李小雨，梅廣云，李 揚(yáng)，黃詩(shī)揚(yáng)，任建武，肖楚妍

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083； 2.北京市林業(yè)種子苗木管理總站，北京 100029)

錦葉欒黃酮含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)動(dòng)態(tài)分析

李小雨1，梅廣云1，李 揚(yáng)2，黃詩(shī)揚(yáng)1，任建武1，肖楚妍1

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083； 2.北京市林業(yè)種子苗木管理總站，北京 100029)

以錦葉欒新鮮葉片為試材，采用L9(34)正交試驗(yàn)確定錦葉欒葉片內(nèi)總黃酮的最佳提取方案，即以60%丙酮為提取劑，新鮮葉片與丙酮料液比1∶20，60 ℃下回流提取2 h。后通過(guò)分光光度法探究錦葉欒葉片內(nèi)總黃酮含量的季節(jié)性變化規(guī)律，結(jié)果表明：在其旺盛生長(zhǎng)階段，葉片中均具有較高的黃酮含量，總黃酮含量在5月底達(dá)到峰值(36.72 mg·g-1)，6月底之后含量逐漸降低到平均值(22.06 mg·g-1)以下。利用Handy PEA測(cè)定錦葉欒葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)以分析其黃酮含量在7月之后下降的主要原因，發(fā)現(xiàn)錦葉欒不完全適應(yīng)北京地區(qū)的夏季高溫，由此引起光合作用效率下降，次生代謝產(chǎn)物黃酮積累減少。

錦葉欒；黃酮；葉綠素?zé)晒鈪?shù)

黃酮類(lèi)化合物廣泛存在于植物體內(nèi)[1-2]，作為次生代謝產(chǎn)物在植物花、果以及葉片中呈現(xiàn)黃色、紅色等色彩，同時(shí)這類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化活性，可以清除氧自由基[3]。陸瑞利等[4]在一次大規(guī)模的植物提取物清除自由基活性物質(zhì)篩選中，發(fā)現(xiàn)黃山欒鮮葉的甲醇提取物具有很強(qiáng)的清除DPPH有機(jī)自由基的活性。對(duì)北京欒樹(shù)葉的乙酸乙酯提取物進(jìn)行生物活性測(cè)定，證明其有抗癌、免疫抑制、抗病毒、自由基清除和活血化淤等作用。楊小鳳等[5]從欒樹(shù)葉、種子中分離鑒定出16種欒樹(shù)黃酮類(lèi)化合物[6-7]。欒樹(shù)中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要為黃酮類(lèi)、木脂素類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氰脂類(lèi)和甾醇類(lèi)[6，8-9]。其中，黃酮類(lèi)物質(zhì)具有眾多優(yōu)良的生物學(xué)活性和極其重要的藥用價(jià)值。作為次生代謝產(chǎn)物，黃酮類(lèi)化合物的積累與光合作用關(guān)系密切[10-12]。但是有關(guān)黃酮積累與光合作用的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

錦葉欒(Koelreuteriapaniculata′Jinye′)也是欒樹(shù)屬植物，是由普通欒樹(shù)產(chǎn)生芽變后選育而來(lái)的，于2007年被國(guó)家林業(yè)局認(rèn)定為新品種，其葉片為鮮艷的金黃色。本試驗(yàn)探究欒樹(shù)新品種錦葉欒葉片內(nèi)總黃酮含量的季節(jié)性變化規(guī)律及顯著優(yōu)勢(shì)，使其觀賞價(jià)值與藥用價(jià)值相得益彰，為錦葉欒葉片黃酮成分的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

材料：錦葉欒(5年生)新鮮葉片(采自北京市順義區(qū)苗圃)。試劑：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)；無(wú)水乙醇，丙酮，甲醇，石油醚，亞硝酸鈉，硝酸鋁，氫氧化鈉等試劑均為分析純。儀器：可見(jiàn)-紫外分光光度計(jì)(上海元析)，分析天平，Handy PEA植物效率分析儀(Hansatech，UK)，PANTONE ColorCue-2/色差計(jì)。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精確稱取0.00612 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用70%乙醇溶解，于50 mL容量瓶中定容。分別移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液于5 mL容量瓶中，編號(hào)1～6。分別加入5% NaNO2溶液0.15 mL，振蕩搖勻，靜置6 min后加入10% Al(NO3)3溶液0.15 mL，振蕩搖勻，靜置6 min后加入1 mol·L-1NaOH溶液2.0 mL，振蕩搖勻，靜置6 min后用70%乙醇定容至5 mL，振蕩搖勻，靜置10 min。以1號(hào)作為參比，分別于λ500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510 nm處測(cè)定其他組的吸光度，確定最大吸收波長(zhǎng)并繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 錦葉欒葉片中黃酮最佳提取方案的確定 采用正交試驗(yàn)[7，13-15]，正交表L9(34)水平、因素見(jiàn)表1。稱取9份錦葉欒新鮮葉片(采于2013年4月10日)，每份約2 g。轉(zhuǎn)入研缽中，加石油醚充分研磨后轉(zhuǎn)入小燒杯中，靜置20 min，倒去石油醚，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)添料回流。完畢后，待回流液充分冷卻，取上層清液，按1.2.1中所述方法測(cè)量吸光度。分析試驗(yàn)結(jié)果，確定錦葉欒葉片中總黃酮的最佳提取方案。

