霍文杰　杜蘭哲　李　慧　官永河　趙徑華　陳向東（廣東一方制藥有限公司　佛山　528244）

黃連解毒湯配方顆粒中4種成分含量的測(cè)定及與傳統(tǒng)湯劑的比較△

霍文杰杜蘭哲李慧官永河趙徑華陳向東（廣東一方制藥有限公司佛山528244）

目的：建立一種同時(shí)測(cè)定黃連解毒湯配方顆粒中4種成分（梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿）含量的HPLC方法，對(duì)黃連解毒湯配方顆粒和傳統(tǒng)湯劑的主要色譜峰及成分含量進(jìn)行比較。方法：采用菲羅門Gemini 5u C18110A色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以每100mL水中含1mL pH=6.0的醋酸-醋酸銨緩沖溶液為流動(dòng)相B；梯度洗脫，體積流量為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，柱溫30℃。結(jié)果：在39min內(nèi)黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿4種成分完全分離；回歸方程顯示4種成分的峰面積與其濃度呈良好的線性關(guān)系；4種成分的平均加樣回收率（n=6）為95.02%～104.57%，RSD均小于3.0%；黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑的主要色譜峰的峰形峰位一致，成分含量相當(dāng)。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單快捷，靈敏度高，穩(wěn)定、重復(fù)性好，可用于黃連解毒湯配方顆粒的質(zhì)量控制，黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑的主要成分一致，可為其替代傳統(tǒng)湯劑作為理論依據(jù)。

黃連解毒湯 配方顆粒 高效液相色譜法 含量測(cè)定 傳統(tǒng)湯劑

黃連解毒湯出自唐·《外臺(tái)秘要》，由黃連、黃芩、黃柏和梔子4味藥材組成，為清熱解毒的經(jīng)典方劑，具有清熱、瀉火、解毒功效。其中黃連、黃柏的主要有效成分為生物堿類，含有小檗堿、巴馬汀和藥根堿等；黃芩的主要成分為黃酮類，含有黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等；梔子的主要成分有梔子苷，屬環(huán)烯醚萜類。研究表明黃連解毒湯具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗內(nèi)毒素、改善腦缺血和缺氧、降血糖、調(diào)血脂、降膽固醇、逆轉(zhuǎn)細(xì)菌及抑制細(xì)胞耐藥性、保護(hù)心肌、保護(hù)腸黏膜、保肝、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、治療神經(jīng)退行性病變等多方面作用［1～8］。黃連解毒湯水提液進(jìn)一步加工而成的黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿的含量較高，為主要的活性成分，因此，測(cè)定這4種成分含量對(duì)黃連解毒湯配方顆粒的質(zhì)量控制具有重要的意義。目前，采用HPLC法測(cè)定黃連解毒湯中各有效成分的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但多數(shù)的色譜分離效果較差或檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，本文擬探索建立一種同時(shí)測(cè)定黃連解毒湯配方顆粒中4種主要有效成分含量的方法，并對(duì)黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑成分及含量初步比較，為臨床應(yīng)用黃連解毒湯配方顆粒提供理論依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器：Agilent高效液相色譜儀、BS110S萬(wàn)分之一天平（賽多利斯）、BS200S-WEI千分之一天平（賽多利斯）、xP26百萬(wàn)分之一天平（METTLER TOLEDO）、WS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）。

1.2試藥：梔子苷（批號(hào)：110749-201316，含量以97.5%計(jì)）；黃芩苷（批號(hào)：110715-201318，含量以93.3%計(jì)）；鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)：110732-201309，含量以86.6%計(jì)）；鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-201212，含量以86.7%計(jì)）均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；黃連、黃芩、黃柏、梔子藥材均購(gòu)自廣州市藥材公司，經(jīng)魏梅副主任中藥師鑒定均為正品；黃連解毒湯配方顆粒，由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)；乙腈（色譜純）；水為純凈水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件：色譜柱：菲羅門Gemini 5u C18110A（250mm× 4.6mm，5μm）柱；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，以每100mL水中含1mL pH=6.0的醋酸-醋酸銨緩沖溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，0～25min，10%～26%A；25～34min，26%～36%A；34～39min，36%A；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；柱溫：30℃；體積流量：1mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

