孫明月，高敏杰，李由然，2（.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 2422；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 2422）

動物細(xì)胞在Production罐和衛(wèi)星罐中的培養(yǎng)過程

孫明月1，高敏杰1，李由然1，2
（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

動物細(xì)胞培養(yǎng)對工藝參數(shù)的控制有很高的要求，尤其是培養(yǎng)液的溶氧水平對細(xì)胞的生長有著極大的影響。本文主要研究了衛(wèi)星罐溶氧校準(zhǔn)方法的建立以及動物細(xì)胞培養(yǎng)過程。首先建立了衛(wèi)星罐在空氣中校準(zhǔn)溶氧100%的方法。其次，在生產(chǎn)中的production反應(yīng)器與衛(wèi)星罐中分別對CHO和NS0細(xì)胞進(jìn)行同步培養(yǎng)。結(jié)果表明，細(xì)胞在production反應(yīng)器內(nèi)與衛(wèi)星罐內(nèi)的生長代謝情況基本一致，兩種細(xì)胞的細(xì)胞活率在培養(yǎng)初期都比較穩(wěn)定，后期呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，活細(xì)胞密度呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢；而乳酸、葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺濃度也隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的變化而呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。

細(xì)胞培養(yǎng)；Production罐；衛(wèi)星罐

動物細(xì)胞培養(yǎng)是指離散的動物活細(xì)胞在體外人工條件下的生長、增殖過程。在此過程中，細(xì)胞不再形成組織。由于動物細(xì)胞培養(yǎng)在體外人工條件下進(jìn)行，方便觀察及調(diào)控，從而為當(dāng)今研究動物的物質(zhì)代謝過程、遺傳物質(zhì)的表達(dá)調(diào)控等提供了有效的新方法。同時(shí)，伴隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、生物化學(xué)以及現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，細(xì)胞培養(yǎng)在越來越多的領(lǐng)域得到了應(yīng)用，表現(xiàn)出了其巨大的發(fā)展?jié)摿?。由于動物?xì)胞沒有細(xì)胞壁，它對剪切力十分敏感，從而導(dǎo)致了細(xì)胞很難很好地適應(yīng)體外環(huán)境。并且，在體外人工條件下進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞，它們沒有神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間相互影響的作用，不僅導(dǎo)致它們失去了原有的組織結(jié)構(gòu)，也很難維持原有的細(xì)胞形態(tài)。因此，在體外人工條件下進(jìn)行動物細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，應(yīng)十分密切地關(guān)注細(xì)胞的生長代謝狀態(tài)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞

CHO：中國倉鼠卵巢細(xì)胞。

NS0：小鼠骨髓瘤細(xì)胞。

1.2主要儀器及設(shè)備

本論文用到的主要儀器及設(shè)備如表1所示。

表1　主要儀器及設(shè)備

1.3衛(wèi)星罐設(shè)置

主要步驟：組裝反應(yīng)器→pH電極準(zhǔn)備→DO電極準(zhǔn)備→DO零點(diǎn)校準(zhǔn)→反應(yīng)器滅菌→DO校準(zhǔn)100%。

1.4Production反應(yīng)器設(shè)置

使用buffer（模擬培養(yǎng)基：高純水中含有1.6 g/L NaHCO3，1 g/L PF68）代替培養(yǎng)基，分析DO電極在常溫空氣中與37 ℃飽和溶氧培養(yǎng)基中校準(zhǔn)100%的差異。接著將Finesse-6和Applikon-1灌注buffer后設(shè)置培養(yǎng)基溫度為37 ℃，過夜通氣（0.2 vvm）直至溶氧穩(wěn)定（18～24 h）。最后設(shè)置DO電極：Mettler-1（連接Finesse-5控制器），Mettler-2（連接Finesse-6控制器），Applikon（連接Applikon-1控制器），檢查完整性、靈敏性良好。三支DO電極分別連通電極線極化18～24 h。

1.5細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)包括細(xì)胞復(fù)蘇，細(xì)胞傳代及細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)三個(gè)步驟，參照文獻(xiàn)進(jìn)行。

