李笑梅，馬慧玲（哈爾濱商業(yè)大學(xué)黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

三種預(yù)處理法對(duì)酶解產(chǎn)大豆異黃酮苷元的影響

李笑梅，馬慧玲
（哈爾濱商業(yè)大學(xué)黑龍江省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150076）

以市售大豆異黃酮粉為樣品，采用炒制、微波、烘箱加熱法對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理，研究其對(duì)酶解大豆異黃酮轉(zhuǎn)化大豆異黃酮苷元含量的影響。結(jié)果表明：炒制效果明顯好于烘箱和微波法（p＜0.05），炒制后大豆異黃酮苷元含量比烘箱、微波處理后分別增加1.238、1.240 mg/g。再運(yùn)用單因素、響應(yīng)曲面法對(duì)炒制條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為：炒制時(shí)間103 s，炒制溫度137℃，物料量13 g，此時(shí)大豆異黃酮苷元含量和轉(zhuǎn)化率為13.33 mg/g、72.23%。

炒制，酶解，大豆異黃酮苷元，響應(yīng)曲面

大豆異黃酮（soybean isoflavone）分為游離型和結(jié)合型兩種，其中結(jié)合型占總量的97%～98%。國內(nèi)外研究表明，游離型生物活性高于結(jié)合型［1-3］。糖苷型的大豆異黃酮不能直接被小腸壁吸收，必須經(jīng)水解去除糖基轉(zhuǎn)化為游離型的苷元才可被小腸吸收［4］，所以要提高大豆異黃酮利用率，開發(fā)大豆異黃酮苷元制備技術(shù)尤為重要。大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化技術(shù)主要有酸堿水解法、酶水解法［5］；最主要的酶有β-葡萄糖苷酶、葡萄糖酸酶、α-半乳糖苷酶、乳糖酶、真菌乳糖酶和乳糖酶F等［6］；微生物降解法，對(duì)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌種研究主要集中在酵母、曲霉、木霉以及細(xì)菌［7］。韓慧［8］的研究表明微波、炒制、烘箱干燥更有利于大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化。作為工業(yè)原料的大豆異黃酮主要是結(jié)合型，且游離型含量較高的產(chǎn)品價(jià)格也很高。因此，研究前處理及后期酶解處理的復(fù)合方法顯得尤為重要。本研究旨在探討篩選出有效的預(yù)處理法，使經(jīng)過預(yù)處理的結(jié)合型大豆異黃酮更易于酶解乃至于后續(xù)的微生物發(fā)酵，進(jìn)而提高苷元轉(zhuǎn)化率，為苷元制備技術(shù)的進(jìn)一步開發(fā)及成果轉(zhuǎn)化提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆異黃酮粉 純度30%，河南眾信生物科技有限公司；大豆素（Daidzein）、大豆黃素（Glycitein）、染料木素（Genistein）、大豆苷（Glycitin）、大豆黃苷（Glyctin）、染料木苷（Genistin）標(biāo)準(zhǔn)品 純度99%，均購于西安市天園生物制藥廠；黑曲霉β-葡萄糖苷酶南京生利德生物技術(shù)有限公司；甲醇 色譜純，美國天地公司；超純水 自制。

Agilent 1200LC高效液相色譜 美國安捷倫公司；TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；G80F23DCN3L-F7格蘭仕微波爐廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；AS3120A超聲波 天津奧特賽恩斯儀器有限公司；HZS-H恒溫水浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；炒鍋 市售。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 六種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品定性定量檢測(cè)

1.2.1.1 配制大豆異黃酮混合標(biāo)液 稱取一定量大豆苷、大豆黃苷、染料木苷、大豆素、大豆黃素、染料木素標(biāo)準(zhǔn)品，用80%甲醇溶解超聲30 min后定容，配制成六種單標(biāo)液，各濃度為0.4 mg/mL。再用上述六種標(biāo)液以相同比例分別配制成0.048、0.096、0.144、0.192、0.24 mg/mL系列濃度大豆異黃酮混和標(biāo)液［9］。

