劉 乾， 劉 松， 韓鋒鋒， 郭雪君（上海市交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院呼吸科， 上海 200092）

人肺癌原位移植瘤模型的建立及活體成像觀察

劉 乾， 劉 松， 韓鋒鋒， 郭雪君
（上海市交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院呼吸科， 上海 200092）

目的 通過建立人肺癌原位移植瘤模型，研究人肺癌高、低轉移細胞的體內生物學特性。方法 應用慢病毒轉染的方法建立同時表達綠色熒光蛋白及熒光素酶（GFP/Luc）的人肺癌低轉移細胞SPC-A-1和高轉移細胞SPC-A-1sci，在此基礎上，建立裸小鼠肺原位移植瘤動物模型，采用小動物活體成像技術和解剖學方法觀察腫瘤在肺原位的生長及轉移情況。結果 成功建立了穩(wěn)定表達GFP/Luc的人肺癌高、低轉移細胞，并成功建立了肺癌原位移植瘤動物模型。小動物活體成像系統(tǒng)檢測顯示，SPC-A-1-GFP-Luc和SPC-A-1sci-GFP-Luc細胞模型中熒光素酶表達率分別為50%（12/24）和62.5%（20/32），SPC-A-1sci-GFP-Luc組熒光素酶表達的面積及表達強度高于SPC-A-1-GFP-Luc組。解剖學檢查顯示， SPC-A-1和SPC-A-1sci組的肺原位成瘤率分別為50%（12/24）和62.5%（20/32）； 體內自發(fā)轉移率分別為25%（3/12）和40%（8/20）。結論 通過建立肺原位移植瘤動物模型能夠再現腫瘤在肺內的生長及轉移等生物學特性，小動物活體成像系統(tǒng)能夠對其生物學特性進行客觀評價。

人肺癌； 原位移植； 活體成像系統(tǒng)； 慢病毒載體

肺癌是世界上常見的惡性腫瘤之一。據世界衛(wèi)生組織和美國臨床腫瘤學會估計全世界每年新發(fā)生癌癥患者約1 000萬人，死亡癌癥患者約600～700萬人， 其中100～130萬人為肺癌患者， 由肺癌引起的死亡率在很多國家已位居常見死亡原因首位［1，2］。盡管目前對肺癌的早期診斷和臨床治療較從前有了長足進步，但不容忽視的是肺癌患者大多在中晚期才被確診，且90%以上肺癌患者死于轉移［3］。

腫瘤動物模型在腫瘤研究中具有非常重要作用，通過建立腫瘤動物模型能夠更好地在整體水平上研究腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉移的分子機制。本實驗旨在利用人肺癌高、低轉移細胞建立裸小鼠肺原位移植瘤動物模型，通過小動物活體成像技術觀察肺原位移植瘤的生長及轉移，為肺癌轉移機制、肺癌診斷、治療及抗腫瘤藥物開發(fā)等提供有用的工具。

1 材料與方法

1.1 人肺癌細胞株

人肺癌細胞株SPC-A-1及其高轉移細胞亞系SPC-A-1sci為人低分化腺癌，SPC-A-1-GFP/Luc及SPC-A-1sci-GFP/Luc細胞為表達綠色熒光蛋白和熒光素酶（GFP/Luc）的雙標記細胞， 以上細胞均由上海市腫瘤研究所提供。細胞用含體積分數10%胎牛血清的DMEM（Dulbecco modified Eagle medium）高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)， 內含100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素。當細胞融合率為80%～90%時， 用含體積分數0.25%胰蛋白酶消化并傳代，置于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 實驗動物

SPF級雄性BALB/c裸小鼠56只，6～8周齡，體質量18～22 g，由上海市腫瘤研究所提供［SCXK（滬）2012-0001］，所用墊料、飲水、全價顆粒飼料及其它與動物接觸的物品均經高壓滅菌處理。實驗操作及動物飼養(yǎng)嚴格按照SPF級規(guī)范要求進行［SYXK（滬）2012-0001］。

1.3 試劑儀器

胎牛血清購自Biowest公司（法國）； DEME高糖培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Gibco公司（美國）； Matrigel購自BD公司（美國）； 熒光底物購自GOLD Bio Technology公司（美國）； 培養(yǎng)皿及培養(yǎng)板等購自Corning公司（美國）； 戊巴比妥鈉購自上海西唐生物科技有限公司； 青霉素和鏈霉素等其他化學試劑均為進口分裝試劑。

