王慧竹，陳　帥，2，朱　巖，李佳俊，鐘方麗*

（1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

纖維素酶-微波輔助法提取金櫻子總皂苷的工藝研究

王慧竹1，陳帥1，2，朱巖1，李佳俊1，鐘方麗1*

（1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016）

為了研究纖維素酶-微波輔助法提取金櫻子中總皂苷的工藝條件，以總皂苷提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，建立了金櫻子總皂苷提取率與各影響因素間的回歸模型。經(jīng)檢驗(yàn)，回歸方程擬合度好，微波時(shí)間和酶用量對(duì)金櫻子總皂苷提取率的影響顯著，而酶解溫度和微波功率對(duì)總皂苷提取率無(wú)顯著影響，最終確定酶聯(lián)微波法提取金櫻子總皂苷的最佳工藝條件為：酶用量0.10 g/g，酶解溫度44℃，微波時(shí)間23 min，微波功率470 W，在此工藝條件下金櫻子總皂苷的提取率預(yù)測(cè)值為6.15%，實(shí)際驗(yàn)證值為6.11%，實(shí)際值和預(yù)測(cè)值間相對(duì)誤差為-0.16%，充分驗(yàn)證了模型的穩(wěn)定性和可靠性。

纖維素酶-微波輔助法；金櫻子；總皂苷；響應(yīng)面法

金櫻子為薔薇科薔薇屬植物金櫻子（Rosae laevigatae）的干燥成熟果實(shí)，外觀呈倒卵形，紫褐色，外面密被刺毛，10～11月果實(shí)成熟變紅時(shí)采收，干燥，除去毛刺。金櫻子主要生于海拔100～1 600 m的向陽(yáng)的山野、田邊、溪畔灌木叢中，分布于江蘇、浙江、安徽、福建、江西、河南、湖北等地［1］。2015版藥典一部收載本品［2］“金櫻子為薔薇科植物金櫻子的干燥成熟果實(shí)，性味酸、甘、澀，平。歸腎、膀胱、大腸經(jīng)。具有固精縮尿，固崩止帶，澀腸止瀉之功能，可用于遺精滑精，遺尿尿頻，崩漏帶下，久瀉久痢”?，F(xiàn)代研究表明，金櫻子含有多糖、有機(jī)酸、黃酮類、三萜、皂苷等多種化合物［3-8］，藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)金櫻子具有廣泛的生理活性，如抗炎、抑菌、降血脂、降血壓、調(diào)節(jié)免疫［4-6］、抗腫瘤、抗氧化［4］等作用。

由于中藥化學(xué)成分多數(shù)被包裹在植物細(xì)胞壁內(nèi)，一般的有機(jī)溶劑難以破壞細(xì)胞壁，提取率較低，而纖維素酶可使細(xì)胞壁疏松、破裂，從而減小傳質(zhì)阻力，加速有效成分的釋放，進(jìn)而提高提取效率、提高原料的利用價(jià)值［9］。而對(duì)于總皂苷的提取，目前最常用的方法是加熱回流法，雖然提取率較高，但提取時(shí)間較長(zhǎng)。微波提取是利用微波能來(lái)提高提取率的一種新技術(shù)，具有省時(shí)、穿透力強(qiáng)、選擇性高、溶劑用量少等特點(diǎn)［10-12］，廣泛應(yīng)用于中藥活性成分的提取。本試驗(yàn)采用纖維素酶-微波輔助法對(duì)金櫻子總皂苷的提取工藝進(jìn)行了研究，以期為金櫻子資源的綜合開(kāi)發(fā)、利用提供一定參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金櫻子藥材：吉林市吉林大藥房；齊墩果酸對(duì)照品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；乙醇：天津市大茂化學(xué)試劑廠；香草醛：上海譜振生物科技有限公司；冰醋酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（酶活力＞30 000 U/g）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

TU-1950紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任有限公司；SHZ-D循環(huán)水真空泵：河南鞏義市英峪儀器廠；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；KQ250超聲波清洗器：昆山超聲儀器有限公司；MAS-Ⅱ微波合成萃取反應(yīng)儀：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；FA2204B電子天平：上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；RT-08多功能粉碎機(jī)：榮聰精密科技有限公司。