1.2.1.2 掃描最大吸收波長(zhǎng) 用0.048 mg/mL混標(biāo)在雙光束紫外分光光度計(jì)中進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.1.3 六種大豆異黃酮定性定量檢測(cè) 采用高效液相色譜法進(jìn)行定性定量檢測(cè)，固定相為Agilent1200LC C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶水=20%～60%為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.2 mL/min，柱溫為40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為確定的最大吸收波長(zhǎng)。將各單標(biāo)過0.45 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中，依次進(jìn)樣，各組分保留時(shí)間作為樣品的定性依據(jù)。將配制好的混合標(biāo)液進(jìn)樣，根據(jù)峰面積繪制六種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程。

按式（1）分別計(jì)算每種大豆異黃酮含量，大豆異黃酮苷元含量由三種游離型大豆異黃酮（大豆苷、大豆黃苷、染料木苷）相加得出，結(jié)合型大豆異黃酮總量由三種結(jié)合型大豆異黃酮（大豆素、大豆黃素、染料木素）相加得出；按式（2）計(jì)算大豆異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率。

式中：c—由各類型大豆異黃酮回歸方程得出其濃度，μg/mL；m—樣品量，g；v—定容體積，mL；m1—原料中游離型異黃酮含量，mg/g；m2—預(yù)處理后游離型異黃酮含量，mg/g；m3—原料中結(jié)合型異黃酮含量，mg/g。

1.2.2 大豆異黃酮原料預(yù)處理的篩選 預(yù)處理采用炒制、微波、烘箱三種方法，依據(jù)大豆異黃酮苷元含量的變化選擇對(duì)應(yīng)的預(yù)處理方法。

1.2.2.1 炒制及炒制加酶 稱取10 g大豆異黃酮原料（含水量3%；n=3），在130℃下炒制100 s。稱取0.3 g，加50 mL蒸餾水，800 W超聲波超聲30 min，移置離心管中，3000 r/min離心30 min，將上清液移至色譜瓶中，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。再取40 mL離心好的上清液，加入1 mL酶活186.053 IU/mL酶液，在45℃振蕩2 h，取酶解上清液進(jìn)行高效液相色譜，測(cè)定六種組分峰面積。

1.2.2.2 微波及微波加酶 稱取1 g大豆異黃酮原料（厚度約1 mm；n=3），放入800 W微波爐中間歇性處理5 min，其余步驟同1.2.2.1。

1.2.2.3 烘箱及烘箱加酶 稱取1 g大豆異黃酮原料（厚度約1 mm；n=3），100℃烘箱中烘1 h，其余步驟同1.2.2.1。

1.2.2.4 多重比較方差分析 運(yùn)用SPSSv16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較方差分析。

1.2.3 炒制預(yù)處理?xiàng)l件單因素實(shí)驗(yàn) 單因素實(shí)驗(yàn)主要考慮溫度、時(shí)間、物料質(zhì)量三個(gè)因素，以未經(jīng)前處理的大豆異黃酮原料為對(duì)照組，采用高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3.1 溫度對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響 物料質(zhì)量10 g，溫度70、100、130、160、190℃，炒制100 s，以峰面積為檢測(cè)指標(biāo)研究溫度對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響。

1.2.3.2 時(shí)間對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響 物料質(zhì)量10 g，在100℃下，分別炒制60、80、100、120、140 s，以峰面積為檢測(cè)指標(biāo)研究時(shí)間對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響。

1.2.3.3 物料量對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響

物料質(zhì)量5、10、15、20、25 g，在100℃下炒制100 s，以峰面積為檢測(cè)指標(biāo)研究物料量對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響。

1.2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化大豆異黃酮預(yù)處理?xiàng)l件 采用Box-Behnken模型，以溫度、時(shí)間與物料量三個(gè)單因素為影響大豆異黃酮苷元含量的主要考察因子（自變量），分別以x1、x2、x3表示，并以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平，按方程xi=（Xi-x0）/x對(duì)自變量進(jìn)行編碼。其中xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實(shí)值，x0為實(shí)驗(yàn)中心點(diǎn)處自變量的真實(shí)值，x為自變量的變化步長(zhǎng)，因子編碼及水平見表1。并采用多元回歸分析，擬合二次多項(xiàng)式回歸模型的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)［10］，進(jìn)行結(jié)果分析，得到大豆異黃酮預(yù)處理的優(yōu)化工藝條件，在此基礎(chǔ)上，做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼Table1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 六種大豆異黃酮標(biāo)樣定性檢測(cè)結(jié)果