小動物活體熒光成像系統(tǒng)購自Berthold Technologies GmbH&Co.KG（德國），儀器型號為LB983 NC320，分析軟件為WinLight32，320萬像素的冷CCD，濾光片的光譜范圍為300～1 100 nm。CO2培養(yǎng)箱購自Thermo公司（美國）， 儀器型號： cell 150。熒光顯微鏡購自Olympus公司（日本）。

1.4 肺癌原位移植瘤模型的建立及活體成像觀察

收集生長旺盛的連續(xù)傳代SPC-A-1 GFP/Luc及SPC-A-1sci GFP/Luc細胞，調整細胞濃度為4×107個/mL，取25 μL細胞懸液與25 μL Matrigel 1∶1混勻，置于冰上備用。裸小鼠以戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，酒精棉球消毒皮膚，在左胸壁行1 cm的切口，分離胸壁肌肉，暴露肋肌及肋間肌， 在第3、第4肋間斜行進針，刺入左肺約3 mm左右，緩慢推入備用細胞，皮膚切口以4/0縫線緊密縫合， 定時觀察動物的進食、活動等一般狀況。

為了進一步觀察人肺癌高、低轉移細胞SPCA-1sci和SPC-A-1的體內生長與轉移能力，待動物出現惡病質狀態(tài)時進行小動物活體成像觀察。預先將配置的20 mg/mL D-Luciferin工作液從-70 ℃中移至4 ℃冰箱中解凍。每只動物取0.15 mL進行腹腔注射， 然后進行戊巴比妥鈉腹腔注射。待小鼠麻醉后，將其放入成像系統(tǒng)暗室中，先拍攝明場圖像，隨后切換至生物發(fā)光成像模式，收集5 min熒光素酶表達光子信號，然后再將光子圖像與明場圖像疊加，觀察生物發(fā)光信號位置及表達強度。

影像學檢測完成后，行頸椎脫臼法處死動物進行解剖，肉眼觀察肺部成瘤及轉移情況，取全部肺組織及轉移灶組織放入含體積分數10%甲醛的離心管中進行固定。

2 結果

2.1 穩(wěn)定轉染GFP/Luc的肺癌細胞形態(tài)學觀察

SPC-A-1sci細胞為經過動物體內循環(huán)篩選獲得的具有高轉移潛能的細胞亞系，在體外培養(yǎng)過程中，可見兩種不同轉移潛能細胞間的細胞形態(tài)學具有明顯差異。GFP/Luc雙標SPC-A-1細胞為典型的多角形上皮樣細胞，簇狀貼壁生長，細胞間緊密相靠、互相銜接，呈鵝卵石樣外觀，熒光顯微鏡觀察可見細胞表達的熒光信號較強，熒光較為均勻地分布于整個細胞內，GFP表達率接近100%。GFP/Luc雙標的SPC-A-1sci細胞呈紡錘體樣外形，細胞間相互離散， 失去上皮細胞的極性特性，并且有明顯偽足形成，GFP轉染率為70%左右，經過流式細胞儀分選后，GFP表達率接近100%（圖1）。

2.2 應用小動物活體成像技術檢測肺原位腫瘤生長及轉移情況

裸小鼠肺原位分別接種上述兩種細胞各1×106/只， 1～2周時動物進食、進水、呼吸、運動情況良好； 4周時，兩組小鼠開始陸續(xù)出現呼吸急促、活動減弱、弓背等狀態(tài)，5周后部分動物開始出現消瘦、弓背明顯、胸腹聯合呼吸、萎靡、食欲減退等惡病質狀態(tài)。第6周開始，對于出現惡病質狀態(tài)的動物，每周分批運用小動物活體成像技術檢測腫瘤原位生長及轉移情況，至第9周實驗全部結束。結果顯示： 小動物活體成像系統(tǒng)檢測觀察到SPC-A-1-GFP/Luc細胞模型中有12只裸小鼠肺部呈現熒光素酶表達，表達率為50%（12/24）（圖2）；SPC-A-1sci-GFP/Luc細胞模型中有20只裸小鼠肺部呈現熒光素酶表達，表達率為62.5%（20/32），其余動物未檢測到任何熒光素酶信號（圖3）。兩組中，盡管各組動物間熒光素酶表達的面積和強度略有不同，但SPC-A-1sci-GFP/Luc組熒光素酶表達的面積及表達強度總體高于SPC-A-1-GFP/Luc組。

