張愛平， 鄒玖明， 尹艷華

第三芽孢梭菌致顱內(nèi)感染的檢測(cè)與分析

張愛平， 鄒玖明*， 尹艷華

目的 對(duì)分離的1株耐氧生長(zhǎng)的厭氧菌進(jìn)行鑒定及藥敏分析。方法 利用API 20A進(jìn)行生化鑒定、瓊脂稀釋法進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和測(cè)序技術(shù)分析該菌的16SrRNA基因。頭孢硝噻吩紙片法檢測(cè)細(xì)菌β內(nèi)酰胺酶，PCR擴(kuò)增β內(nèi)酰胺酶cfxA耐藥基因。結(jié)果 經(jīng)鑒定，該株厭氧菌為第三芽孢梭菌，經(jīng)16SrRNA分析與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫中第三芽孢梭菌相似性達(dá)100%，藥敏結(jié)果顯示該菌對(duì)亞胺培南、四環(huán)素、甲硝唑敏感，對(duì)氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢替坦耐藥。結(jié)論 該株厭氧菌為第三芽孢梭菌，攜帶cfxA耐藥基因。

第三芽孢梭菌； 基因； cfxA； 藥敏試驗(yàn)

第三芽孢梭菌是革蘭染色陽性的芽孢桿菌，屬于芽孢梭菌屬。該菌寄生于哺乳動(dòng)物及人類口腔、腸道中，可隨糞便排出體外，在外界土壤中廣泛存在。由于該菌不產(chǎn)毒素，一直以來認(rèn)為沒有致病意義。1917年HENRY［1］從戰(zhàn)傷患者壞疽組織首次分離出第三芽孢梭菌，但不能肯定其致病性；直到1936年KING等［2］從敗血癥患者血液中分離出該菌，才首次闡明了其在人類疾病中的致病意義。2014年12月我院神經(jīng)外科1例顱內(nèi)感染患者腦脊液中分離出1株第三芽孢梭菌，現(xiàn)將檢測(cè)過程和藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1一般資料 患者，男，52歲。因“頭痛、頭暈伴發(fā)熱2 d”入院?；颊? d前頭皮外傷，已在我院門診行清創(chuàng)縫合，但之后出現(xiàn)頭痛、頭暈伴體溫升高。顱內(nèi)穿刺顯示顱內(nèi)壓增高（2.8 kPa），頭皮傷口縫合處微紅、腫，有滲出液。入院初即采集傷口滲出液、腦脊液及血液標(biāo)本進(jìn)行微生物學(xué)檢查。

1.1.2試劑與儀器 API 20A試劑條購自法國(guó)生物梅里埃公司，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）引物、DNA標(biāo)記、Taq酶、各種限制性內(nèi)切酶均購自大連寶生物公司，其他生化試劑購自美國(guó)SIGMA公司，序列分析在上海生工生物工程有限公司進(jìn)行，Prism 7300型PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。血培養(yǎng)瓶，哥倫比亞血瓊脂干粉、布氏瓊脂為生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1生化鑒定及藥敏試驗(yàn) 將血培養(yǎng)瓶分離到的菌株轉(zhuǎn)種至哥倫比亞血平皿，35 ℃培養(yǎng)48～72 h，按照API 20A試劑條操作程序進(jìn)行生化鑒定?？咕幬锩舾行栽囼?yàn)采用瓊脂稀釋法檢測(cè)，具體操作及判斷折點(diǎn)參考2012 CLSI M11-A7文件，厭氧環(huán)境孵育48 h后讀取最低抑菌濃度（MIC）值。

1.2.216SrRNA鑒定 試驗(yàn)菌株接種哥倫比亞血平皿，35 ℃培養(yǎng)48～72 h，吸取1 mL菌液，采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒制備模板，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?6SrRNA的PCR擴(kuò)增采用通用引物序列，產(chǎn)物大小944 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后進(jìn)行BLAST序列比對(duì)分析，見表1。

表1　16SrRNA、cfxA基因引物序列Table 1 Primers used in PCR assay for 16SrRNA and cfxA genes

1.2.3β內(nèi)酰胺酶及其耐藥基因檢測(cè) 頭孢硝噻吩（OXOID公司產(chǎn)品）紙片法檢測(cè)細(xì)菌β內(nèi)酰胺酶，PCR擴(kuò)增β內(nèi)酰胺酶cfxA耐藥基因，引物參照文獻(xiàn)合成［3-4］。核酸提?。?取布氏瓊脂上生長(zhǎng)48 h菌落懸于100 μL無菌去離子水，調(diào)整濁度至1.5麥?zhǔn)蠁挝?，蓋緊離心管于震蕩器上震蕩混勻，加熱96 ℃，10 min，立即轉(zhuǎn)移冰浴5 min后，12 000 r/min離心5 min，上清液作為擴(kuò)增模板液。反應(yīng)條件：94 ℃5 min預(yù)變性，94 ℃1 min，58 ℃1 min，72 ℃90 s，25個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，Goldenview染色，凝膠成像儀讀取結(jié)果。