2.2混合對(duì)照品溶液的制備：精密稱取梔子苷對(duì)照品3.253mg、黃芩苷對(duì)照品1.949mg、鹽酸巴馬汀對(duì)照品0.345mg及鹽酸小檗堿對(duì)照品2.882mg，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1mL含梔子苷126.87μg、黃芩苷72.74μg、鹽酸巴馬汀11.95μg、鹽酸小檗堿99.95μg的混合對(duì)照品溶液。

2.3供試品溶液與陰性樣品溶液的制備：取黃連解毒湯配方顆粒0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液5mL置25mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

采用上述黃連解毒湯配方顆粒的制備方法分別制備缺黃芩陰性樣品、缺梔子陰性樣品和缺黃連、黃柏陰性樣品，按供試品溶液的制備方法，分別制備陰性樣品溶液。

2.4醋酸-醋酸銨緩沖溶液的制備：取醋酸銨100g，加水300mL，冰醋酸7mL，搖勻，即得。

2.5專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果樣品中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿都能較好分離，陰性樣品無(wú)干擾，理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，見圖1。

2.6線性關(guān)系考察：分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、2、4、8、12、14、16μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積，以峰面積積分值對(duì)各成分含量進(jìn)行回歸處理，求得梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

表1　四種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.7精密度實(shí)驗(yàn)：分別精密吸取含梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積。結(jié)果顯示四種成分峰面積的RSD分別為1.04%、0.67%、0.50%、0.62%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，儀器精密度較好。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取供試品溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、1、2、4、8、12h進(jìn)樣測(cè)定，記錄梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積。黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿峰面積的RSD分別為1.92%、1.00%、1.10%、1.06%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取黃連解毒湯配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.3g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量。6份黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿的含量分別為35.97mg/g、56.72mg/g、8.96mg/g、54.24mg/g，RSD分別為 0.91%、1.03%、0.76%、0.71%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此含量測(cè)定方法重復(fù)性較好。

2.10加樣回收實(shí)驗(yàn)：取已知含量的黃連解毒湯配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.15g（含量：梔子苷35.97mg/g、黃芩苷56.72mg/g、鹽酸巴馬汀8.96mg/g、鹽酸小檗堿54.24mg/g），精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，精密加入梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿混合對(duì)照品溶液（甲醇溶解，濃度分別為0.4523mg/mL、0.7008mg/mL、0.1086mg/mL、0.6700mg/mL）12mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果此含量測(cè)定方法回收率較好，四種成分平均回收率分別為103.42%、97.40%、98.05%、95.99%，RSD為1.49%、2.13%、0.80%、0.81%，結(jié)果見表2。

表2　黃連解毒湯配方顆粒4種成分加樣回收率結(jié)果

2.11樣品含量測(cè)定：分別制備6批黃連解毒湯顆粒劑供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算黃連解毒湯顆粒劑中4種成分含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3　黃連解毒湯顆粒劑中4種成分的含量測(cè)定結(jié)果（n=6）

3　黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑的比較

3.1傳統(tǒng)湯劑樣品的制備：按處方取藥材飲片共30g（1劑處方量），按《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》［9］操作，加10倍量水浸泡30min，加熱至沸，保持微沸30min，趁熱過(guò)濾；藥渣加8倍量水二煎，加熱至沸后，保持微沸30min，趁熱濾過(guò)，合并濾液，定容至1000mL作為傳統(tǒng)湯劑。

3.2黃連解毒湯配方顆粒樣品的制備：取黃連解毒湯配方顆粒7.50g（相當(dāng)1劑處方量），加熱水溶解，定容至1000mL。

3.3黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑樣品色譜圖譜與含量的比較：精密吸取上述樣品溶液各5mL，精密量取25mL，蒸干，殘?jiān)状既芙?，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品溶液，精密吸取10μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，對(duì)二者的色譜圖進(jìn)行比較，并對(duì)樣品液中4種成分的含量進(jìn)行測(cè)定，見圖2與表4。

表4　黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑樣品的4種成分含量的比較（n=3±s）

表4　黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑樣品的4種成分含量的比較（n=3±s）

樣品　梔子苷mg·mL-1黃芩苷mg·mL-1鹽酸巴馬汀mg·mL-1鹽酸小檗堿mg·mL-1傳統(tǒng)湯劑　1.06±0.05　1.69±0.09　0.26±0.03　1.63±0.07配方顆?！?.01±0.06　1.57±0.13　0.34±0.08　1.76±0.11