2.3 解剖學觀察肺原位移植瘤腫瘤生長及轉移情況

對于處于惡病質狀態(tài)的動物， 在經過小動物活體成像技術檢測后， 繼續(xù)行頸椎脫臼法處死小鼠并進行解剖學檢查， 觀察雙肺成瘤情況及體內臟器轉移情況。結果顯示： 人肺癌細胞SPC-A-1和SPC-A-1sci在左肺表面皆可呈現魚肉狀的透明結節(jié)， 凸出于肺表面或侵入肺深部生長， 有的可累及整個左肺， 腫瘤大小不一， 成瘤率分別為50%（12/24）和62.5%（20/32）；在成瘤動物中，它們各自的體內自發(fā)轉移率分別為25%（3/12）和40%（8/20），轉移主要位于胸腔的右肺、胸壁、膈等部位，可見大小不一的魚肉狀透明結節(jié)凸出生長于轉移位置，而肝、腎、腎上腺、骨骼等未見腫瘤浸潤（表1、圖4、圖5）。

圖1 穩(wěn)定表達GFP/Luc的SPC-A-1和SPC-A-1sci細胞 （100×）Figure 1 Morphological analysis of stable GFP/Luc expressing SPC-A-1 and SPC-A-1sci cells in vitro （100×）

圖2 小動物活體成像技術檢測SPC-A-1-GFP/Luc細胞肺原位移植瘤的生長及轉移能力Figure 2 Monitoring of the proliferation and spontaneous metastasis of SPC-A-1-GFP/Luc cells in lung orthotopic animal models by in vivo biofluorescent imaging

圖3 小動物活體成像技術檢測SPC-A-1sci-GFP/Luc細胞肺原位移植瘤模型的生長及轉移能力Figure 3 Monitoring of the proliferation and spontaneous metastasis of SPC-A-1sci-GFP/Luc cells in lung orthotopic animal models by in vivo biofluorescent imaging

表1 解剖學觀察肺原位移植瘤的腫瘤生長及轉移情況Table1 Observation of in vivo tumor growth and metastasis of SPC-A-1 and SPC-A-1sci cells via lung orthotopic transplantation

圖4 解剖學檢測SPC-A-1細胞體內生長情況Figure 4 Observation of in vivo tumor growth of SPC-A-1 cells via lung orthotopic transplantation

圖5 解剖學檢測SPC-A-1sci細胞體內生長情況Figure 5 Observation of in vivo tumor growth of SPC-A-1sci cells via lung orthotopic transplantation

3 討論

原位移植瘤動物模型為研究腫瘤提供了一個良好的平臺，理想的原位移植瘤模型尤其是伴有轉移發(fā)生的模型不僅可以再現腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，而且可以促進腫瘤轉移機理及抗腫瘤轉移治療研究。腫瘤轉移動物模型主要分為自發(fā)性轉移動物模型和實驗性轉移動物模型。目前已有的肺癌轉移模型大部分都屬于實驗性轉移動物模型，即通過尾靜脈、脾臟或左心室注射等方法使腫瘤細胞直接進入血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)，但實驗性轉移由于缺少了腫瘤細胞脫離原發(fā)灶、突破基底膜等步驟，只能模擬轉移發(fā)生的部分過程［4，5］。自發(fā)性肺癌轉移模型能反映肺腫瘤細胞脫離原發(fā)灶、侵入細胞外基質及血管等全部轉移過程，通常分為皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型［6，7］。薛強等［8］采用懸液注射法、包塊埋植并閉式引流法以及單純腫瘤埋植法等三種方法建立了兔VX2肺原位移植瘤動物模型，但后兩種方法需要打開胸腔，由于肺臟位于胸腔內負壓環(huán)境中，可能存在開胸后肺部塌陷造成動物因呼吸衰竭而死亡，或者出現開放性創(chuàng)面感染甚至發(fā)展為膿胸等并發(fā)癥。因此肺原位移植瘤模型的建立有別于其他臟器的原位移植，它具有操作難度較大，操作要求較高，應用受到一定限制等問題。本試驗者通過反復練習并熟練掌握肺原位移植技術后，采用培養(yǎng)細胞注射法建立了人肺原位移植瘤動物模型，結果顯示SPC-A-1和SPC-A-1sci組的肺原位成瘤率分別為50.0%（12/24）和62.5%（20/32）； 體內自發(fā)轉移率分別為25.0%（3/12）和40.0%（8/20）。雖然本次試驗原位移植成功率仍然不高，發(fā)生轉移的動物數量十分有限，尚未達到建立模型的標準，但該實驗為今后建立肺癌原位動物模型提供了可行性參考依據，同時也獲得了技術支持和寶貴經驗。

