陳麗舒，楊元生，陳墾，陳杏田，劉少波（.廣東藥科大學(xué) 臨床學(xué)院，廣東 廣州 500；.廣東藥科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東廣州5000；.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州50006）

TNFAIP3/A20協(xié)同地塞米松在重癥急性胰腺炎發(fā)生早期的保護作用

陳麗舒1，楊元生2，陳墾1，陳杏田1，劉少波3
（1.廣東藥科大學(xué) 臨床學(xué)院，廣東 廣州 510310；2.廣東藥科大學(xué)第二附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣東廣州510300；3.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006）

目的了解腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3（TNFAIP3/A20）在重癥急性胰腺炎（SAP）起病早期胰腺中的表達情況，并探討TNFAIP3/A20協(xié)同地塞米松（DEX）在重癥急性胰腺炎早期發(fā)揮的作用。方法96只SD大鼠隨機分為空白組（SO組）、重癥急性胰腺炎組（SAP組）、地塞米松組（DEX組），3組于2、6、12、24 h時間點每組分別處死8只。SAP組和DEX組用牛黃膽酸鈉誘導(dǎo)大鼠建立SAP模型，DEX組大鼠下肢肌注0.5 mg/100 g地塞米松進行治療，其余兩組不干預(yù)。HE染色觀察胰腺、肝臟病理損傷，碘比色法測血清淀粉酶（AMS）含量，ELISA法檢測胰腺組織NF-κB、IκB表達量，RT-PCR法檢測胰腺組織中TNFAIP3/A20 mRNA表達量。比較3組大鼠不同時段上述指標(biāo)的差異。結(jié)果24 h DEX組胰腺炎癥損傷較SAP組減輕；各時間點DEX組血清AMS較SAP組降低（P＜0.01）；各時間點SAP組、DEX組血清AMS均較 SO組升高（P＜0.01）。各時間點 DEX組較 SAP組胰腺組織中 NF-κB、IκB含量降低（P＜0.01）。各時間點DEX組較SAP組胰腺組織TNFAIP3/A20 mRNA含量表達升高（P＜0.05），且隨時間推移呈遞增趨勢。各時間點DEX組、SAP組胰腺炎癥損傷評分、血清AMS、組織NF-κB、IκB、A20含量較SO組升高。結(jié)論TNFAIP3/A20可能協(xié)同DEX在SAP疾病發(fā)生早期發(fā)揮保護作用。

腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3；核因子-κB抑制蛋白；重癥急性胰腺炎；地塞米松

重癥急性胰腺炎（sever acute pancreatitis，SAP）是臨床常見的消化系統(tǒng)疾病，其中20%～25%的病人病情易加重，可出現(xiàn)局部或全身并發(fā)癥、多器官功能衰竭甚至威脅生命。研究指出IKK/IκB/NF-κB信號通路在多種急、慢性疾病中都發(fā)揮重要作用，參與了炎癥細胞增殖、分化、凋亡等生物過程。而地塞米松（dexamethasone，DEX）為臨床治療SAP常用藥物，能明顯緩解患者腹痛、腹脹癥狀，其作用可能與抑制促炎細胞因子產(chǎn)生及減少中性粒細胞聚集有關(guān)。本文探討IKK/IκB/NF-κB抑制蛋白TNF-α誘導(dǎo)蛋白3協(xié)同DEX在SAP疾病早期對胰腺組織炎癥反應(yīng)的保護作用。

1　材料

1.1實驗動物與分組

SPF級SD雌性大鼠96只，8周齡，體質(zhì)量（200 ±40）g，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號:SCXK（粵）2013-0002。96只大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為空白組（SO組）、SAP組、DEX組，每組分為2 h、6 h、12 h、24 h 4個時間點組，每時間點各8只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2試劑與儀器

5%（ρ）牛黃膽酸鈉、DEX（Sigma公司）；戊巴比妥鈉（鼎國生物技術(shù)公司）；752紫外分光光度計（上海凌光公司）；酶標(biāo)儀 iMark（BIO-RAD公司）；Scanspeed 1730R低溫離心機（Labogene公司）；DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏公司）；C1000 Thermal cycler普通PCR儀（BIO-RAD公司）；7300熒光定量儀（ABI公司）；UV Transilluminator M-26凝聚成像系統(tǒng)（UVP公司）；EPS-300電泳儀（Tanon公司）；顯微數(shù)碼照相機（Leica公司）；大鼠NF-κB ELISA試劑盒（邦奕生物技術(shù)公司）；淀粉酶試劑盒（南京建成生物工程研究所）；TNF-α誘導(dǎo)蛋白3兔抗大鼠抗體（Santa cruze公司）；二抗山羊抗兔（中杉金橋公司）；DAB顯色劑（Novolink公司）。