2　結(jié)果

2.1培養(yǎng)結(jié)果菌落特征及生化鑒定

血液培養(yǎng)顯示無細(xì)菌生長(zhǎng)，傷口滲出液及腦脊液培養(yǎng)均分離出革蘭陽性桿菌。

腦脊液及傷口滲出液培養(yǎng)各分離到1株細(xì)菌在哥倫比亞血平皿上生長(zhǎng)緩慢，24 h后菌落針尖樣大小，48～72 h方可見直徑1～2 mm菌落，扁平透明，邊緣光整，不溶血。厭氧和需氧環(huán)境培養(yǎng)，菌落革蘭染色為陽性桿菌，但易脫色，厭氧培養(yǎng)條件下可見未染色芽孢，而需氧培養(yǎng)條件下未見，見圖1。API 20A生化鑒定均為第三芽孢梭菌，生物編碼一致，為47746023，符合率99.99%，該2株菌判斷為同一株細(xì)菌。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)亞胺培南、四環(huán)素、甲硝唑敏感，而對(duì)氨芐西林、阿莫西林-克拉維酸、頭孢替坦耐藥，見表2。

圖1　第三芽孢梭菌革蘭染色圖（1000×）Figure 1 Representative gram stain images of Clostridium tertium（1000×）

表2　第三芽孢梭菌抗菌藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Susceptibility of the Clostridium tertium strain to antimicrobial agents （mg/L）

2.216SrRNA種屬鑒定

經(jīng)過16SrRNA保守區(qū)基因擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示950 kb處有一清晰對(duì)應(yīng)條帶，見圖2。將擴(kuò)增后產(chǎn)物測(cè)序，BLAST序列比對(duì)顯示與NCBI數(shù)據(jù)庫中第三芽孢梭菌相似性達(dá)100%，為同一種屬。

圖2　16SrRNA保守區(qū)基因電泳結(jié)果Figure 2 Electrophoretogram of 16SrRNA gene amplified by PCR

2.3β內(nèi)酰胺酶及其基因檢測(cè)

來源于傷口滲出液及腦脊液的2株第三芽孢梭菌的β內(nèi)酰胺酶檢測(cè)均為陽性。PCR結(jié)果顯示cfxA基因均陽性，見圖3。

圖3　cfxA基因檢測(cè)電泳結(jié)果Figure 3 Electrophoretogram of cfxA gene amplified by PCR

3　討論

依靠細(xì)菌的保守區(qū)基因設(shè)計(jì)引物對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定是準(zhǔn)確可靠的方法之一。16SrRNA基因序列分子在結(jié)構(gòu)與功能上具有高度的保守性，可以實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地對(duì)微生物進(jìn)行分類鑒定。本研究中，2株不同來源分離菌株通過生化反應(yīng)均鑒定為第三芽孢梭菌，16SrRNA 分析進(jìn)一步驗(yàn)證了表型結(jié)果。

由于該菌的生物學(xué)特性有異于其他種類細(xì)菌，因此很容易被錯(cuò)誤鑒定或忽略。例如在革蘭染色的過程中該菌很容易被脫色而誤認(rèn)為革蘭陰性桿菌，在鑒別上可以觀察在其他革蘭陰性菌選擇性平皿上（如麥康凱、含萬古霉素巧克力平皿）的生長(zhǎng)情況來綜合判定，該菌不會(huì)在這類選擇性平皿上生長(zhǎng)。此外，該菌不同于其他的厭氧芽孢梭菌，在有氧環(huán)境下也可以緩慢生長(zhǎng)，具有一定的耐氧性，這是很重要的一點(diǎn)，因?yàn)樵谛柩醐h(huán)境分離的第三芽孢梭菌很容易被誤認(rèn)為是乳桿菌或棒狀桿菌而被忽略。它們的區(qū)別在于乳桿菌不會(huì)形成芽孢，第三芽孢梭菌在厭氧條件下可以形成芽孢；棒狀桿菌屬觸酶試驗(yàn)陽性，而第三芽孢梭菌觸酶試驗(yàn)陰性；其他的芽孢梭菌往往在有氧環(huán)境下形成芽孢，而第三芽孢梭菌與之恰恰相反。

