile,the domestic is worth further study.In this paper,We,discusses the modeling method from the vagina uplink infection mechanism and the choice of subjects and the source of infection,model evaluation,etc..

Sequelae of Pelvic Inflammatory Disease；Animal models；Vagina；Ascending infection

R711.3

A doi 10.11966/j.issn.2095-994X.2016.02.01.23

2016-02-01；

2016-02-24

國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81373675）；山東省自然基金項(xiàng)目（ZR2010HL063）。

劉金星（1965-），男，主任醫(yī)師，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)婦科疾病的臨床研究，山東省濟(jì)南市歷下區(qū)省中醫(yī)東院區(qū)，E-mail：340640150@qq.com。

宋丹（1990-），女，漢族，研究生，研究方向：中醫(yī)婦科疾病的臨床研究。

宋丹,劉金星,師偉,張保成 .盆腔炎性疾病動(dòng)物陰道上行感染建模方法的探討[J].世界復(fù)合醫(yī)學(xué)，2016,1（1）：84-86.