圖1 大豆異黃酮紫外全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1 All ultraviolet wavelength scannogram of soybean isoflavone

2.1.1 大豆異黃酮最大吸收波長(zhǎng) 由紫外掃描圖可以看出，確定259 nm為最大吸收波長(zhǎng)。

2.1.2 大豆異黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 六種大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of six soybean isoflavones

峰面積y對(duì)大豆異黃酮濃度x（μg/mL）進(jìn)行回歸分析，回歸方程見表2。

表2 大豆異黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Table2 Standard curve of soybean isoflavones

2.1.3 大豆異黃酮的定性

2.1.3.1 混合標(biāo)樣中六種大豆異黃酮定性 根據(jù)單標(biāo)的保留時(shí)間對(duì)混標(biāo)色譜圖各組分進(jìn)行定性。由圖3可知，19.200 min是大豆苷，20.700 min是大豆黃苷，24.604 min是染料木苷，36.321 min是大豆素，38.383 min是大豆黃素，41.861 min是染料木素。

圖3 混合標(biāo)樣大豆異黃酮色譜圖Fig.3 The chromatogram of six soy isoflavones in standard substance

2.1.3.2 原料中大豆異黃酮的定性定量 由圖4可知，原料中各組分大豆異黃酮出峰時(shí)間與圖3混合標(biāo)樣各組分的出峰時(shí)間相同，含有上述六種大豆異黃酮。根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出原料中大豆苷含量為4.187 mg/g；大豆黃苷含量為2.764 mg/g；染料木苷含量為2.242 mg/g；大豆素含量為5.661 mg/g；大豆黃素含量為0.634 mg/g；染料木素含量為0.4 mg/g。三種結(jié)合型異黃酮總含量為9.193 mg/g；三種游離型異黃酮總含量為6.695 mg/g。

圖4 原料未經(jīng)預(yù)處理大豆異黃酮色譜圖Fig.4 The chromatogram of soybean isoflavones without any pretreatment in sample

2.2 大豆異黃酮預(yù)處理的篩選結(jié)果

三種預(yù)處理方法對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響見圖5。

圖5 不同預(yù)處理方法對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響Fig.5 The effect of different pretreatment methods on content of isoflavoues aglycone

由圖5和表3可知，經(jīng)炒制處理大豆異黃酮苷元含量比原料、烘箱和微波分別高出1.61、1.238、1.240 mg/g；烘箱和微波相比，大豆異黃酮苷元含量變化不顯著（p＞0.05）。炒制后再經(jīng)酶解大豆異黃酮苷元含量變化，均顯著高于只經(jīng)酶解和烘箱干燥、微波加酶解（p＜0.05），炒制酶解高于只經(jīng)酶解2.498 mg（37.24%）。由此得出炒制預(yù)處理方法有利于酶解大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化，可起到增效作用。此外也可看出，酶解法是苷元轉(zhuǎn)化的有效方法。

2.3 大豆異黃酮預(yù)處理的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 炒制溫度對(duì)大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果 由圖6可知，隨著炒制溫度升高大豆異黃酮苷元含量增加，當(dāng)溫度達(dá)到130℃時(shí)，含量達(dá)到最高；炒制溫度繼續(xù)增加，兩組的大豆異黃酮苷元的含量開始下降，原料顏色變深逐漸炭化，有機(jī)物氧化，所以炒制適宜溫度在100～160℃。馬玉榮［11］研究巴氏殺菌（95℃）、高溫短時(shí)殺菌（121℃）和超高溫瞬時(shí)殺菌（143℃）對(duì)豆?jié){中苷元含量的影響，121℃處理后，豆?jié){中苷元型異黃酮含量增加，143℃處理后，豆?jié){中苷元型異黃酮含量減少，說明對(duì)于不同的樣品適宜溫度的熱預(yù)處理方法可促進(jìn)大豆異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化。

表3 多重比較方差分析Table3 Multiple comparisons variance analysis

圖6 炒制溫度對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響Fig.6 The effect of stir-frying temperature on isoflavoues aglycon