以往認(rèn)為第三芽孢梭菌不產(chǎn)生毒素，因此難以肯定它的致病意義［5］。但近期越來越多的報(bào)道顯示，該菌在人類多種疾病中起著重要的作用。2011年，STEENSMA等［6］在1例糖尿病患者伴發(fā)壞死性軟組織感染病灶中分離出第三芽孢梭菌；2013年SALVADOR等［7］報(bào)道第三芽孢梭菌在急性白血病伴中性粒細(xì)胞減少發(fā)熱患者中引起急性血流感染；2015年，VIROT等［8］報(bào)道1例兩伊戰(zhàn)爭(zhēng)后30年由于體內(nèi)金屬碎片殘留而引起繼發(fā)的第三芽孢梭菌骨關(guān)節(jié)感染。本例中，從患者頭皮傷口滲出液、腦脊液均分離出第三芽孢梭菌，提示該菌與患者傷口愈合不良、顱內(nèi)感染有關(guān)。

研究顯示，第三芽孢梭菌感染主要與3個(gè)因素有關(guān)：腸黏膜屏障受損、中性粒細(xì)胞減少和β內(nèi)酰胺類抗生素的過度使用（尤其是第三代廣譜頭孢菌素的使用）［9］。究其原因可能是因?yàn)榈谌挎咚缶ㄖ灿谀c道，腸黏膜屏障受損有利于細(xì)菌侵入腸壁，隨血流侵入遠(yuǎn)端部位，造成移位感染；中性粒細(xì)胞減少會(huì)降低機(jī)體的防御功能，不利于免疫系統(tǒng)對(duì)入侵細(xì)菌的吞噬殺滅；而廣譜抗生素的使用會(huì)造成腸道菌群失衡，間接損傷腸黏膜屏障。盡管第三芽孢梭菌感染的患者多伴有發(fā)熱，使用抗生素治療一定程度上亦利于降低體溫，但迄今為止沒有直接證據(jù)顯示發(fā)熱是因?yàn)樵摼腥疽?。本研究中，患者并不伴中性粒?xì)胞減少，抗生素的使用距離發(fā)病間隔時(shí)間短暫，因此病原菌很可能不是來自于腸道定植細(xì)菌移位，而是來自于外環(huán)境：患者頭部縫合傷口感染，細(xì)菌經(jīng)此途徑侵入，造成顱內(nèi)感染。本研究中分離的第三芽孢梭菌對(duì)甲硝唑、氟喹諾酮類、亞胺培南敏感，而對(duì)青霉素、頭孢菌素類耐藥，基因檢測(cè)結(jié)果提示均攜帶cfxA基因。cfxA基因主要介導(dǎo)厭氧菌對(duì)β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥性，在厭氧菌耐藥基因的水平傳遞中起著重要作用，在擬桿菌屬、普雷沃菌屬及二氧化碳嗜纖維菌中均有報(bào)道［10］。本例患者采用萬古霉素治療，病情好轉(zhuǎn)。

目前有關(guān)第三芽孢梭菌研究的臨床病例太少，盡管已經(jīng)意識(shí)到其致病性，但該菌的毒力因子、致病機(jī)制、感染易感因素均不詳，還有待于進(jìn)一步探討。

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Characterization of a strain of Clostridium tertium causing intracranial infection

ZHANG Aiping， ZOU Jiuming， YIN Yanhua. （Intensive Care Unit， Xiangyang Central Hospital， Xiangyang Hubei 441021， China）

Objective To identify an anaerobic strain isolated from a patient with intracranial infection， and characterize the strain in terms of antibiotic resistance and relevant genes. Methods The strain was identified by API 20A. Susceptibility to antimicrobial agents was tested by agar dilution method. PCR and sequencing analysis was used to analyze 16SrRNA gene. Nitrocefin test was used to determine the production of lactamases. Beta-lactamase cfxA gene was detected by PCR. Results This anaerobic isolate was confirmed as Clostridium tertium. Susceptibility testing showed that this strain was susceptible to imipenem， tetracycline，metronidazole， and vancomycin， but resistant to ampicillin， amoxicillin-clavulanate， and cefotetan. The sequence of 16SrRNA gene showed 100% homologous with that in NCBI database. Conclusions This anaerobic isolate is confirmed as Clostridium tertium carrying cfxA gene， which mediates resistance to beta-lactam antibiotics.

Clostridium tertium； resistance gene； cfxA； antimicrobial susceptibility testing

·論著·

R378.8

A

1009-7708（2016）01-0071-04

10.16718/j.1009-7708.2016.01.016

湖北文理學(xué)院附屬醫(yī)院 襄陽市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北襄陽 441021；*醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)部。

張愛平（1982—），女，本科，護(hù)師，主要從事醫(yī)院感染工作。

尹艷華，E-mail： 5650722273@qq.com。

2015-03-27

2015-07-21