□ 蔡佳佳　張　巖　邢春玉　郭　美　李雪瑩　白芯語　天津天獅學(xué)院生物與食品工程學(xué)院

猴頭菌麥角甾醇高產(chǎn)菌株選育及深層培養(yǎng)條件的優(yōu)化

□ 蔡佳佳張巖邢春玉郭美李雪瑩白芯語天津天獅學(xué)院生物與食品工程學(xué)院

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定猴頭菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)碳源、氮源、無機(jī)鹽；在此基礎(chǔ)上，采用三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)方法，確定液態(tài)深層發(fā)酵的培養(yǎng)條件；采用自然選育和紫外誘變法，篩選出麥角甾醇產(chǎn)量較高的猴頭菌株。結(jié)論表明：葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.075%、蛋白胨1%、起始pH值5.0、裝液量80 mL、接種量6 mL，溫度23℃、搖床轉(zhuǎn)速150 r/min條件下，猴頭菌生長情況良好；紫外線照射40 s的菌株在平板培養(yǎng)基上生長最好，搖瓶發(fā)酵后發(fā)酵液、菌絲球、菌絲粉中麥角甾醇含量分別為：0.062 25 mg/10 mL、9.686 2 mg/g、18.440 3 mg/g，明顯高于對(duì)照組。

猴頭菌；麥角甾醇；高產(chǎn)菌株；紫外誘變

猴頭菌又稱猴菜、猴頭菇、對(duì)臉蘑[1]，屬于擔(dān)子菌亞門猴菇科猴菇屬的大型食用菌、藥用菌[2]，能夠促進(jìn)血液循環(huán)，抑制腫瘤細(xì)胞生長，對(duì)胃粘膜有很好的保護(hù)作用[3]，其中甾醇類物質(zhì)具有降血脂、預(yù)防心血管疾病、延緩衰老等作用，也是多種激素、維生素D合成的前體[4]，在物質(zhì)運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾饔肹5]。近年來，我國消費(fèi)者對(duì)麥角甾醇的需求量呈逐年增長趨勢，麥角甾醇高產(chǎn)菌株的選育就顯得尤為重要。

目前，研究還是以猴頭菌子實(shí)體居多，但子實(shí)體的生產(chǎn)性能不穩(wěn)定，不能保證對(duì)原料質(zhì)量穩(wěn)定的要求，而液態(tài)深層發(fā)酵生產(chǎn)周期短、菌齡一致、菌絲生長速度快、接種簡單、不受季節(jié)的限制可以周年生產(chǎn)，保證了猴頭菌在生產(chǎn)過程中的可控性及目標(biāo)產(chǎn)物的品質(zhì)穩(wěn)定性。通過對(duì)猴頭菌液態(tài)培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的優(yōu)化，篩選出猴頭菌最適深層培養(yǎng)條件[6-9]，為猴頭菌菌絲體高收率的生產(chǎn)提供一條便捷高效的生產(chǎn)途徑，進(jìn)而滿足人們?nèi)找嬖鲩L的需求。

1　材料與方法

1.1菌種

猴頭菌種為天獅學(xué)院生物與食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2主要儀器及試劑

恒溫培養(yǎng)振蕩器（HNY-2102C型，天津市歐諾儀器儀表有限公司）；數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（XMTD-204型，天津市歐諾儀器儀表有限公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（MJ-78A型，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司）；低速離心機(jī)（TD5K-III型，長沙東旺實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；精密電子天平（BSA124S型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；生化培養(yǎng)箱（MI-80A型，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵（SHB-III型，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；單光束紫外可見分光光度計(jì)（UV 1000型，上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品100 mg（純度≥98% 上海圻明生物科技有限公司）；馬鈴薯（市售）；葡萄糖、蔗糖（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；可溶性淀粉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；麥芽浸粉（分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、胰蛋白胨（生物試劑，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；瓊脂粉（分析純，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸錳（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；硫酸鐵銨（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；冰乙酸（分析純，天津市盛淼精細(xì)化工有限公司）；石油醚（分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）；95%乙醇（分析純 天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠）。

