李文鳳 王曉燕 黃應(yīng)昆張榮躍 單紅麗 羅志明 尹 炯

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南開遠(yuǎn) 661699

101份中國甘蔗主要育種親本褐銹病抗性鑒定及Bru1基因的分子檢測(cè)

李文鳳 王曉燕 黃應(yīng)昆*張榮躍 單紅麗 羅志明 尹 炯

云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 云南開遠(yuǎn) 661699

由黑頂柄銹菌引起的甘蔗褐銹病是一種重要的世界性甘蔗病害， Bru1是甘蔗抗褐銹病主效基因， 該基因?qū)Σ煌貐^(qū)的褐銹病分離物具有廣譜抗性。為明確中國甘蔗主要育種親本對(duì)黑頂柄銹菌的抗性水平， 了解Bru1基因在這些親本中的分布情況， 本研究于2014年對(duì)中國國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的101份甘蔗主要育種親本進(jìn)行苗期抗褐銹病鑒定和抗褐銹病基因Bru1的分子檢測(cè)。結(jié)果顯示， 供試親本中， 共48份抗病材料含有抗褐銹病基因Bru1， 頻率為47.5%， 表明中國甘蔗主要育種親本中褐銹病抗性主要由 Bru1控制； 其余 29份抗病材料和 24份感病材料均不含抗褐銹病基因Bru1， 暗示除了 Bru1外， 可能還有其他抗褐銹病基因存在。研究結(jié)果為深入開展甘蔗抗褐銹病育種， 選育和推廣優(yōu)良抗病品種， 有效防控甘蔗褐銹病提供了科學(xué)依據(jù)和優(yōu)良抗性親本。

甘蔗； 主要育種親本； 抗褐銹病基因Bru1； 分子檢測(cè)

甘蔗銹病是世界性的甘蔗重要病害之一， 其病原主要有黑頂柄銹菌Puccinia melanocephala H. Sydow & P. Sydow.和屈恩柄銹菌Puccinia kuehnii Butler.［1-2］。后者發(fā)生在美國、澳大利亞、印度、拉丁美洲等國家或地區(qū)［3］， 而中國大陸至今尚未見有關(guān)該菌發(fā)生的報(bào)道。

黑頂柄銹菌廣泛分布于爪哇、古巴、牙買加、澳大利亞、美國、墨西哥、印度、泰國、毛里求斯等植蔗國家或地區(qū)， 并多次爆發(fā)流行， 給蔗糖產(chǎn)業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失［2，4-6］。在中國大陸， 阮興業(yè)等［7］于1982年首次報(bào)道了黑頂柄銹菌在云南蔗區(qū)的發(fā)生， 之后福建、廣東、四川、江西、廣西、海南等蔗區(qū)也先后報(bào)道［8-12］。目前， 由黑頂柄銹菌引起的甘蔗褐銹病已成為中國蔗區(qū)發(fā)生最普遍， 危害最嚴(yán)重的病害之一， 造成甘蔗種質(zhì)退化、產(chǎn)量降低［8-9］。尤其近年， 中國蔗區(qū)主栽的一批豐產(chǎn)高糖品種如桂糖15、桂糖17、桂引9號(hào)、P44、臺(tái)糖86-1626、粵糖60、德蔗03-83、福農(nóng)1110等主推新品種， 因其高度感染褐銹病而面臨淘汰，極大地影響了我國蔗糖產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康穩(wěn)定發(fā)展［12］。

選育和種植抗病品種是防治甘蔗褐銹病最經(jīng)濟(jì)有效的措施［13-15］， 其中評(píng)價(jià)和篩選抗性親本并科學(xué)選配， 對(duì)選育抗褐銹病品種至關(guān)重要。目前， 國外研究人員已在栽培品種 R570上發(fā)現(xiàn)和定位甘蔗抗褐銹病主效基因Bru1［16-17］， 位于甘蔗第7條染色體0.42 cM區(qū)域內(nèi)， 并與高粱第4染色體大約在225 kb區(qū)域及水稻第2染色體的短臂上600 kb區(qū)域具有同線性［18］， 該基因被證實(shí)對(duì)來自不同國家地區(qū)的褐銹病分離物具有廣譜抗性［19］， 現(xiàn)已開發(fā)出與Bru1密切相關(guān)的2個(gè)分子標(biāo)記用于種質(zhì)鑒定［20］。本課題組前期采用這2個(gè)分子標(biāo)記從31份甘蔗野生核心種質(zhì)資源中檢測(cè)篩選到含有抗褐銹病基因 Bru1的8份野生核心種質(zhì)資源， 為有效開展甘蔗抗褐銹病育種提供了優(yōu)良抗源種質(zhì)和參考依據(jù)［21］。但是， 迄今為止， 對(duì)中國甘蔗主要育種親本尚未進(jìn)行過抗褐銹病鑒定和抗褐銹病基因標(biāo)記選擇，抗褐銹病育種親本選配存在盲目性。為此， 本研究對(duì)中國國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的101份甘蔗主要育種親本進(jìn)行苗期抗褐銹病鑒定和抗褐銹病基因 Bru1的分子檢測(cè)， 了解Bru1 基因在甘蔗主要育種親本中的分布狀況， 篩選含有目標(biāo)基因的抗性親本， 以期為選育和利用抗病品種有效防控甘蔗褐銹病提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