2　方法

2.1SAP模型建立及標(biāo)本采集

應(yīng)用5%（ρ）牛黃膽酸鈉（sodium taurocholate，STC）逆向胰膽管靜推誘導(dǎo)大鼠SAP模型，用微泵緩慢泵入5%STC（0.1 mL/100 g，0.3 mL/min），注射完2～3 min后觀察到胰腺充血、腫脹、胰膽管均擴張。SO組僅開腹有翻動腸管和胰腺之后關(guān)腹。兩組大鼠均于術(shù)后在大腿皮下注射生理鹽水（2 mL/100 g），于2、6、12、24 h時間點用3%（ρ）戊巴比妥鈉麻醉大鼠后心臟取血（4 mL）處死大鼠，血液室溫放置2 h，1 000 r/min離心 10 min，取上層血清分裝入 EP管內(nèi)-70℃凍存?zhèn)溆?，留取胰腺組織標(biāo)本后凍存于液氮。

2.2病理切片

所有大鼠均取相同部位的胰腺組織大小約1 cm×1 cm×0.5 cm，生理鹽水洗凈后，4%（φ）多聚甲醛溶液固定24 h、脫水、脫脂、石蠟包埋、切片及HE染色。顯微鏡下觀察各時間點病理變化結(jié)果，并用Kusske大鼠胰腺病理組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)［1］進行評分。

2.3血清淀粉酶（serum amylase，AMS）檢測

取備用血清采用碘-淀粉比色法檢測血清AMS的含量，按照說明書配好待測溶液，利用752紫外分光光度計于波長606 nm下測量樣本A值，用標(biāo)準(zhǔn)品繪制A值曲線，根據(jù)公式計算出樣本AMS含量。

2.4ELISA法檢測胰腺NF-κB、IκB含量

將胰腺組織剪成細小碎片，溶解裂解液RIPA使用前加入 1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF），以每20 mg組織200 mL裂解液比例加入裂解液，50 mg組織用玻璃勻漿器充分勻漿裂解，2 000～3 000 r/min，離心20 min左右收集上清。采用間接夾心ELISA法，按照說明書進行包被，加樣，加酶標(biāo)抗體，顯色，終止反應(yīng)等步驟后得出A值，利用標(biāo)準(zhǔn)品繪制的A值曲線得出樣本的最終濃度。

2.5RT-PCR法檢測胰腺中腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白3（TNF-alpha-inducedprotein3，TNFAIP3/A20）mRNA的表達情況

2.5.1引物設(shè)計 GenBank上查找目的基因mRNA序列，在 CDS區(qū)設(shè)計特異性引物，運用 Primer express 2.0軟件進行引物設(shè)計:Sequence Name: R-A20（擴增片段長度102 bp）

Forward Primer:5′-TGAGCGTTGTCACAATGCG-3′Reverse Primer:5′-ATGCCGTTAAACGTCCGAGT-3′。內(nèi)參基因:

Sequence Name:R-GAPDH（擴增片段長度110 bp）Forward Primer:5′-AGGGCTGCCTTCTCTTGTGA-3′Reverse Primer:5′-AACTTGCCGTGGGTAGAGTCA-3′。

2.5.2組織總RNA提取 在超凈臺內(nèi)，取約0.5 g胰腺組織于EP管內(nèi)，剪碎后加Trizol 1 mL再用玻璃棒研磨勻漿，混勻，室溫放置5 min，加入氯仿0.2 mL，振蕩15 s，室溫孵育2～3 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液至新的1.5 mL EP管。加入上清液等體積的異丙醇，混勻，-20℃孵育樣品20～30 min，4℃12 000 r/min離心10 min，棄上清。75% （φ）乙醇800 μL洗滌沉淀1次，4℃7 500 r/min離心5 min，棄乙醇。真空干燥5～10 min，加DEPC處理水20～50 μL溶解RNA，-80℃?zhèn)溆谩?/p>