1.2.3 逐月測(cè)定錦葉欒葉片中總黃酮的含量 按1.2.2確定的最佳方案，2013年4—10月每月30日進(jìn)行取樣，逐月測(cè)定錦葉欒葉片中總黃酮的含量。稱取錦葉欒新鮮葉片3份，每份約2 g。轉(zhuǎn)入研缽中，加石油醚充分研磨后轉(zhuǎn)入小燒杯中，靜置20 min，倒去石油醚，分別加入60%丙酮溶液40 mL，將燒杯用保鮮膜封口，靜置過(guò)夜。60 ℃水浴下，回流2 h。完畢后，待回流液充分冷卻，取上層清液，按1.2.1中所述方法測(cè)量吸光度，并折算當(dāng)月葉片中總黃酮含量的平均值。

表1 錦葉欒葉片中黃酮提取的正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 錦葉欒葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定 利用Handy PEA(Hansatech，UK)植物效率分析儀于2013年4—10月30日，每月30日的9∶00—11∶30測(cè)定自然條件下錦葉欒葉片的葉綠素?zé)晒鈪?shù)。選取具有代表性的長(zhǎng)勢(shì)中庸枝條上的中部葉片進(jìn)行活體測(cè)定。首先葉夾子夾住葉片中部，暗處理20 min，后給以3000 μmol·m-2·s-1的飽和光照射，照光300 μs之內(nèi)，每隔10 μs記錄1次，獲得30個(gè)點(diǎn)；隨后在3 ms之前，每隔100 μs記錄1次，得到27個(gè)點(diǎn)；接著在30 ms之前，每隔1 ms記錄1次，獲得27個(gè)點(diǎn)；到300 ms之前，每隔10 ms記錄1次，獲得27個(gè)點(diǎn)；到1 s之前，每隔100 ms記錄1次，得到9個(gè)點(diǎn)，共計(jì)記錄120個(gè)點(diǎn)的熒光信號(hào)，測(cè)得快速葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線及其參數(shù)，包括FO、FJ、FI、Fm和300 μs時(shí)的熒光(F300μs)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

試驗(yàn)結(jié)果表明，λ=505 nm為最大吸收波長(zhǎng)。以吸光度A為縱坐標(biāo)，溶液質(zhì)量濃度c(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，線性關(guān)系為y=16.93x-0.0159，R2=0.9987。

2.2 錦葉欒葉片中黃酮最佳提取方案確定

由表2可知，錦葉欒葉片中黃酮的最佳提取方案是A2B3C1D2，即以60%丙酮為提取劑，錦葉欒新鮮葉片與丙酮的料液比為1∶20，在60 ℃下回流提取2 h(即處理6)。從極差分析可知，各因素對(duì)黃酮提取效率的影響順序?yàn)椋禾崛?回流時(shí)間>回流溫度>料液比。

2.3 錦葉欒葉片中黃酮含量隨時(shí)間的變化

由圖2可以看出，錦葉欒在其旺盛生長(zhǎng)階段(5—6月)，葉片中均具有較高的黃酮含量。錦葉欒葉片內(nèi)總黃酮含量在5月底時(shí)達(dá)到峰值(36.72 mg·g-1)，在6月時(shí)，葉片總黃酮含量也保持較高水平，黃酮含量高達(dá)35.26 mg·g-1，含量雖然比5月底略有降低，但下降幅度不明顯。之后含量逐漸降低，到10月下旬，含量降至4月的幼葉黃酮含量的水平。顯然在經(jīng)過(guò)7—8月的高溫之后，錦葉欒的黃酮含量呈現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)。原因可能在于夏季高溫高濕造成了錦葉欒生長(zhǎng)逆境，植株健康受到脅迫，葉片色素受到影響，可以利用葉綠素?zé)晒馓结樧鞒鲞M(jìn)一步的判斷。

表2 錦葉欒葉片中黃酮提取正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 錦葉欒葉片葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線分析