1.6樣品分析

將培養(yǎng)獲得的細(xì)胞懸液通過全自動生化分析儀、細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對樣品進(jìn)行分析。

1.6.1全自動生化分析儀

提起取樣器至手動進(jìn)樣位置，輸入樣品相關(guān)信息，按“ANALYZE”鍵進(jìn)入檢測狀態(tài)，取樣探針伸出，屏幕提示呈遞樣品時(shí)，將上述樣品獲取中已獲得細(xì)胞液的EP管置于取樣探針下，按“ANALYZE”鍵自動吸取樣品，完成后取樣探針自動收回，等待檢測結(jié)果。

1.6.2細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

用移液槍吸取上述樣品獲取中已獲得細(xì)胞液的離心管內(nèi)少許樣品，分裝到兩個(gè)計(jì)數(shù)杯中（如需要?jiǎng)t使用DPBS進(jìn)行適當(dāng)稀釋），將計(jì)數(shù)杯置于細(xì)胞計(jì)數(shù)儀可用的樣品架位置，輸入樣品相關(guān)信息，開始計(jì)數(shù)，等待計(jì)數(shù)結(jié)果。

2　結(jié)果與討論

2.1Production反應(yīng)器與衛(wèi)星罐內(nèi)細(xì)胞的生長情況

Production反應(yīng)器采用傳統(tǒng)方式，在飽和溶氧的培養(yǎng)基中校準(zhǔn)DO100%，衛(wèi)星罐則在空氣中進(jìn)行DO100%校準(zhǔn)，對CHO和NS0分別在兩種反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行同步培養(yǎng)。通過觀察production反應(yīng)器內(nèi)與衛(wèi)星罐內(nèi)細(xì)胞活率、活細(xì)胞密度的變化以及乳酸、葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺濃度變化分析細(xì)胞的生長代謝情況。

通過細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測細(xì)胞活率和活細(xì)胞密度分析production反應(yīng)器內(nèi)與衛(wèi)星罐內(nèi)細(xì)胞生長情況，檢測結(jié)果如圖1、圖2、圖3和圖4所示：

圖1　CHO細(xì)胞活率變化曲線圖

圖2　NS0細(xì)胞活率變化曲線圖

圖3　CHO活細(xì)胞密度變化曲線圖

圖1、圖2、圖3和圖4為CHO和NS0分別在2 000 L production反應(yīng)器以及15 L和3 L衛(wèi)星罐中培養(yǎng)數(shù)天后的細(xì)胞活率變化曲線圖及活細(xì)胞密度變化曲線圖。2 000 L Run1為反應(yīng)器生產(chǎn)第一批，2 000 L Run2為反應(yīng)器生產(chǎn)第二批；Satellite1為衛(wèi)星罐培養(yǎng)第一批，Satellite2為衛(wèi)星罐培養(yǎng)第二批。由圖1、圖2可見，對于同一種細(xì)胞類型，production反應(yīng)器與衛(wèi)星罐內(nèi)細(xì)胞活率變化曲線基本一致，細(xì)胞活率在培養(yǎng)初期比較穩(wěn)定，CHO細(xì)胞活率從第8天開始出現(xiàn)下降趨勢，NS0細(xì)胞活率從第7天開始出現(xiàn)下降趨勢。由圖3、圖4可見，對于同一種細(xì)胞類型，兩反應(yīng)器內(nèi)活細(xì)胞密度變化曲線基本一致，曲線呈現(xiàn)先增長后下降的趨勢，CHO細(xì)胞密度在第8天達(dá)到峰值，NS0細(xì)胞密度在第7天達(dá)到峰值。

2.2Production反應(yīng)器與衛(wèi)星罐內(nèi)細(xì)胞的代謝情況

通過全自動生化分析儀檢測細(xì)胞代謝中乳酸、葡萄糖、谷氨酸和谷氨酰胺濃度變化分析production反應(yīng)器內(nèi)與衛(wèi)星罐內(nèi)細(xì)胞代謝情況，檢測結(jié)果如圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11和圖12所示：