2.5.3PCR反應(yīng) 待測樣本PCR反應(yīng)體系為H2O 18 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPS 0.5 μL，TAQ 0.5 μL，F(xiàn)orward Primer（10 pmol/μL）0.5 μL，Reverse Primer（10 pmol/μL）0.5 μL，cDNA 2 μL，總體積25 μL。擴增條件為93℃ 2 min，然后93℃15 s，55℃25 s，72℃25 s，共40循環(huán)。結(jié)果應(yīng)用相對定量法-Ct值的定量方法，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，△△Ct=ΔCt-△Ct最大值，樣本的相對表達量=2-△△Ct。

2.6統(tǒng)計學(xué)處理

3　結(jié)果

3.13組大鼠各時間點胰腺的病理變化

SO組大鼠胰腺組織結(jié)構(gòu)完好，無明顯變化。SAP組:2 h組腺泡細胞結(jié)構(gòu)完整，少量單核細胞滲出；6 h組有中量單核細胞滲出，少量出血；12 h組細胞組織結(jié)構(gòu)混亂，出血，出現(xiàn)凝固性壞死；24 h組腺泡細胞結(jié)構(gòu)混亂，大片壞死，出血，見表1、圖1。DEX組:2 h組腺泡細胞結(jié)構(gòu)完整，未見單核細胞滲出，6 h組有少量單核細胞滲出，無出血，12 h組細胞結(jié)構(gòu)較為完整，出現(xiàn)單核細胞滲出，24 h組織出現(xiàn)少量凝固性壞死，無明顯出血。DEX組病理評分較SAP組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

3.2各時間點3組AMS含量的變化

SAP組、DEX組血清AMS均較SO組升高（P＜0.01），且隨時間點推移呈遞增趨勢，DEX組血清AMS較SAP組降低（P＜0.01），SO組隨時間點無明顯變化。見表2。

表1　3組各時間點胰腺病理評分比較Table 1 Scores of pancreatic pathology in three groups at different times（，n=8）

表1　3組各時間點胰腺病理評分比較Table 1 Scores of pancreatic pathology in three groups at different times（，n=8）

與SO組比較:▲P＜0.01；與SAP組比較:△P＜0.01。

組別　2 h　6 h　12 h　24 h SO組　0.94±0.42　0.96±0.23　1.10±0.56　0.11±0.38 SAP組　2.8±0.45▲　6.2±0.13▲　12±1.00▲　13.6±1.67▲DEX組　0.95±0.42△　4.4±0.65△　6.9±0.74△　7.9±0.74△

圖1　HE染色各組胰腺組織鏡下病理改變（HE，400×）Figure 1 Pathology of pancreatic tissue in 24 h by HE staining（HE，400×）

3.3 各時間點3組間胰腺中NF-κB、IκB含量的比較

各時間點DEX組NF-κB含量較SAP組降低（P ＜0.01），SAP組、DEX組胰腺NF-κB含量隨時間推移逐漸升高且與SO組差異明顯（P＜0.01），SO組各時間點間無明顯變化。各時間點DEX組胰腺IκB含量較SAP組降低（P＜0.01），SAP組、DEX組胰腺IκB隨時間推移逐漸升高且與SO組差異明顯（P＜ 0.01），SO組各時間點間無明顯變化。見表3。

3.4各組大鼠胰腺TNFAIP3/A20 mRNA的表達結(jié)果

DEX組各時間點TNFAIP3/A20 mRNA含量較SAP組增加（P＜0.01），DEX組胰腺A20 mRNA表達隨時間推移遞增趨勢明顯（P＜0.01），且較SO組明顯增加（P＜0.05）。見表4。

表2　各時間點3組之間血清AMS含量的比較Table 2 Level of serum amylase in three groups at different times（，n=8）　　ρ/（U·L-1）

表2　各時間點3組之間血清AMS含量的比較Table 2 Level of serum amylase in three groups at different times（，n=8）　　ρ/（U·L-1）

與SO組比較:▲P＜0.01；與SAP組比較:△P＜0.01。

組別　2 h　6 h　12 h　24 h SO組　573.3±124.9　582.6±103.6　580.0±124.9　579.3±103.5 SAP組　1 580.0±330.5▲　1 863.3±259.3▲　3 560.0±591.9▲　4 076.7±637.7▲DEX組　791.7±100.6△　1 291.0±241.4△　2 480.7±329.6△　3 119.0±203.3△

表3　不同時間點3組胰腺NF-κB、IκB含量的比較Table 3 Levels of NF-κB and IκB in three groups at different times（，n=8）　　ρ/（U·L-1）