通過(guò)高速連續(xù)激發(fā)光照射得到的葉綠素快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線(OJIP曲線)蘊(yùn)含著PSII原初光化學(xué)反應(yīng)的豐富信息，能全面反映PSII的光反應(yīng)過(guò)程、效率和結(jié)構(gòu)[16-17]。由于原始熒光數(shù)據(jù)繪制的OJIP曲線變異性較大，易受葉片表面附屬物、照光面積、色素含量、材料厚度、儀器電壓等各種因素的影響，不同葉位的OJIP 曲線往往不具可比性。通過(guò)數(shù)學(xué)方法把熒光信號(hào)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，使所有曲線具有相同的起點(diǎn)，這樣無(wú)論測(cè)定樣品的形態(tài)、屬性、大小是否相同，都可以進(jìn)行比較[16-17]。其中一種方法是用Fm-Fo進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)用V(O-P)表示，V(O-P)=(Ft-Fo)/(Fm-Fo)(Ft為任意時(shí)刻的熒光數(shù)值)，用V(O-P)繪制的OJIP曲線O相的熒光強(qiáng)度均為0。由圖3的OJIP曲線可以看出，在生長(zhǎng)季節(jié)，錦葉欒葉片的OJIP曲線形態(tài)從6月下旬—10月上旬發(fā)生了較大變化，說(shuō)明葉片的光合作用系統(tǒng)PSII受到環(huán)境條件變化的影響。通常初始熒光F0出現(xiàn)在照光后的50 s，J點(diǎn)出現(xiàn)在2 ms，I點(diǎn)出現(xiàn)在30 ms。若在300 s時(shí)出現(xiàn)K點(diǎn)，說(shuō)明光合放氧復(fù)合體OEC(oxygen evolving complex)受到損傷，致?lián)p傷因子可能是熱脅迫、氮素脅迫以及水脅迫等[18]。為了更清楚地了解葉綠素快速熒光曲線初始階段狀況，對(duì)生長(zhǎng)季節(jié)不同月份錦葉欒葉片的快速熒光動(dòng)力學(xué)曲線用FJ-F0進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

用FJ-Fo進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，標(biāo)準(zhǔn)化的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)用V(O-J)表示，V(O-J)=(Ft-Fo)/(FJ-Fo)，用V(O-J)繪制的OJIP曲線O相的熒光強(qiáng)度均為0。O—J段上升過(guò)程是一個(gè)光化學(xué)階段，主要與光合作用系統(tǒng)PSII的原初電子受體質(zhì)體醌QA的還原有關(guān)，熒光的上升依賴于吸收的光量子數(shù)量[19]。由圖4的OJIP曲線形態(tài)可見(jiàn)，相對(duì)初始斜率M0明顯不同，其中4月30日的數(shù)值最高，原因在于葉片的光合作用機(jī)構(gòu)未發(fā)育完全；10月30日的數(shù)值次之，但顯著高于5月30日的數(shù)值，這是秋季低溫對(duì)光合作用機(jī)構(gòu)造成傷害的結(jié)果；5月30日的數(shù)值最低，6月30日以后明顯升高，說(shuō)明錦葉欒在經(jīng)歷北京夏季高溫高濕之后，葉片PSII反應(yīng)中心受到負(fù)面影響，處于關(guān)閉狀態(tài)的反應(yīng)中心比率處于高位狀態(tài)。在J點(diǎn)的相對(duì)熒光強(qiáng)度以4月30日的測(cè)定結(jié)果最高，10月30的日次之，此二者的數(shù)值明顯高于其他時(shí)間測(cè)定結(jié)果，表明PSII電子供體側(cè)表現(xiàn)出一定程度的限制。但是K點(diǎn)在10月30日的熒光動(dòng)力學(xué)曲線上出現(xiàn)(圖4)，說(shuō)明光合作用機(jī)構(gòu)已經(jīng)受到實(shí)質(zhì)性損傷；而7—8月的高溫并導(dǎo)致K點(diǎn)未明顯顯現(xiàn)，亦即光合放氧復(fù)合體還未遭到高溫高濕環(huán)境的不可逆?zhèn)Α?/p>

圖3 錦葉欒葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線圖4 錦葉欒葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)曲線O—J段

在葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)的表觀通量或者表觀活性(Phynomenological fluxes or phynomenological activities)方面，圖5有9個(gè)參數(shù)，表3選擇列舉了4個(gè)參數(shù)，分別是：ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo，其中ABS/CSo表示單位面積吸收的能量，5月、6月、7月錦葉欒葉片單位面積吸收光量子能量明顯高于其他時(shí)段。但是7月，ABS/CSo已經(jīng)表現(xiàn)出一定程度的下降。其他3個(gè)指標(biāo)，單位面積能量耗散DIo/CSo、單位面積捕獲的能量TRo/CSo、單位面積用于電子傳遞的能量ETo/CSo均表現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)。