1.3培養(yǎng)基

1.3.1斜面、平板培養(yǎng)基

馬鈴薯30%（煮汁），蛋白胨0.5%，葡萄糖2%，瓊脂1.3%，pH自然。

1.3.2初篩液體培養(yǎng)基

用2%木屑提取汁溶解：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，pH自然。

1.3.3液體發(fā)酵培養(yǎng)基

單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，pH自然。

分別選擇碳源：葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麥芽浸粉、葡萄糖+可溶性淀粉。氮源：蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏。無機(jī)鹽：磷酸二氫鉀、硫酸鎂、硫酸錳。將上述不同碳源、氮源和無機(jī)鹽分別替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀和硫酸鎂，分別組成不同的碳源、氮源、無機(jī)鹽液體發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.4菌種活化、復(fù)壯及初篩

轉(zhuǎn)接保藏的猴頭菌菌種，分別接種于新鮮斜面培養(yǎng)基活化，23℃培養(yǎng)5～7 d。

將活化菌種接種于初篩液體培養(yǎng)基中，23℃、150 rpm下培養(yǎng)6~8 d。取適量猴頭菌培養(yǎng)液，經(jīng)無菌漏斗過濾制備單孢子液。將單孢子液進(jìn)行梯度稀釋。選取連續(xù)3個(gè)稀釋度，將稀釋孢子液0.1 mL分別涂布于平板培養(yǎng)基中，于23℃下培養(yǎng)分離單菌落。經(jīng)分離純化選取菌絲體生長速度快的猴頭菌株，截取邊緣的幼齡菌絲，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基，于23℃下培養(yǎng)5 d。

1.5菌株紫外誘變

將初篩菌株，以單因素實(shí)驗(yàn)中的最合適條件搖瓶培養(yǎng)5~7 d后，取20 mL的猴頭菌發(fā)酵液，制備單孢子液。經(jīng)梯度稀釋后，選取連續(xù)3個(gè)稀釋度的單孢子液分別倒入直徑為90 mm的無菌培養(yǎng)皿，進(jìn)行紫外線照射。以不經(jīng)紫外線照射的單孢子液作對(duì)照，分別于平板培養(yǎng)基中分離單菌落，每組重復(fù)2次。注意避光，黑紙包扎完好，于23℃培養(yǎng)5~7 d。

將紫外誘變后分離的單菌落的邊緣幼齡菌絲，接種至斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，接種至單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行液體發(fā)酵6~8 d，測定麥角甾醇含量。

1.6菌株液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化

由單因素實(shí)驗(yàn)確定最適的碳源、氮源、無機(jī)鹽，進(jìn)而對(duì)碳源用量、氮源用量及無機(jī)鹽用量進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，以菌絲體收率為指標(biāo)確定猴頭菌液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基成分的含量。

1.7菌絲體收率的測定

發(fā)酵液經(jīng)真空抽濾，得猴頭菌菌絲體，80℃干燥8～10 h，稱重。

1.8麥角甾醇的測定

麥角甾醇含量的測定：鐵礬顯色法[10]。565 nm波長下測定吸光度，以麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別測定發(fā)酵液、菌絲體、菌絲粉中麥角甾醇的含量，篩選出麥角甾醇產(chǎn)量較高的菌株。

2　結(jié)果與討論

2.1碳源對(duì)猴頭菌菌絲體生成量的影響

由圖1、表1可知，碳源對(duì)猴頭菌菌絲體的生長影響特別顯著。其中葡萄糖的菌絲體收率為0.445 1 g/100 mL，可以作為液體培養(yǎng)的碳源。

2.2氮源對(duì)猴頭菌菌絲體生成量的影響

由圖2、表2可知，氮源對(duì)猴頭菌菌絲體的生長影響特別顯著。其中酵母膏對(duì)菌絲生長的促進(jìn)作用較大，菌絲體干重為0.399 0 g/100 mL，其次為蛋白胨，所生成的猴頭菌菌絲體的干重為0.214 6 g/100 mL，所以選擇酵母膏和蛋白胨，作為液體培養(yǎng)的氮源。