2.2.1葡萄糖的代謝

葡萄糖的主要代謝途徑有3個(gè)：一是進(jìn)入TCA循環(huán)，二是進(jìn)入磷酸戊糖途徑，三是經(jīng)過糖酵解途徑生成多糖和乳酸。其中只有極少部分葡萄糖進(jìn)入TCA循環(huán)和磷酸戊糖途徑，大部分的葡萄糖都是通過糖酵解途徑直接轉(zhuǎn)化為乳酸［1］。由圖5、圖6、圖7和圖8可見，對于同一種細(xì)胞類型，production反應(yīng)器與衛(wèi)星罐內(nèi)乳酸濃度和葡萄糖濃度變化曲線基本一致。培養(yǎng)初期，細(xì)胞消耗葡萄糖產(chǎn)生副產(chǎn)物乳酸，葡萄糖含量不斷下降，乳酸相應(yīng)不斷積累，當(dāng)葡萄糖消耗至不能滿足細(xì)胞生長時(shí)，細(xì)胞開始消耗乳酸，因此乳酸含量開始下降。此時(shí)通過補(bǔ)充營養(yǎng)，使葡萄糖含量維持在穩(wěn)定水平，乳酸含量也基本穩(wěn)定。此外，由于CHO和NS0細(xì)胞類型的不同以及兩種細(xì)胞培養(yǎng)工藝的不同，兩種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，乳酸積累達(dá)到的最高濃度相應(yīng)不同，葡萄糖及乳酸濃度穩(wěn)定的水平也相應(yīng)的不同。

圖4　NS0活細(xì)胞密度變化曲線圖

圖5　CHO培養(yǎng)過程中乳酸濃度變化曲線圖

圖6　NS0培養(yǎng)過程中乳酸濃度變化曲線圖

圖7　CHO培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度變化曲線圖

圖8　NS0培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度變化曲線圖

圖9　CHO培養(yǎng)過程中谷氨酸濃度變化曲線圖

圖10　NS0培養(yǎng)過程中谷氨酸濃度變化曲線圖

圖11　CHO培養(yǎng)過程中谷氨酰胺濃度變化曲線圖

圖12　NS0培養(yǎng)過程中谷氨酰胺濃度變化曲線圖

2.2.2谷氨酰胺的代謝

谷氨酰胺的碳骨架有三條代謝途徑，即進(jìn)入TCA循環(huán)以及通過轉(zhuǎn)氨途徑生成非必需氨基酸，還有部分直接合成胞內(nèi)蛋白和抗體。在細(xì)胞中，谷氨酰胺主要通過谷氨酰胺酶脫氨生成氨和谷氨酸進(jìn)入代謝途徑。谷氨酸可經(jīng)谷氨酸脫氫酶催化脫氫生成α-酮戊二酸和氨，還可由轉(zhuǎn)氨酶催化途徑生成α-酮戊二酸和非必需氨基酸如丙氨酸、天冬氨酸等，生成的α-酮戊二酸進(jìn)入TCA循環(huán)［1］。由圖9、圖10、圖11和圖12可見，對于同一種細(xì)胞類型，production反應(yīng)器與衛(wèi)星罐內(nèi)谷氨酸和谷氨酰胺濃度變化曲線基本一致。培養(yǎng)初期，細(xì)胞消耗谷氨酰胺較多，谷氨酰胺濃度呈下降趨勢，同時(shí)生成副產(chǎn)物谷氨酸，谷氨酸逐漸積累，后期谷氨酰胺濃度逐漸趨于平穩(wěn)，谷氨酰胺含量則呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。同時(shí)，由于CHO和NS0細(xì)胞類型的不同以及兩種細(xì)胞培養(yǎng)工藝的不同，兩種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中，谷氨酸在逐漸積累的過程中達(dá)到的濃度相應(yīng)不同，谷氨酰胺濃度穩(wěn)定的水平也相應(yīng)的不同。

［1］高紅亮，叢威，歐陽藩.雜交瘤細(xì)胞的代謝流量分析［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2000，（6）.

（編輯：張淑鳳）

Q814

A

1006-799X（2016）12-0089-04

孫明月（1994-），女，江蘇泰州人，本科在讀，主要從事生物技術(shù)的研究工作。