表3　不同時間點3組胰腺NF-κB、IκB含量的比較Table 3 Levels of NF-κB and IκB in three groups at different times（，n=8）　　ρ/（U·L-1）

與SO組比較:▲P＜0.01；與SAP組比較:△P＜0.01。

組別　NF-κB IκB 2 h　6 h　12 h　24 h 2 h　6 h　12 h　24 h SO組　3.831±0.458　3.398±0.950　2.432±3.292　4.332±0.619　2.748±0.974　2.615±1.128　2.698±1.024　2.681±0.907 SAP組　36.364±7.025▲43.712±6.294▲58.989±7.834▲83.199±16.970▲15.520±2.673▲　9.220±0.567▲　8.836±1.937▲　7.268±2.634▲DEX組　23.031±7.378△33.712±6.294△48.989±5.910△63.199±9.850△10.187±1.634△　5.220±1.433△　5.169±2.450△　4.601±2.496△

表4　不同時間點兩組之間胰腺TNFAIP3/A20 mRNA含量的比較Table 4 Expression of pancreatic TNFAIP3/A20 mRNA in three groups at different times（，n=3）

表4　不同時間點兩組之間胰腺TNFAIP3/A20 mRNA含量的比較Table 4 Expression of pancreatic TNFAIP3/A20 mRNA in three groups at different times（，n=3）

與SAP組比較:▲P＜0.01；與SO組比較，△P＜0.05。

組別　2 h　6 h　12 h　24 h SO組　6.246±3.208　6.122±2.688　6.405±3.160　6.595±3.109 SAP組　8.615±4.188▲　20.509±1.539▲　21.582±5.547▲　28.917±10.679▲DEX組　9.859±7.906△　39.678±17.557△　94.323±13.555△　344.232±68.410△

4　討論

SAP迄今仍無特效藥，其起病機制涉及NF-κB等炎癥通路的激活引起的機體免疫應(yīng)答反應(yīng)。NF-κB參與免疫反應(yīng)的早期和炎癥反應(yīng)各階段，AIPTNF3/A20、血紅素加氧酶-1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-1等受NF-κB雙向調(diào)控［2］，JAK2被EPO受體活化激活NF-κB，STAT1與TNF-α受體結(jié)合以下調(diào) NF-κB，而 MAPK/ERK激酶-1及其家族中p38、ERK1/2可激活NF-κB［3］，可見NF-κB激活或抑制過程中受多種因子調(diào)控。AIPTNF3/A20作為炎性負調(diào)節(jié)關(guān)鍵分子，通過泛素化影響NF-κB的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而減輕炎癥損傷［4］。本研究旨在探究TNFAIP3/A20協(xié)同DEX在SAP疾病早期對NF-κB/IκB信號通路的抑制作用，為臨床診療提供理論基礎(chǔ)。

IκB（inhibitor of NF-κB，IκB）通過C端錨蛋白重復(fù)序列與NF-κB結(jié)合以抑制NF-κB活化。本實驗結(jié)果顯示，DEX組、SAP組大鼠胰腺組織NF-κB、IκB含量較SO組升高，DEX組、SAP組炎癥損傷程度與NF-κB、IκB含量增加趨勢成正比?？赡苡捎谝认偌毎麅?nèi)MyD88介導(dǎo)NF-κB/IκB信號通路激活I(lǐng)κB激酶復(fù)合體（IκB kinase，IKK）后使IκB磷酸化，NF-κB暴露核定位位點，游離NF-κB移位到細胞核，與特異性κB序列結(jié)合，NF-κB/IκB信號通路被激活，啟動炎性細胞因子轉(zhuǎn)錄［5］，誘發(fā)SAP早期炎癥。