2.3無機(jī)鹽對(duì)猴頭菌菌絲體生成量的影響

由圖3、表3可知，無機(jī)鹽對(duì)猴頭菌菌絲體的生長影響特別顯著。液態(tài)深層發(fā)酵時(shí)，在以磷酸二氫鉀為無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中，有明顯的促進(jìn)作用，菌絲生長速度快、菌絲球小、數(shù)量多、發(fā)酵液顏色澄清；以硫酸鎂、硫酸錳為無機(jī)鹽的培養(yǎng)基，菌絲生長不佳，發(fā)酵液的顏色均有混濁且偏深色。故選擇磷酸二氫鉀作為液體培養(yǎng)的無機(jī)鹽。

圖1　不同碳源對(duì)菌絲體生成量的影響

表1　碳源的單因素實(shí)驗(yàn)方差分析表

圖2　不同氮源對(duì)菌絲體生成量的影響

表2　氮源的單因素實(shí)驗(yàn)方差分析表

圖3　不同種類無機(jī)鹽對(duì)菌絲體生成量的影響

表3　無機(jī)鹽的單因素實(shí)驗(yàn)方差分析表

2.4正交試驗(yàn)極差分析

2.4.1培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)極差

分析

由表4極差分析得出，葡萄糖用

量是影響菌絲體收率的最大因素，且RA>RB>RC，故各因素的主次順序?yàn)锳葡萄糖濃度，B酵母膏濃度，C無機(jī)鹽濃度。A列因素：K2>K3>K1；B列因素：K2>K3>K1；C列因素：K3>K2>K1。最優(yōu)方案為A2B2C3，即葡萄糖濃度為2%，酵母膏濃度為0.5%，磷酸二氫鉀濃度為0.15%。此結(jié)論與表4中菌絲體干重最高組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，即試驗(yàn)號(hào)為“4”的方案為A2B2C3，其菌絲體干重為0.670 3 g/100 mL（正交實(shí)驗(yàn)中最高）。因此確定A2B2C3為最優(yōu)方案。

2.4.2培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)極差分析

由表5培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)極差分析可知，對(duì)猴頭菌深層發(fā)酵菌絲體收率影響最大的培養(yǎng)條件是裝液量，且RB>RA>RC，故各因素的主次順序?yàn)锽裝液量，A起始PH，C接種量。其中，A列因素：K1>K3>K2；B列因素：K1>K3>K2；C列因素：K1>K3>K2。最優(yōu)方案為A1B1C1，即PH為5.0，裝液量為80 mL，接種量為6 mL，在這個(gè)條件下經(jīng)液體搖瓶培養(yǎng)的菌絲體干重最大，測定結(jié)果為0.688 9 g/100 mL。此結(jié)論與表5中試驗(yàn)號(hào)為“1”的培養(yǎng)條件下的菌絲體干重測定值相對(duì)應(yīng)，即方案A1B1C1的菌絲體干重結(jié)果最高（為0.688 9 g/100 mL），符合正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果。

2.5正交試驗(yàn)方差分析

2.5.1培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)方差分析

在方差分析中，因各實(shí)驗(yàn)條件下無重復(fù)，故以最小平方和列作為誤差列，在a=0.05的情況下，進(jìn)行F檢驗(yàn)。本正交實(shí)驗(yàn)的方差分析中，以無機(jī)鹽濃度偏差平方和作為誤差，方差分析結(jié)果列于表6。

由表6可知，葡萄糖以及酵母膏對(duì)于猴頭菌菌絲體生成的影響是顯著的，其中葡萄糖的影響是特別顯著的，而無機(jī)鹽對(duì)其影響則不顯著。結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果，表明猴頭菌菌絲體生成主要取決于液態(tài)培養(yǎng)基中的碳源和氮源。

2.5.2培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)方差分析

在方差分析中，因各實(shí)驗(yàn)條件下無重復(fù)，故以最小平方和列作為誤差列，在a=0.05的情況下，進(jìn)行F檢驗(yàn)。本正交實(shí)驗(yàn)的方差分析中，以接種量偏差平方和作為誤差，方差分析結(jié)果列于表7。

由表7可知，初始PH、裝液量及接種量對(duì)于猴頭菌菌絲體生成的影響均為顯著，其中裝液量的影響是特別顯著的。結(jié)合正交實(shí)驗(yàn)極差分析結(jié)果，表明猴頭菌菌絲體生成與培養(yǎng)條件的關(guān)系較為密切，包括初始PH、裝液量及接種量。