1.3方法

1.3.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取齊墩果酸對(duì)照品3.8 mg，置于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得0.152 mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液。

1.3.2供試品溶液的制備

取金櫻子粉末3.0 g，按1∶10（g∶mL）的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇30 mL，調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，準(zhǔn)確加入纖維素酶0.1 g/g，在50℃水浴中酶解120 min，然后調(diào)節(jié)微波功率為600 W，進(jìn)行微波提取2次，每次20 min，過(guò)濾，合并兩次濾液，減壓回收溶劑，提取液定容至50 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻即得供試品溶液。

1.3.3檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，供試品溶液各1.0 mL置于10 mL具塞試管中，80℃水浴揮干溶劑，然后分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，于60℃水浴中加熱振蕩15 min，取出后，用冰水浴冷卻至室溫，加入冰醋酸稀釋至刻度，在波長(zhǎng)400～600 nm之間，以2 nm為一個(gè)單位進(jìn)行光譜掃描［13］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照品和供試品溶液在波長(zhǎng)539 nm處均有較強(qiáng)吸收，故選擇539 nm作為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.4線性范圍考察

精密量取齊墩果酸對(duì)照品溶液1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL，分別置于10 mL具塞試管中，80℃水浴以揮干溶劑，加入5%香草醛-冰醋酸0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60℃振蕩水浴顯色15 min后冷卻10 min，各加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，以同法平行處理的溶劑為空白［13］，在波長(zhǎng)539 nm處測(cè)吸光度值，以質(zhì)量濃度C（μg/mL）和吸光度值A(chǔ)建立回歸方程為A=0.164C-0.1972，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，線性范圍15.2～53.2 μg/mL。

1.3.5總皂苷提取率的測(cè)定

按照齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算樣品中總皂苷含量，金櫻子總皂苷提取率計(jì)算公式如下：

式中：W表示總皂苷提取率，%；C表示根據(jù)吸光度值計(jì)算出的溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；D表示溶液稀釋倍數(shù)；V表示供試品溶液體積，mL；m表示藥材取樣量，g。

1.3.6單因素試驗(yàn)

（1）酶用量對(duì)總皂苷提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，料液比1∶10（g∶mL），pH值為6.0，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為120 min，微波時(shí)間15 min，微波功率500 W，考察酶用量（0.06 g/g、0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g、0.15 g/g）對(duì)總皂苷提取率的影響。

（2）酶解溫度對(duì)總皂苷提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，料液比1∶10（g∶mL），pH值為6.0，酶用量為0.10g/g，酶解時(shí)間120min，微波時(shí)間15min，微波功率500 W，考察酶解溫度（35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）對(duì)總皂苷提取率的影響。

（3）微波時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，料液比1∶10（g∶mL），pH值為6.0，酶用量為0.10 g/g，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間120 min，微波功率500 W，考察微波時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）對(duì)總皂苷提取率的影響。

（4）微波功率對(duì)總皂苷提取率的影響

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，料液比1∶10（g∶mL），酶用量為0.10 g/g，酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間為120 min，微波時(shí)間15 min，pH為6.0，考察微波功率（300 W、400 W、500 W、600 W、700 W）對(duì)總皂苷提取率的影響。

1.3.7響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取酶用量、酶解溫度、微波時(shí)間、微波功率4個(gè)因素為考察因素自變量，以金櫻子總皂苷提取率（Y）為響應(yīng)值，根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)（central compositedesign，CCD）原理，設(shè)計(jì)4因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝［14］，以-1、0、1編碼分別代表自變量低、中、高水平，因素水平編碼見(jiàn)表1。

表1　響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.8數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

單因素試驗(yàn)結(jié)果和響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果采用SAS9.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，圖表采用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪制。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1酶用量對(duì)總皂苷提取率的影響