DEX早期藥理作用為減輕組織滲出、水腫、毛細血管擴張、白細胞浸潤及吞噬反應(yīng)的作用。本研究結(jié)果顯示，DEX組較SAP組胰腺組織炎癥損傷減輕，血清AMS降低。推測可能由于DEX通過糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid reccptor，GR）結(jié)合后形成激素-受體復(fù)合體轉(zhuǎn)移到細胞核中，以同型二聚體形式與糖皮質(zhì)激素應(yīng)答原件（GRE）結(jié)合，影響靶基因轉(zhuǎn)錄［6］，激活膜結(jié)合蛋白等抗炎蛋白的翻譯以減輕SAP大鼠早期炎癥損傷。而TNFAIP3/A20為編碼790氨基酸的90 000含有7個調(diào)控NF-κB所必需的Cys2-Cys2鋅指（zincfinger，ZnF）基序的TNF-α誘導(dǎo)性表達蛋白，其基因定位于染色體6q23.3［7］。DEX組較SAP組胰腺組織中 NF-κB、IκB含量降低，TNFAIP3/A20含量升高。TNFAIP3/A20具有與調(diào)節(jié)分子TAX1BP1聯(lián)合并與E2酶接觸，引起泛素化合蛋白酶體降解，從而抑制炎癥信號傳導(dǎo)通路傳導(dǎo)的作用［8］。吳麗娟等［9］研究結(jié)果表明 TNFAIP3/ A20對人單核細胞LPS/NF-κB/IκB具有明顯調(diào)節(jié)作用，能下調(diào)NF-κB、TNF-α表達；TNFAIP3/A20為TNF-α抑制蛋白，劉納新等［10］研究表明DEX治療可下調(diào)TNF-α并使得SAP炎癥緩解。本研究結(jié)果提示DEX可能協(xié)同TNFAIP3/A20對SAP大鼠胰腺組織NF-κB/IκB信號通路起到一定的抑制作用。

本實驗中 DEX組較 SAP組胰腺組織TNFAIP3/A20 mRNA含量表達升高，DEX組與SAP組均較SO組升高，推測SAP模型大鼠起病早期胰腺內(nèi)NF-κB/IκB信號通路被激活致炎癥損傷逐步加重，刺激TNFAIP3/A20升高但不足以逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)；DEX組胰腺內(nèi)TNFAIP3/A20較SAP組大幅升高，炎癥損傷較SAP組緩解；而SO組各時間點NF-κB、IκB、TNFAIP3/A20含量未發(fā)生明顯變化。推測TNFAIP3/A20可能存在抑制IκB作用從而阻斷NF-κB/IκB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，并協(xié)同DEX抑制SAP大鼠胰腺炎癥的發(fā)生發(fā)展，其分子調(diào)節(jié)機制有待進一步深究。

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（責(zé)任編輯：幸建華）

Protection of TNFAIP3/A20 coordinated with dexamethasone in early stage of severe acute pancreatitis

CHEN Lishu1，YANG Yuansheng2，CHEN Ken1，CHEN Xingtian1，LIU Shaobo3
（1.ClinicalMedicalCollege，GuangdongPharmaceuticalUniversity，Guangzhou510310，China；2.Departmentof Gastroenterology，the Second Affiliate Hospital of Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510310，China；3.Traditional Chinese Medicine College，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To study the expression of tumor necrosis factor-inducible protein 3（TNFAIP3/A20）in pancreas during the early onset of severe acute pancreatitis（SAP），and the effect of TNFAIP3/A20 coordinated with dexamethasone（DEX）in the early stage of SAP.Methods 96 SD rats were randomly divided into three groups，including the SO group，the SAP group and the DEX group.The model of SAP was established by sodium taurocholate treatment.Eight SD rats were killed in each group at 2，6，12 and 24 h.The pathological damage of pancreas and liver was observed by HE staining.Serum amylase（AMS）was detected by iodine-starch colorimetry.The expression of NF-κB and IκB was measured by ELISA.TNFAIP3/A20 mRNA in pancreas was detected by RT-PCR.Results Compared with the SAP group，DEX treatment attenuated the inflammatory injury in pancreas at 24 h，and decreased serum AMS level and NF-κB and IκB expression at different times（P＜0.01）.In contrast，DEX treatment increased the expression of TNFAIP3/A20 mRNA in pancreas（P＜0.05）.Conclusion TNFAIP3/A20 coordinated with dexamethasone might play a protective role in the early stage of severe acute pancreatitis.

tumor necrosis factor-inducible protein 3；nuclear factor-κB inhibitory protein；severe acute pancreatitis；dexamethasone

R657.5+1

A

1006-8783（2016）04-0507-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2015111601

2015-11-16

廣東省科技廳社會發(fā)展項目（2012B060300029）

陳麗舒（1990—），女，2013級碩士研究生，Email:chenlishu90@163.com；通信作者:陳墾，男，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事胰腺病學(xué)臨床與基礎(chǔ)研究，Email:chenkenck@126.com。

網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-04-26 10:56 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160426.1056.002.html