除中國國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的的101份甘蔗主要育種親本（表2）外， 選用含Bru1基因抗病對(duì)照品種新臺(tái)糖1號(hào)、新臺(tái)糖9號(hào)［20］和模式品種 R570［16］， 感病對(duì)照品種印度290、選蔗3號(hào)。

1.2苗期抗褐銹病鑒定

2014年4月在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所（中國云南開遠(yuǎn)）， 用直徑35 cm、高30 cm的塑料桶種植各材料，桶內(nèi)裝入2/3的土壤和有機(jī)質(zhì)（3∶1）， 每份材料種植4桶，4次重復(fù)， 每桶5株， 共20株， 隨機(jī)排列， 常規(guī)管理。

于2014年7月28日甘蔗褐銹病發(fā)生盛期， 從云南勐海發(fā)病蔗區(qū)高感品種選蔗 3號(hào)采集黑頂柄銹菌孢子直接用于接種。于2014年7月30日參照文獻(xiàn)［21］報(bào)道的方法配制接種液， 進(jìn)行噴霧接種和管理。接種后4～5周調(diào)查供試材料發(fā)病情況； 參照文獻(xiàn)［22］的抗性鑒定評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3抗褐銹病基因Bru1的分子檢測(cè)

參照Costet等［20］甘蔗抗褐銹病基因Bru1的PCR標(biāo)記R12H16和 9O20-F4引物， 委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。R12H16標(biāo)記預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為570 bp，9O20-F4標(biāo)記預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為200 bp。

分別采集各材料充分展開的第一片新葉提取總DNA，以抽提的葉片總 DNA為模版， 參照文獻(xiàn)［21］的方法對(duì)各材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1苗期人工接種鑒定抗病性

101份供試材料中， 1級(jí)高抗至3級(jí)中抗的有77份， 占76.2%，。其中65份材料表現(xiàn)1級(jí)高抗， 占64.4%， 8份材料表現(xiàn) 2級(jí)抗病， 占 7.9%， 4份材料表現(xiàn) 3級(jí)中抗， 占4.0%； 24份材料表現(xiàn)為4級(jí)中感到9級(jí)高感2， 占23.8%（表1）。

2.2抗褐銹病基因Bru1的PCR檢測(cè)

分別用R12H16標(biāo)記和9O20-F4標(biāo)記引物對(duì)感病對(duì)照印度290、選蔗3號(hào)和含Bru1抗病對(duì)照新臺(tái)糖1號(hào)、新臺(tái)糖9號(hào)、模式品種R570的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)和酶切檢測(cè)。結(jié)果顯示， 含Bru1抗病對(duì)照新臺(tái)糖1號(hào)、新臺(tái)糖9號(hào)、模式品種R570均分別穩(wěn)定擴(kuò)增出2個(gè)標(biāo)記的特異性條帶， 而感病對(duì)照印度290、選蔗3號(hào)未擴(kuò)出特異性條帶（圖1）， 各樣品重復(fù)檢測(cè)結(jié)果一致。

圖1　3個(gè)已知含抗Bru1的抗性品種和2個(gè)感病對(duì)照PCR擴(kuò)增和酶切結(jié)果Fig. 1 PCR results and digestion of three sugarcane varieties carrying Bru1 and two susceptible varietiesA： R12H16-PCR標(biāo)記； B： 9O20-F4-PCR-Rsa1標(biāo)記； M： Marker； R1～R3： 已知含Bru1的抗病品種新臺(tái)糖1號(hào)、新臺(tái)糖9號(hào)和含Bru1模式品種R570； S1～S2： 感病品種印度290、選蔗3號(hào)。A： R12H16-PCR marker； B： 9O20-F4-PCR-Rsa I marker； M： DNA ladder； R1 and R2： resistant varieties ROC1 and ROC9 that carrying Bru1；R3： model Bru1-containing variety R570； S1 and S2： susceptible varieties Co290 and Xuanzhe 3.

