龐庭才，胡上英，陸媛媛，廖燕星

（欽州學院食品工程學院，廣西欽州535099）

微波輔助提取紅菇多糖及抗氧化性研究

龐庭才，胡上英，陸媛媛，廖燕星

（欽州學院食品工程學院，廣西欽州535099）

以紅菇多糖得率為評價指標，采用微波輔助提取法，通過正交試驗對紅菇多糖提取工藝進行優(yōu)化，并研究紅菇多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基和對DPPH自由基的清除作用。結果表明，微波輔助提取紅菇多糖的最佳工藝條件為提取時間6 m in，微波功率240 W，料液比1：25（g：mL），pH 9.0，在此條件下，多糖得率為5.39%。紅菇多糖對羥基自由基、超氧陰離子自由基和對DPPH自由基均有明顯的清除作用，且清除率隨多糖質量濃度增加而增大。

紅菇；微波；多糖；抗氧化

紅菇（Russula vinosa）又名美麗紅菇、大紅菇、真紅菇，屬于擔子菌綱，傘菌目、紅菇科、紅菇屬，是一種野生名貴稀有的藥食兼用菌［1］。紅菇的子實體各個部位特別是菌褶很脆，菌柄短而粗，菌蓋常有顏色［2-3］。已有研究發(fā)現(xiàn)，紅菇中含有豐富的蛋白質、碳水化合物、維生素、氨基酸以及人體必需的各種微量元素［4-5］，其中紅菇多糖、麥角甾醇、酸類和雜環(huán)衍生物等功能成分，具有降膽固醇、治療失血性貧血、提高機體免疫力、抗癌、抗炎、增強血管收縮等功效［6-8］。多糖提取工藝主要有酸堿提取法、超聲輔助提取、微波輔助提取、復合酶輔助提取以及多種方法的聯(lián)用。其中微波輔助提取法是利用微波能的加熱效應來加速溶劑對固體樣品中目標化合物的提取的新技術。史碧波［9］利用微波輔助提取通過正交試驗法從雞油菌中提取多糖，多糖得率為13.55%。李志洲［10］利用微波輔助提取杏鮑菇中多糖，得率可達11.80%。目前，利用微波輔助提取多糖的技術比較成熟，但在用于提取紅菇多糖方面的研究還比較少，因此本研究以紅菇為原料，采用微波輔助提取法對紅菇多糖的提取工藝進行優(yōu)化，為進一步開發(fā)和利用紅菇資源提供相應的技術支持。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

紅菇：市售；葡萄糖、硫酸、乙醇、苯酚、三氯化鐵等（均為分析純）：上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司；EL204型電子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；ERZA5110A型鼓風干燥箱：上海智誠分析儀器制造有限公司；UV-3200型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；H1850型臺式離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3方法

1.3.1工藝流程

紅菇烘干→粉碎→原料預處理→回流提取→過濾→澄清液→濃縮液→醇析→洗滌→真空干燥→粗多糖

1.3.2標準曲線的測定

分別吸取0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L的葡萄糖標準溶液（100 mg/L）置20 m L具塞玻璃試管中，用蒸餾水補至1.0 m L。加入1.0 m L 5%苯酚溶液后，快速加入5.0 m L 98%硫酸，靜置10 min后振蕩10 min，然后將試管放置于30℃水浴20 min，取出冷卻至室溫，以空白作對照，在波長490 nm處測定其吸光度值，制定葡萄糖標準曲線。

1.3.3多糖提取單因素試驗

按一定的料液比加入紅菇粉末和設定pH的水，在設定微波功率條件下浸提一定提取時間后，4 000 r/min離心10 min，過濾，濾液加入3倍體積分數(shù)為95%乙醇進行沉淀，然后再過濾，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮及乙醚多次清洗，沉淀為紅菇多糖。將紅菇多糖溶于蒸餾水中并定容至1 000 m L后，于波長490 nm處測吸光度值，計算紅菇多糖得率。

提取時間的確定：在微波功率320 W，料液比1∶20（g∶m L），pH 7.0的條件下，考察不同提取時間（5 m in、6 min、7 min、8 min、9 min）對紅菇多糖提取效果的影響。

微波功率的確定：在提取時間7 min，料液比1∶20（g∶m L），pH 7.0的條件下，考察不同微波功率（80W、160W、240 W、320 W、400 W）對紅菇多糖提取效果的影響。

料液比的確定：在微波功率320 W，提取時間6 m in，pH 7.0的條件下，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶m L））對紅菇多糖提取效果的影響。

pH的確定：在微波功率320 W，提取時間6 min，料液比1∶20（g∶m L）的條件下，考察不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）對紅菇多糖提取效果的影響。

1.3.4多糖提取正交試驗

在單因素試驗基礎上，設計L9（34）正交試驗，考察提取時間、微波功率、料液比和pH對紅菇多糖得率的影響，以確定最佳提取工藝參數(shù)。正交試驗因素與水平見表1。