4　討　論

本研究采用梯度法，在同一色譜條件下測(cè)定了黃連解毒湯配方顆粒中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿4種成分的含量，色譜圖基線平穩(wěn)，4種成分能較好分離，相關(guān)峰分離度均大于1.5，在39min內(nèi)4種成分能達(dá)到完全分離，大大縮短了分析時(shí)間，提高了分析效率，可用于黃連解毒湯配方顆粒有效成分含量的快速檢測(cè)。

黃連解毒湯配方顆粒主要含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類和生物堿類3類成分。其中，梔子苷屬環(huán)烯醚萜類，極性較大；黃芩苷屬黃酮類（弱酸性），極性較小；鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿屬于生物堿類（弱堿性），常以季銨鹽的形式存在，對(duì)流動(dòng)相pH的輕微變化反應(yīng)極為敏感。3類成分的理化性質(zhì)差別較大，很難在等度洗脫條件下實(shí)現(xiàn)同時(shí)分離。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)［10～12］，比較了乙腈-水流動(dòng)相中不同濃度的磷酸-三乙胺、乙腈-磷酸緩沖鹽流動(dòng)相中不同濃度三乙胺對(duì)黃連解毒湯配方顆粒HPLC分析的影響，結(jié)果兩種色譜系統(tǒng)均未能很好地將鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿分離，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)不同比例的乙腈和不同pH值的流動(dòng)相對(duì)4種成分的保留時(shí)間及其相鄰峰的分離度有不同程度的影響，通過(guò)嘗試乙腈-乙酸銨緩沖鹽系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在此色譜系統(tǒng)條件下，能夠改善生物堿類物質(zhì)的峰形，減少色譜拖尾及基線漂移，能將鹽酸巴馬汀與鹽酸小檗堿很好地分離。

本研究對(duì)黃連解毒湯配方顆粒與傳統(tǒng)飲片湯劑中梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿等主要色譜峰進(jìn)行比較分析，色譜峰峰形基本相似，主要峰的保留時(shí)間相同，試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連解毒湯配方顆粒中的梔子苷、黃芩苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿含量與傳統(tǒng)湯劑相當(dāng)，從而為黃連解毒湯配方顆粒替代傳統(tǒng)飲片提供了理論依據(jù)。

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Simultaneous Detection of the Contents of four Components in HuangLian Jiedu Decoction Compound granules by HPLC and compared with the traditional decoction

Huo Wenjie Du Lanzhe Li Hui Guan Yonghe Zhao Jinghua Chen xiangdong（Guangdong Yi Fang Pharmaceutical Co.，Ltd.，F(xiàn)oshan 528244，China）

Objective：To establish a method of HPLC which can simultaneously detect the contents of four components in cluding geniposide，baicalin，palmatine，berberine in HuangLian Jiedu decoction granule，and compare the main chromatographic peaks between HuangLian Jiedu Decoction Compound granules and the traditional decoction．Methods：The samples were separated by a Phenomenex C18column（250mm×4.6mm，5μm）with a linear gradient elution under predetermined procedures．Additionally，with acetonitrile as mobile phase A，acetate-containing 1mL PH=6.0 per 100mL of water ammonium acetate buffer solution as mobile phase B，at a flow rate of 1.0mL·min-1．The column temperature was set at 30℃．The eluate was detected at the wavelength of 260nm．Results：Four active components mentioned above in HuangLian Jiedu decoction Formula Granule were completely separated within 39 minutes by the method of HPLC．The regression model suggested a sound linear correlation between the peak areas of four components and corresponding contents.And the average recovery rate（n=6）of the markers listed above ranged from 95.02%to 104.57%．All the relative standard deviations were Less than3.0%．a(chǎn)nd the main chromatographic peaks of HuangLian Jiedu Decoction Compound granules were the same as the traditional decoction．Conclusion：The method of HPLC was convenient and accurate to detect the contents of three active components in Bazheng decoction Formula Granule simultaneously，the main chromatographic peaks of HuangLian Jiedu Decoction Compound granules were the same as the traditional decoction，which is valuable for HuangLian Jiedu Decoction Compound granules to replace the traditional decoction.

Huanglianjiedu decoction Formula Granule HPLC Content detection Traditional decoction

R284.1

A

1672-8351（2016）02-0010-03

佛山市科技創(chuàng)新專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2013GQ100032）