101份供試親本材料中， 共48份抗病材料含有Bru1標(biāo)記（表 1）， 頻率為 47.5%， 表明中國甘蔗主要育種親本中褐銹病抗性主要由 Bru1控制； 其余 29份抗病材料和24份感病材料均不含Bru1標(biāo)記（表1）， 顯示中國甘蔗主要育種親本中抗褐銹病基因除了 Bru1， 可能還有其他基因存在。

表1　甘蔗主要育種親本褐銹病抗性及Bru1基因的PCR檢測(cè)結(jié)果Table 1 Brown rust resistance and PCR detection of Bru1 in main sugarcane ancestral species

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

3　討論

明確中國甘蔗主要育種親本對(duì)銹病的抗性水平， 了解抗褐銹病基因在中國甘蔗主要育種親本中的分布狀況，不僅有利于評(píng)價(jià)和篩選抗性親本和科學(xué)選配， 還能提高抗褐銹病育種的效率， 對(duì)選育抗病品種、有效防控甘蔗病害具有重要意義。本研究明確了各親本對(duì)黑頂柄銹菌的抗性水平， 掌握了Bru1基因在這些親本中的分布狀況， 檢測(cè)篩選到含有抗褐銹病基因Bru1的親本材料48份， 為深入開展甘蔗抗褐銹病育種， 選育和推廣優(yōu)良抗病品種， 有效防控甘蔗褐銹病提供了優(yōu)良抗性親本、積累了基礎(chǔ)資料。

云南是中國甘蔗野生資源重要的分布中心和世界野生甘蔗起源中心之一， 其復(fù)雜多樣的地理及氣候條件形成了豐富的甘蔗種質(zhì)資源， 是中國乃至世界甘蔗遺傳改良的天然珍貴基因庫之一［23-24］。與本課題組前期研究結(jié)果［21］一致， 本研究結(jié)果顯示中國國家甘蔗種質(zhì)資源圃保存的主要育種親本中也蘊(yùn)藏著優(yōu)良的抗褐銹病基因 Bru1， 能夠提供豐富的甘蔗褐銹病的抗性親本， 作為選育抗褐銹病甘蔗品種很有利用前景的抗源種質(zhì)。Glynn等［25］對(duì)485個(gè)親本和1072個(gè)雜交后代材料檢測(cè)顯示， Bru1是佛羅里達(dá)甘蔗遺傳基礎(chǔ)中褐銹病抗性的主要來源， 這與本研究的結(jié)論也是相同的。Racedo等［26］研究揭示 EEAOC常用親本材料和種質(zhì)資源中除 Bru1外， 還存在甘蔗褐銹病潛在替代抗性來源， 這一發(fā)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)大甘蔗褐銹病抗性狹窄的遺傳基礎(chǔ)有幫助。相應(yīng)地， 本研究中也有 29份抗褐銹病育種親本未被檢測(cè)到抗褐銹病基因 Bru1， 與我們前期研究有 20份抗褐銹病野生核心種質(zhì)資源（多為割手密）［21］未被檢測(cè)到抗褐銹病基因 Bru1的結(jié)果一致， 暗示除了Bru1外， 可能還有其他抗褐銹病基因存在， 有待于進(jìn)一步深入研究發(fā)掘， 從而克服抗源單一， 選擇性增加其他類型抗病基因在抗病育種中的引入與利用， 避免由銹菌致病性變異引起B(yǎng)ru1抗性喪失的潛在威脅。

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Identification of Resistance to Brown Rust and Molecular Detection of Bru1 Gene in 101 Main Sugarcane Breeding Parents in China

LI Wen-Feng， WANG Xiao-Yan， HUANG Ying-Fun*， ZHANG Rong-Yue， SHAN Hong-Li， LUO Zhi-Ming，and YIN Jiong

Sugarcane Research Institute， Yunnan Province Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement，Kaiyuan 661699， China

Sugarcane brown rust induced by Puccinia melanocephala is an important global disease. Bru1 is a major brown rust resistance gene with a broad-spectrum resistance against various brown rust pathogens originating from different countries. In order to assess the resistance level of main sugarcane breeding parents to Puccinia melanocephala， and determine the distribution of the Bru1 gene in these breeding parents in China， 101 main sugarcane breeding parents collected from the Chinese National Nursery of Sugarcane Germplasm Resources were evaluated and identified for their brown rust resistance at the seedling stage and for the presence of the brown rust resistance gene Bru1. Bru1 was detected to present in 48 （47.5%） resistant materials out of the 101 tested parental lines， indicating that brown rust resistance in main sugarcane breeding parents in China is primarily controlled by Bru1. The absence of Bru1 in the other 29 resistant and 24 susceptible parental lines suggests that they may carry brown rust resistance-associated genes other than Bru1. These results may facilitate future efforts to breed varieties with improved resistance to brown rust and may provide resistant parental lines for selecting and planting elite resistant varieties to effectively control brown rust disease in sugarcane.

Sugarcane； Main breeding parents； Brown rust resistance gene Bru1； Molecular detection

10.3724/SP.J.1006.2016.01411

本研究由國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-20-2-2）和云南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資助。

This study was supported by China Agriculture Research System （CARS-20-2-2） and the Agriculture Research System of Yunnan Province.*

（Corresponding author）： 黃應(yīng)昆， E-mail： huangyk64@163.com， Tel： 0873-7227017

聯(lián)系方式： E-mail： ynlwf@163.com， 0873-7227004

Received（）： 2016-03-17； Accepted（接受日期）： 2016-06-20； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）： 2016-06-29.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160629.0822.004.html