表1　紅菇多糖提取條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experim ents for Russula vinosa polysaccharides extraction conditions optim ization

1.3.5測定方法

（1）多糖得率的測定

采用苯酚-硫酸法［11］測定單糖含量，再計算紅菇樣品中多糖得率，其計算公式如下：

式中：W為樣品中多糖得率，%；m1為用回歸方程計算出的樣品測定液的含糖量，μg；V1為樣品液的定容體積，m L；V2為測定時移取的樣品測定液的體積，m L；m2為樣品的質量，g；0.9為校正系數(shù)，將葡萄糖含量換算成葡聚糖含量。

（2）羥自由基（·OH）清除率測定

分別加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液，再分別加入不同濃度樣品溶液，最后加入H2O2啟動反應，水浴離心取上清液，在波長510nm處測定吸光度值，以蒸餾水代替H2O2作為對照組，以蒸餾水代替樣品作為空白，計算樣品對·OH的清除率［12］。其計算公式如下：

式中：Ai為樣品組吸光度值；Ai0為以蒸餾水代替H2O2的對照組吸光度值；A0為以蒸餾代替樣品的空白吸光度值。

（3）超氧陰離子自由基（O2-·）清除率的測定

取Tris-HCl緩沖溶液（pH 8.2），加入不同質量濃度（1 mg/m L、2 mg/m L、3 mg/m L、4 mg/m L、5 mg/m L）的多糖溶液，混勻后保溫，然后加入鄰苯三酚反應后，在25℃水浴中反應4min，加入HCl終止反應，在波長325nm處測吸光度值，以蒸餾水作為對照，計算樣品對O2-·的清除率［13］。其計算公式如下：

式中：V1為加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率（以斜率表示）；

V0為加入蒸餾水后鄰苯三酚自氧化速率（以斜率表示）。

（4）1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的測定

取不同濃度的樣品溶液，加入DPPH溶液，避光反應后，在波長517 nm處測定吸光度值，以樣品溶液加入無水乙醇作對比，以DPPH溶液加入蒸餾水中作為空白，計算樣品對DPPH自由基的清除率［14］。其計算公式如下：

式中：Ai為DPPH+樣品的吸光度值；Ai0為樣品+無水乙醇的吸光度值；A0為DPPH+蒸餾水的吸光度值。

2　結果與分析

2.1標準曲線的測定

以葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線，結果見圖1。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標準曲線回歸方程為y=0.006 6x+0.008 5，相關系數(shù)R2=0.999 1，表明吸光度值在葡萄糖量為0～100 μg/m L范圍內(nèi)有良好的線性關系。

2.2單因素試驗

2.2.1提取時間對紅菇多糖得率的影響

圖2　提取時間對紅菇多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the extrac tion rate of polysaccha rides

由圖2可知，隨著提取時間的延長，紅菇多糖得率也隨之升高，在提取時間為7 min時得率達到最大值，之后隨著提取時間的繼續(xù)延長，多糖得率反而呈下降趨勢。可能是因為經(jīng)過一定時間的微波處理之后，樣品顆粒內(nèi)部的溫度和壓力逐漸提高，導致細胞壁破碎，加快了細胞內(nèi)物質流出速度。但微波時間也易使多糖分子水解，而致使多糖提取率下降［15］。因此，微波輔助最適時間為7 m in。

2.2.2微波功率對紅菇多糖得率的影響

圖3　微波功率對紅菇多糖得率的影響Fig.3 Effec t of m icrowave power on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，隨著微波功率的增大，紅菇多糖得率呈先遞增后下降的趨勢，其中在微波功率240 W時，多糖得率達到最大值。這因為在微波功率＜240 W時，隨著溫度的逐漸升高，對紅菇細胞壁的破壞作用增大，有利于多糖物質的溶出；當微波功率＞240 W之后，由于微波的瞬間加熱作用使得紅菇細胞中的被處理成分發(fā)生了變性，從而阻礙了提取溶劑的滲入，導致多糖物質的得率有效下降［16］。因此，微波最適功率為240 W。

2.2.3料液比對紅菇多糖得率的影響

圖4　料液比對紅菇多糖得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，料液比為1∶10～1∶25（g∶m L）時，紅菇多糖得率的上升趨勢明顯，當料液比＞1∶25（g∶m L）之后，多糖得率趨于下降?？赡艿脑蚴沁m當?shù)娜軇┯昧?，可以增加樣品與提取溶劑接觸面積和質量濃度差，有利于提取物質的擴散。而隨著料液比繼續(xù)增大，過多的提取溶劑也可能將其他物質溶出，導致多糖得率的下降，同時也會增加后續(xù)處理的難度和生產(chǎn)成本［17］。因此，最適料液比為1∶25（g∶m L）。