動物模型建立后，為了動態(tài)觀察腫瘤轉移的過程，傳統(tǒng)方法需要在不同的時間點處死實驗動物，這樣一方面需要耗費大量動物，另一方面不能在同一動物體內進行連續(xù)觀察，根據測量不同動物在不同時間節(jié)點所得到的數據，會出現由于動物個體差異引起的實驗偏差。隨著小動物影像學技術的不斷發(fā)展，越來越多的研究人員開始使用影像學方法檢測腫瘤的變化情況。魏淑珍等［9］采用開胸的方法建立了EGFP標記的人大細胞肺癌NCI-H460裸小鼠原位移植瘤動物模型，結果顯示： 移植1周后通過熒光體視顯微鏡可觀察到肺部綠色熒光蛋白的表達。但是，EGFP的發(fā)射波長為520 nm，易被周圍組織散射，熒光不能穿透皮膚和胸壁，影像學成像時必須打開皮瓣才能觀察到較淺部位的熒光表達， 觀察處于深部的腫瘤仍存在一定問題。王曉敏等［10］對人肺癌及肝癌細胞進行了GFP和熒光素酶聯合標記，充分利用熒光素酶作為化學發(fā)光所具有的背景噪音低、穿透力強等特點，成功觀察到了細胞在肺及肝等體內深部的生長情況。本試驗采用相同的方法，應用GFP/Luc雙標技術結合小動物活體成像系統(tǒng)檢測肺原位腫瘤的生長及轉移情況。實驗中，小動物活體成像檢測的肺原位腫瘤的成瘤數量和生長部位都與解剖學觀察的結果相一致，說明小動物活體成像系統(tǒng)能夠客觀評價腫瘤在動物體內的生長及轉移情況。根據腫瘤生長的大小、部位以及轉移發(fā)生的程度和部位，進行精確定量和大體定位，既彌補了傳統(tǒng)建模方法中的不足，又具有一定的檢測精確度和靈敏度，為今后的建模工作開創(chuàng)了新思路，為后續(xù)的基礎研究工作奠定了牢固基礎。但小動物活體成像系統(tǒng)只能對腫瘤進行大體定位，不能精確區(qū)分同一部位不同深度的腫瘤，而且位置較深的腫瘤可能受解剖部位的影響而使熒光素酶表達的信號強度減弱，從而不能準確顯示腫瘤的大小，甚至某些腫瘤未能被檢測到。

總體而言，本次實驗成功建立了肺原位移植瘤動物模型，觀察了人肺癌高、低轉移細胞的體內生物學特性，并證實小動物活體成像系統(tǒng)能夠客觀評價體內深部腫瘤的生長與轉移情況，為進一步研究肺癌轉移機制奠定了基礎。

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Establishment of Orthotopic Transplant Model of Human Lung Cancer and Observation of In vivo Biofluorescent Imaging in Nude Mice

LIU Qian， LIU Song， Han Feng-feng， GUO Xue-jun
（Department of Respiration Medicine， Xinhua Hospital， Shanghai Jiaotong University School of Medicine， Shanghai 200092， China）

Objective To establish orthotopic transplant models of human lung cancer and study the in vivo biological characteristics of human lung cancer with high and low metastatic potential cells in nude mice.Methods The low-metastatic human lung cancer cell line SPC-A-1 and high-metastatic human lung cancer cell line SPC-A-1sci were tranfected with green fluorescent protein/Luciferase （GFP/ Luc） gene by lentiviral vector， they were orthotopically transplanted into the lung of nude mice.The tumor growth and metastasis were observed by using in vivo biofluorescent imaging system and anatomical methods.Results The human lung cancer cell lines with stable high-level GFP/Luc expression and orthotopic transplant animal models were successfully established.In vivo biofluorescent images showed that the luciferase expression rates of SPC-A-1-GFP-Luc and SPC-A-1sci-GFP-Luc cells were 50.0% （12/24） and 62.5% （20/32）， respectively.The expression intensity and area of luciferase expression in SPC-A-1sci-GFP-Luc cells were higher than that in SPC-A-1-GFP-Luc cells.Anatomical examination showed that tumor formation rates of SPC-A-1 cells and SPC-A-1sci cells were 50.0% （12/24）and 62.5% （20/32）， respectively.Meanwhile， the spontaneous metastasis rate was 25.0% （3/12）and 40.0% （8/20） in vivo.Conclusions Lung orthotopic transplant animal model could reproduce the biological characteristics of tumor growth and metastasis.In vivo biofluorescent imaging system was suitable for the objective evaluation of the biological characteristics.

Human lung cancer； Orthotopic transplantation； In vivo imaging system； Lentiviral vector

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0250-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.002

2016-04-18

國家自然科學基金項目（81400026）

劉 乾（1980-）， 女， 主治醫(yī)師。

E-mail： liuqian_1980@hotmail.com

郭雪君（1964-）， 男， 醫(yī)學博士， 主任醫(yī)師， 研究方向：

呼吸系統(tǒng)疾病。E-mail： snowgen@126.com