單位面積具有活性的PSII反應(yīng)中心數(shù)量以RC/CSo表示，5月30日和6月30日測(cè)得數(shù)值顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，表3顯示8月底以后和4月底以前的錦葉欒葉片，活躍的PSII反應(yīng)中心密度極低。

表3 錦葉欒葉片主要熒光參數(shù)在生長(zhǎng)期內(nèi)的變化動(dòng)態(tài)

*：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差；*為顯著性水平P<0.05；**為著性水平P<0.01。

3 結(jié)論與討論

光合驅(qū)動(dòng)力參數(shù)DFabs表明，只有5月底和6月底2個(gè)時(shí)間點(diǎn)錦葉欒葉片處于光合作用旺盛的健康狀態(tài)，其他各時(shí)間點(diǎn)的光合作用機(jī)構(gòu)均或多或少受到一定程度的脅迫。該參數(shù)是一個(gè)重要的表征測(cè)試樣品活性的重要指標(biāo)，實(shí)質(zhì)上是表示植物內(nèi)在的抵御外界脅迫限制的綜合能力。比最大光化學(xué)效率Fv/Fm更靈敏地反映外界環(huán)境因子的脅迫。本試驗(yàn)中，7月底觀測(cè)到的光合驅(qū)動(dòng)力參數(shù)比6月明顯降低，說(shuō)明錦葉欒對(duì)高溫敏感。事實(shí)上，盛夏季節(jié)頂端葉片以及靠近樹(shù)冠外圍的葉片，因長(zhǎng)時(shí)間接受強(qiáng)烈光照幾乎枯黃脫落，而樹(shù)冠內(nèi)側(cè)葉片外觀上少有焦葉卷邊現(xiàn)象。在光能的吸收、傳遞與轉(zhuǎn)換效率上優(yōu)于靠外側(cè)的葉片，因此依然能保持相對(duì)正常的生理代謝。

本研究中表明，錦葉欒光合作用最旺盛的時(shí)期在5—6月，同樣地，葉片內(nèi)總黃酮含量也最高。7月的高溫天氣對(duì)錦葉欒光合作用機(jī)構(gòu)造成了損傷，致使其光合作用能力下降，相應(yīng)地，葉片內(nèi)黃酮含量也隨之下降。因此錦葉欒葉片內(nèi)黃酮的積累與光合作用狀態(tài)存在對(duì)應(yīng)關(guān)系。至于高溫以何種方式、多大程度上造成對(duì)錦葉欒的脅迫有待進(jìn)一步研究。

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Dynamic Analysis of Total Flavonoids and Chlorophyll Fluorescence Parameters ofKoelreuteriapaniculata′Jinye′

LI Xiao-yu1，MEI Guang-yun1，LI Yang2，HUANG Shi-yang1，REN Jian-wu1，XIAO Chu-yan1

(1.CollegeofBiologicalScienceandTechnology，BeijingForestryUniversity，Beijing100083，China；2.ForestSeedandSeedingCenterofBeijing，Beijing100029，China)

Fresh leaves ofKoelreuteriapaniculata′Jinye′ were probed to determine the best extraction scheme of total flavonoids from the leaf blade.Orthogonal experimental design was implemented，with 60% acetone as extraction agent，1∶20 ratio of was fresh leaves and acetone solid-liquid 60 ℃ and refluxing for 2 hours.Seasonal variation of total flavonoids content in the leaves was measured by Spectrophotometry.The results demonstrated that：in the vigorous growth period，the blades had high content of total flavonoids，and the value reached the peak at the end of May(36.72 mg·g-1fresh weight of leaves)，keeping in high and stable level beyond June，and then decreased gradually below the average value (22.06 mg·g-1fresh weight of leaves) when entering into the hot July.In the aim at investigating the reason for decrease of flavonoids content after experiencing midsummer heat in Beijing，JIP-test on chlorophyll fluorescence was carried out.The chlorophyll fluorescence parameters in leaves were determined using Handy PEA，and the results demonstrated that the photosynthetic apparatus was stressed to some certain when exposed to high temperature in July.The heat stress curtain the photosynthetic vitality of leaves，which might further lead to a decreased accumulation of flavonoids in the leaves ofKoelreuteriapaniculata′Jinye′.

Koelreuteriapaniculata′Jinye′；flavonoids；chlorophyll fluorescence parameters

10.13428/j.cnki.fjlk.2016.02.012

2015-06-23；

2015-08-01

首都增彩延綠科技示范工程(D111100000911001)；北京市大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃(S1310022017)

李小雨(1993—)，男，北京人，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院本科生，從事生物技術(shù)研究。E-mail：hongyang905@sina.com。

任建武(1967—)，男，山西大同人，北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院副教授，博士，從事植物生物技術(shù)研究。E-mail：jianwur@sina.com。

S718.43

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1002-7351(2016)02-0066-07