表4　培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)極差分析

表6　培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)方差分析

表7　培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)方差分析

2.6正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

2.6.1培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將正交得出的最優(yōu)方案組合A2B2C3進(jìn)行驗(yàn)證，得出結(jié)果見表8。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，A2B2C3試驗(yàn)中猴頭菌菌絲體干重的平均值為0.616 1 g/100 mL，故確定培養(yǎng)基成分的最優(yōu)方案為A2B2C3。

2.6.2培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將正交得出的最優(yōu)方案組合A1B1C1進(jìn)行驗(yàn)證，得出結(jié)果見表9。

經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，A1B1C1試驗(yàn)中猴頭菌菌絲體干重的平均值為0.662 4 g/100 mL，故確定培養(yǎng)條件的優(yōu)方案為A1B1C1。

2.7紫外誘變菌體生長情況

每天定時(shí)觀察平板培養(yǎng)基上的菌絲，記錄其生長顏色、長勢、邊緣整齊度等情況，并對(duì)比，用“*”號(hào)表示菌絲生長普通、較一般，“**”號(hào)表示菌絲長勢良好，“***”號(hào)表示菌絲生長最密、生長最好。記錄情況見表10。

照射40、50、60 s的實(shí)驗(yàn)組，與對(duì)照組相比均有明顯差異，均好于對(duì)照組，且照射40 s的實(shí)驗(yàn)組情況最理想：色澤度好、菌體生長整齊、單菌落面積最大。

2.8麥角甾醇含量測定

麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖4所示。

由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=1.202 1x-0.004 5，測定猴頭菌不同樣品中麥角甾醇的含量。樣品為經(jīng)液體搖瓶培養(yǎng)后所得猴頭菌菌絲粉（水分為8.8%）、濕重菌絲球和猴頭菌發(fā)酵液，結(jié)果見表11。

由表11可知，將各樣品稀釋液的吸光度A代入麥角甾醇質(zhì)量曲線方程，再根據(jù)含量計(jì)算公式，得出菌絲粉中麥角甾醇含量為27.67 mg/g，濕重菌絲球中麥角甾醇含量為24.22 mg/g，發(fā)酵液中麥角甾醇含量為0.62 mg/100 mL。

表8　培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表9　培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表10　菌體的生長狀況

圖4　麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表11　不同樣品中麥角甾醇的含量

3　結(jié)論

對(duì)于猴頭菌液態(tài)深層發(fā)酵優(yōu)化培養(yǎng)條件和篩選麥角甾醇高產(chǎn)菌株，通過各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出以下結(jié)論。

（1）綜合單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出最適猴頭菌液態(tài)深層培養(yǎng)條件為：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，磷酸二氫鉀0.15%，硫酸鎂0.075%，蛋白胨1%，在PH5.0、裝液量80 mL、接種量6 mL情況下，如果菌種活性良好，于23℃，150 r/min搖床培養(yǎng)，猴頭菌菌絲體收率可達(dá)0.622 5 g/100 mL。

（2）誘變實(shí)驗(yàn)：比較經(jīng)過不同時(shí)間的紫外照射后菌落的色澤、面積大小等總體生長狀況，發(fā)現(xiàn)照射40 s＞60 s＞50 s＞對(duì)照組；且實(shí)驗(yàn)組紫外線照射后，發(fā)酵液、菌絲球、菌絲粉中麥角甾醇含量都比對(duì)照組高。可見在初篩的基礎(chǔ)上，結(jié)合紫外誘變獲得的菌株，其在固體培養(yǎng)基上的生長時(shí)間縮短，且菌絲體中麥角甾醇含量有所提高。相信經(jīng)過連續(xù)適當(dāng)?shù)恼T變處理，獲得猴頭菌的麥角甾醇高產(chǎn)的誘變菌株，可以作為生產(chǎn)菌種，能縮短工業(yè)化生產(chǎn)菌絲體的周期，提高生物產(chǎn)量。

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天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（編號(hào)：201510859004）。