2.2.4pH對紅菇多糖得率的影響

圖5　pH對紅菇多糖得率的影響Fig.5 Effect of pH on the extraction rate of polysaccharides

由圖5可知，隨著pH的升高，紅菇多糖得率也隨之增加，當pH為8.0時，多糖得率達到最大值，之后隨著pH的繼續(xù)增大反而出現(xiàn)減小的趨勢?？赡艿脑蚴窃谶^酸或過堿性條件下引起多糖糖苷鍵的斷裂，而使多糖發(fā)生降解，從而導致多糖得率較低。因此，pH最優(yōu)選擇為8.0。

2.3正交試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，考察提取時間、微波功率、料液比和pH對紅菇多糖得率的影響，結果見表2。

由表2可知，影響紅菇多糖得率的各因素順序為微波功率＞提取時間＞pH＞料液比。由每個因素中K值的大小確定最優(yōu)方案為A1B2C2D3，即提取時間6min、微波功率240W、料液比1∶25（g∶m L）、pH 9.0。在此條件下進行最優(yōu)方案的驗證試驗，紅菇多糖得率為5.39%。

表2　紅菇多糖提取條件優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test fo r Russula vinosa polysaccharides extraction conditions optim ization

2.4多糖抗氧化性研究結果

2.4.1超氧陰離子自由基（O2-·）的清除

圖6　紅菇多糖對超氧陰離子自由基清除作用Fig.6 Scaveng ing effects of Russula vinosa polysaccharides on superoxide anion radical

由圖6可知，紅菇多糖對鄰苯三酚自氧化具有較強的抑制作用，超氧陰離子自由基清除率隨多糖質量濃度的增加而升高，但當質量濃度增大到一定值時，清除率的變化幅度會變小。紅菇多糖在此體系表現(xiàn)出很好的清除超氧陰離子自由基的作用，當其質量濃度為5 mg/m L時，對超氧陰離子自由基的清除率達82.3%。

2.4.2羥自由基（·OH）清除能力的測定

由圖7可知，紅菇多糖對羥自由基有較強的清除作用，清除率隨著多糖質量濃度的提高而增大。當紅菇多糖溶液質量濃度達到1 mg/m L時其清除率僅為5.7%，而當其質量濃度為5 mg/m L時，其清除率達49.3%，表明了紅菇多糖表現(xiàn)出一定的清除羥自由基的效果。

圖7　紅菇多糖對羥自由基清除作用Fig.7 Scavenging effects of Russu la vinosa polysaccharides on hydroxyl radical

2.4.3DPPH清除能力的測定

圖8　紅菇多糖對DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of Russula vinosa polysaccharides on DPPH radical

由圖8可知，紅菇多糖溶液具有一定的清除DPPH自由基的能力，清除率隨質量濃度的增大而增大，當紅菇多糖質量濃度為1 mg/m L時，清除率就達41.1%，而當紅菇多糖質量濃度達到5 mg/m L時，清除率就達80.4%，說明紅菇多糖能有效的清除DPPH自由基。

3　結論

紅菇多糖的提取工藝優(yōu)化試驗結果表明，影響紅菇多糖得率的各因素主次順序為微波功率＞提取時間＞pH＞料液比，最佳提取工藝條件為提取時間6 min，微波功率240 W，料液比1∶25（g∶m L），pH 9.0，在此條件下紅菇多糖得率達5.39%。

抗氧化性實驗結果表明，紅菇多糖對羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基具有良好的清除能力，最高清除率分別為49.17%、80.35%、82.17%。

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M icrowave-assisted extraction of Russula vinosa polysaccharides and its antioxidant ativity

PANG Tingcai，HU Shangying，LU Yuanyuan，LIAO Yanxing
（College of Food Eningeering，Qinzhou University，Qinzhou 535099，China）

Using Russula vinosa polysaccharides yield as evaluation index，m icrowave-assisted extraction was used to optim ize the extraction process of polysaccharides from R.vinosa by orthogonal experiments.Meanwhile，the scavenging effect of R.vinosa polysaccharides on hydroxyl radical，superoxide radical and DPPH radical were tested.The results showed that the optimal extracting conditions were as follows：extraction time 6 m in，m icrowave power 240 W，solid-liquid ratio 1∶25（g∶m l），pH 9.0.Under such conditions，polysaccharides yield was up to 5.39%.Scavenging effect of R.vinosa polysaccharides on hydroxyl radical，superoxide radical and DPPH radical was obvious，and the scavenging rate increased with the increasing polysaccharides concentration.

Russula vinosa；m icrowave；polysaccharides；antioxidant

O 658

0254-5071（2016）05-0157-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．033

2016-01-10

廣西高校科學技術研究項目（2013YB260）；欽州學院校級科研項目（2014XJKY-58C）；欽州學院校級科研項目（2013XJKY-09B）

龐庭才（1985-），男，實驗師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物研究工作。