2.3.2 炒制時(shí)間對(duì)大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果 由圖7可知，隨著炒制時(shí)間增加大豆異黃酮苷元含量升高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到100 s時(shí)，含量達(dá)到最高。繼續(xù)增加炒制時(shí)間，兩組的大豆異黃酮苷元的含量開始下降，炒制時(shí)間繼續(xù)增加，原料逐漸炭化，所以炒制適宜時(shí)間在80～120 s。

圖7 炒制時(shí)間對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響Fig.7 The effect of stir-frying time on isoflavones aglycon

2.3.3 物料量對(duì)大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率的影響結(jié)果

由圖8可知，隨著物料量的增加大豆異黃酮苷元含量升高，當(dāng)物料量達(dá)到10 g時(shí)，大豆異黃酮苷元含量達(dá)到最高。繼續(xù)增加物料量，兩組的大豆異黃酮苷元的含量逐漸下降，大豆異黃酮苷元含量變化和加熱容器大小有一定的關(guān)系，物料量厚度約在2 mm，加熱較為均勻有利于大豆異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化，所以適宜物料量在5～15 g。

圖8 炒制物料量對(duì)大豆異黃酮苷元含量變化的影響Fig.8 The effect of stir-frying quality on isoflavones aglycon

2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化大豆異黃酮預(yù)處理?xiàng)l件結(jié)果

表4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果Table4 Design and results of experiment

利用Design Expert軟件對(duì)表4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元回歸擬合分析，得到了炒制加酶處理后原料中大豆異黃酮苷元的回歸方程：Y=13.02-0.20x1-0.54x2-0.53x3+0.096x1x2+0.65x1x3-0.12x2x3-2.06x-1.94x-2.57x。

2.4.1 炒制加酶模型及回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

從表5方差分析及顯著性分析結(jié)果可知，對(duì)優(yōu)化得到的模型進(jìn)行擬合，確定炒制加酶處理后，結(jié)合型大豆異黃酮轉(zhuǎn)化成游離型大豆異黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得到的R2為99.48%，校正后的R為98.81%，說明該模型可靠。建立的數(shù)學(xué)模型p＜0.0001，極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說明該實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫財(cái)M合實(shí)驗(yàn)的真實(shí)情況，可用于炒制前處理的條件優(yōu)化。另外模型一次項(xiàng)x1顯著，x2、x3極顯著；交互項(xiàng)x1x3極顯著，說明炒制溫度和物料量的交互對(duì)大豆異黃酮苷元含量影響顯著。x1x2、x2x3不顯著；二次項(xiàng)x、x、x均極顯著。

表5 回歸方程系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table5 Significance test of the regression equation coefficients

2.4.2 大豆異黃酮苷元含量變化的響應(yīng)面分析

圖9 炒制時(shí)間、炒制溫度及交互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的響應(yīng)面Fig.9 Response surface plot for the effect of frying time（s）and temperature（℃）on content of isoflavoues aglycone

2.4.2.1 炒制時(shí)間和炒制溫度的交互作用 由圖9可知，在物料量為最佳值13.00 g時(shí)，從其等高線圖可以直觀地看出炒制時(shí)間與炒制溫度對(duì)酶解大豆異黃酮苷元含量影響不顯著。隨著炒制溫度的上升，大豆異黃酮苷元含量逐漸增加，在炒制溫度為136.93℃時(shí)，大豆異黃酮苷元含量最大后逐漸下降。隨著炒制時(shí)間的增加，大豆異黃酮苷元含量逐漸增加，在炒制時(shí)間為102.80 s時(shí)，大豆異黃酮苷元含量達(dá)到最大，之后又逐漸下降。

2.4.2.2 炒制時(shí)間和物料量的交互作用 由圖10可知，在炒制溫度為最佳值136.93℃時(shí)，隨著炒制時(shí)間的增加，大豆異黃酮苷元含量逐漸增大，在炒制時(shí)間為102.80 s時(shí)，大豆異黃酮苷元含量達(dá)到最大，之后又逐漸下降。隨著物料量的上升，大豆異黃酮苷元含量逐漸增大，在物料量為13.00 g左右時(shí)，大豆異黃酮苷元含量最大，之后又逐漸下降。