如圖1所示，隨著酶用量的增加，總皂苷的提取率也隨之增加，但當(dāng)酶用量超過(guò)0.10 g/g后，提取率并沒(méi)有增加，可能是由于酶用量的增加，導(dǎo)致了一些非皂苷成分溶出的增加，為了進(jìn)一步考察酶用量對(duì)總皂苷提取效果的影響，分別選擇酶用量0.08 g/g、0.10 g/g、0.12 g/g進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖1　酶用量對(duì)總皂苷提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme addition on extraction rate of total saponins

2.1.2酶解溫度對(duì)總皂苷提取率的影響

如圖2所示，隨著酶解溫度的升高，提取率也相應(yīng)升高，但當(dāng)溫度達(dá)到45℃后，總皂苷提取率最大，但當(dāng)酶解溫度超過(guò)45℃后，總皂苷提取率呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，可能是由于溫度的升高導(dǎo)致酶的活力增加，從而加速總皂苷的溶出，當(dāng)溫度超過(guò)酶的最適溫度時(shí)，酶的活力下降，甚至失活，導(dǎo)致總皂苷的溶出量減少。為了進(jìn)一步考察酶解溫度對(duì)提取效果的影響，選擇酶解溫度分別為40℃、45℃、50℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2　酶解溫度對(duì)總皂苷提取率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of total saponins

2.1.3微波時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響

如圖3所示，當(dāng)微波時(shí)間為20 min時(shí)，總皂苷的提取率最大，之后隨微波時(shí)間的延長(zhǎng)總皂苷提取率逐漸下降，可能是因?yàn)槲⒉〞r(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致了非皂苷成分的溶出量增加，從而限制了總皂苷的溶出。為了進(jìn)一步考察微波提取時(shí)間對(duì)金櫻子總皂苷提取率的影響，選擇微波時(shí)間15 min、20min、25min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖3　微波時(shí)間對(duì)總皂苷提取率的影響Fig.3 Effect of microwave time on extraction rate of total saponins

2.1.4微波功率對(duì)總皂苷提取率的影響

如圖4所示，總皂苷提取率隨著微波功率的增加而增加，但當(dāng)微波功率在500～700 W時(shí)，其提取率變化不大，為了進(jìn)一步考察微波提取時(shí)間對(duì)提取效果的影響，選擇微波提取時(shí)間分別為500 W、600 W、700 W進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4　微波功率對(duì)總皂苷提取率的影響Fig.4 Effect of microwave power on extraction rate of total saponins

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以總皂苷提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

利用SAS 9.4軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到以總皂苷得率（Y）為響應(yīng)值，自變量為酶用量（A）、酶解溫度（B）、微波時(shí)間（C）、微波功率（D）的多元二次回歸方程：

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and experimental results of response surface experiments

表3　回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significant test of regression coefficient

表4　回歸方程的方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由表3可知，C項(xiàng)微波時(shí)間的系數(shù)P＜0.000 1，達(dá)到了極其顯著的水平，因此微波時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響極其顯著，A項(xiàng)酶用量的系數(shù)P＜0.05，達(dá)到顯著水平，由此判斷酶用量對(duì)總皂苷提取率影響顯著，而酶解溫度和微波功率對(duì)響應(yīng)值影響不顯著。從表3還可以看出，AB、AC、BC項(xiàng)系數(shù)的P＜0.01，均達(dá)到極其顯著水平，故此判斷酶用量與酶解溫度、酶用量與微波時(shí)間、酶解溫度與微波功率的交互作用對(duì)總皂苷得率的影響顯著。由表4可以看出，回歸方程的P＜0.0001，說(shuō)明回歸方程的總模型對(duì)總皂苷得率的影響均極其顯著，方程的決定系數(shù)為0.965 5，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有96.55%來(lái)源于所選變量，模型擬合度好，失擬項(xiàng)P＞0.05，說(shuō)明模型中無(wú)失擬因素存在［15］。綜上分析，該回歸方程可以較準(zhǔn)確地描述各自變量與響應(yīng)值之間的關(guān)系。

為了更加直觀表達(dá)兩個(gè)因素交互作用對(duì)總皂苷得率的影響，固定兩個(gè)因素的值為零水平對(duì)應(yīng)的值，僅考慮另外兩個(gè)因素的交互作用對(duì)總皂苷得率的影響，根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖和等高線圖，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以直觀看出，各因素對(duì)總皂苷提取率的影響，曲面越陡峭，表明總皂苷提取率受該因素影響較大［16］，從等高線可以看出總皂苷提取率最佳的條件應(yīng)該在圓心處。從圖5A-F可以看出對(duì)總皂苷提取率影響比較大的因素為微波時(shí)間，其次為酶用量，酶解溫度和微波功率對(duì)響應(yīng)值影響不大；酶用量與酶解溫度、酶用量與微波時(shí)間、酶解溫度與微波功率的交互作用對(duì)總皂苷得率的影響顯著，這與表3的分析結(jié)果相吻合。

用SAS軟件對(duì)模型進(jìn)行典型性分析［17］，得到金櫻子總皂苷提取的最佳工藝為酶用量0.096g/g，酶解溫度44.05℃，微波時(shí)間23.43 min，微波功率474.3 W，金櫻子總皂苷提取率預(yù)測(cè)值為6.15%，考慮實(shí)際生產(chǎn)的可控性和局限性，將最佳工藝條件修正為：酶用量0.10 g/g，酶解溫度44℃，微波時(shí)間23 min，微波功率470 W，在此修正工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)5次，結(jié)果如表5所示。

從表5可以看出，最佳工藝條件下，總皂苷平均提取率為6.11%，實(shí)際值與理論值的相對(duì)偏差為-0.16%，充分說(shuō)明了最佳工藝條件的可靠性和穩(wěn)定性。

圖5　各因素交互作用對(duì)總皂苷提取率影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on total saponins extraction rate

表5　最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 5 Verification experiment results at the optimal process

3　結(jié)論

結(jié)果表明，微波時(shí)間對(duì)金櫻子總皂苷的提取率的影響最顯著，酶用量對(duì)總皂苷提取率的影響顯著，而酶解溫度和微波功率對(duì)總皂苷提取率的影響不顯著，最終建立的回歸方程擬合良好，能夠準(zhǔn)確反映自變量與響應(yīng)值間的關(guān)系，結(jié)果顯示采用酶聯(lián)微波法提取金櫻子總皂苷的最佳提取工藝條件為：酶用量0.10g/g，酶解溫度44℃，微波時(shí)間23min，微波功率470 W，在此條件下，金櫻子中總皂苷的實(shí)際提取率為6.11%。

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Extraction technology of total saponins fromRosae laevigataeby cellulase pretreated-microwave assisted extraction

WANG Huizhu1，CHEN Shuai1，2，ZHU Yan1，LI Jiajun1，ZHONG Fangli1*
（1.School of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，China；2.School of Pharmacy，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

In order to optimize the extraction conditions of total saponins inRosae laevigataeby cellulase pretreated-microwave assisted extraction，single factor experiment was conducted with total saponin extraction rate as index，and response surface methodology was chosen to analyze the experiment results.The regression model of total saponin extraction rate with each influence factors was established.Results showed that the fitting degree of the model was good，microwave time and enzyme addition had significantly effect on extraction rate of total saponins through the regression model while the temperature of enzymatic hydrolysis had no significant effect on the extraction rate of total saponins.The optimum process conditions were as follows：enzyme addition 0.10 g/g，enzymatic hydrolysis temperature 44℃，microwave time 23 min，microwave power 470 W.Under these conditions，the predictive value for extraction rate of total saponins ofRosae laevigataewas 6.15%while the actual verification value was 6.11%.The relative error between the actual value and predictive value was-0.16%，which adequately verified the stability and reliability of the model.

cellulose pretreated-microwave assisted method；Rosae laevigatae；total saponins；response surface methodology

R931.6

0254-5071（2016）03-0084-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.03.019

2015-11-30

王慧竹（1981-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)轶w內(nèi)藥物分析。

鐘方麗（1970-），女，教授，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)及應(yīng)用。