圖10 炒制時(shí)間、物料量及相互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的響應(yīng)面Fig.1 0 Response surface plot for the effect of frying time（s）and quality（g）on content of isoflavoues aglycone

2.4.2.3 炒制溫度和物料量的交互作用 由圖11可知，在炒制時(shí)間為最佳值102.80 s時(shí)，隨著炒制溫度增加，大豆異黃酮苷元含量逐漸升高，在炒制溫度131.29℃左右達(dá)到最大，之后又逐漸下降。隨著物料量的上升，大豆異黃酮苷元含量逐漸增加大，在物料量為13.00 g時(shí)，大豆異黃酮苷元含量達(dá)到最大，之后又逐漸下降。

圖11 炒制溫度、物料量及相互作用對(duì)大豆異黃酮苷元含量的響應(yīng)面Fig.1 1 Response surface plot for the effect of frying temperature（℃）and quality（g）on content of isoflavoues aglycone

得到最優(yōu)工藝條件：炒制時(shí)間102.80 s，炒制溫度136.93℃，物料量13.00 g，此時(shí)大豆異黃酮苷元含量為13.26 mg/g；將以上數(shù)據(jù)校正為炒制時(shí)間103 s，炒制溫度137℃，物料量13 g。在此基礎(chǔ)上做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，大豆異黃酮苷元含量為13.33 mg/g，此時(shí)大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率為72.23%。與模型預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為1.2%。說明響應(yīng)面優(yōu)化后得到的回歸方程具有一定的實(shí)際指導(dǎo)意義。潘麗華［12］研究固定化β-葡萄糖苷酶水解染料木苷，轉(zhuǎn)化率為60.02%，本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)化率與其結(jié)果相比有所提高。

3 結(jié)論

以市售工業(yè)用大豆異黃酮原料為樣品，其中六種大豆異黃酮總量達(dá)15.888 mg/g，其中游離型6.693 mg/g結(jié)合型9.193 mg/g。在酶解大豆異黃酮產(chǎn)生游離大豆異黃酮苷元的基礎(chǔ)上，探討炒制、烘箱干燥、微波前處理方法對(duì)大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化的促進(jìn)作用。結(jié)果表明炒制效果明顯好于烘箱和微波法（p＜0.05），炒制處理后大豆異黃酮苷元含量高出未處理原料1.61 mg/g；炒制后再經(jīng)酶解大豆異黃酮苷元含量高于只經(jīng)酶解37.24%。響應(yīng)曲面法優(yōu)化炒制工藝條件結(jié)果為：炒制時(shí)間103 s，炒制溫度137℃，物料量13 g，在此條件下大豆異黃酮苷元轉(zhuǎn)化率達(dá)到72.23%。后續(xù)還要進(jìn)一步研究結(jié)合型大豆異黃酮的熱穩(wěn)定性、酶水解條件及微生物發(fā)酵工藝條件，提高大豆異黃酮苷元的轉(zhuǎn)化率。

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Effect of three pretreatments on enzymatic hadrolysis isoflavoues aglycone

LI Xiao-mei，MA Hui-ling
（Key Laboratory of Food Science and Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，China）

Frying，microwave and oven heating were used to preprocess the soy isoflavones materials commercially.The influence on the content of isoflavoues aglycone which was conversed enzymatic soy isoflavones was discussed through the preprocess method.The results showed that:frying was significantly better than the oven and microwave method（p＜0.05），the content of fried isoflavoues aglycone was higher than the oven，microwave 1.238，1.240 mg/g differently.Pretreatment conditions were optimized using single factor and response surface methodology to obtain results.The corrected value were frying time 103 s，frying temperature 137℃and the amount of material 13 g.The content and conversion rate of isoflavoues aglycone could reached 13.33 mg/g，72.23%.

frying；enzymatic；isoflavoues aglycone；response surface

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0254-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.043

2015－05－26

李笑梅（1960-），女，大學(xué)本科，教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：lixm0451@163.com。

黑龍江省科技廳應(yīng)用技術(shù)項(xiàng)目（G013B203）；黑龍江省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃項(xiàng)目（2010td04）。