鄒　娟,　姚　卓,　尚永華

(懷化學(xué)院生命科學(xué)系, 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 懷化　418000)

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柑橘炭疽病菌的生物學(xué)特性及枯草芽胞桿菌對(duì)其的抑制作用

鄒娟*,姚卓,尚永華

(懷化學(xué)院生命科學(xué)系, 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 懷化418000)

近5年來(lái),湖南麻陽(yáng)苗族自治縣的柑橘種植園發(fā)生柑橘炭疽病。采集發(fā)病柑橘植株,分離其病原菌,從病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)特征、內(nèi)轉(zhuǎn)錄區(qū)(ITS)序列分析和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系比較等方面對(duì)該病原菌進(jìn)行了鑒定,并探索了枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC 1.354對(duì)其的抑制作用。結(jié)果表明:該地區(qū)柑橘炭疽病菌為盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)?？莶菅堪麠U菌CGMCC 1.354對(duì)該病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用,其分泌的抑菌物質(zhì)能抑制柑橘炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)。

柑橘炭疽病;盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢;枯草芽胞桿菌;抗菌活性

湖南省麻陽(yáng)苗族自治縣是該省柑橘的主產(chǎn)縣,柑橘種植面積近1.3萬(wàn)hm2,年產(chǎn)量達(dá)30萬(wàn)t[1]。但是近5年來(lái)麻陽(yáng)的柑橘炭疽病頻繁發(fā)生并有加重的趨勢(shì)。柑橘感染炭疽病后枝干、樹葉和果實(shí)表面出現(xiàn)褐斑,易導(dǎo)致柑橘落葉、樹干空洞和儲(chǔ)藏期果實(shí)腐爛,直接影響果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收益。據(jù)報(bào)道,廣東省德慶縣的名優(yōu)柑橘品種和德慶貢柑大面積暴發(fā)過炭疽病,發(fā)病面積近 500 hm2,果園損失達(dá)2 000萬(wàn)元以上,給當(dāng)?shù)剞r(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。柑橘炭疽病又稱褐斑病,病原菌為寄生真菌,該病菌在病樹干或樹皮上越冬,來(lái)年春季環(huán)境適宜時(shí),尤其是陰雨潮濕時(shí),病菌借風(fēng)、雨、露水和昆蟲等傳播到嫩梢、新葉和幼果上。在有傷口(凍傷、灼傷、其他傷口)或樹勢(shì)生長(zhǎng)衰弱時(shí),該病菌即可萌發(fā)侵入,形成柑橘樹干、樹葉和果實(shí)的炭疽病,而潛伏在果實(shí)中的病原菌在貯藏期易引發(fā)柑橘褐斑腐爛。

目前柑橘炭疽病的防治以化學(xué)藥劑為主[3-4],但農(nóng)藥在果實(shí)中的殘留對(duì)人類健康存在潛在威脅,已成為全社會(huì)關(guān)注的問題。此外,殺菌劑的連續(xù)使用,可導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性,使化學(xué)防治效果降低[5]。因此,在柑橘病害防治中,迫切需要尋找安全有效的防病新技術(shù),以無(wú)毒高效的生物防治逐步取代化學(xué)殺菌劑。近年來(lái),利用環(huán)境友好的生防菌防治植物真菌病害是國(guó)內(nèi)外比較活躍的研究領(lǐng)域之一。生防枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC 1.354已廣泛應(yīng)用于微生物肥料和養(yǎng)殖水體凈化[6],本研究首次發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)柑橘炭疽病菌具有良好的拮抗性能。本文探討了柑橘炭疽病菌的生物學(xué)特性和枯草芽胞桿菌CGMCC 1.354對(duì)柑橘炭疽病菌的拮抗性能,為柑橘炭疽病菌的生物防治以及枯草芽胞桿菌CGMCC 1.354對(duì)柑橘炭疽病菌的生防價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

供試菌株為枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)CGMCC1.354,購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(北京)。

于湖南省懷化市麻陽(yáng)苗族自治縣的柑橘種植園中,從發(fā)病的‘冰糖橙’、‘臍橙’、‘椪柑’采集果實(shí)、枝莖、葉片。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA):取新鮮去皮馬鈴薯200 g置1 000 mL蒸餾水中煮沸30 min,紗布過濾。在濾液中加20 g瓊脂,加熱使瓊脂完全溶化后用紗布過濾。濾液加20.0 g蔗糖完全溶解后,補(bǔ)足蒸餾水至1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(BP):牛肉浸膏3.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 5.0 g/L,瓊脂20.0 g/L,pH 7.4～7.6。

LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10.0 g/L,酵母提取物 5.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,瓊脂20.0 g/L,pH 7.0～7.2。

1.2病原真菌的分離

1.2.1病原真菌分離與致病性鑒定

將采集到的發(fā)病柑橘植株如‘冰糖橙’、‘臍橙’、‘椪柑’的果實(shí)、枝莖、葉片用流水清洗樣品表面的泥土渣漬,晾干水分。無(wú)菌條件下將試驗(yàn)材料放入75%乙醇中浸泡3 min,無(wú)菌水沖洗4～5次,再放入0.1%升汞溶液中浸泡1 min,無(wú)菌水沖洗4～5次,瀝去多余水分。將處理過的樣品病害處剪成小塊,保留3 mm×3 mm的薄片,切去兩端組織,接種于PSA培養(yǎng)基中,使部分組織嵌在培養(yǎng)基中,充分與培養(yǎng)基接觸,放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。每日觀察材料,待材料切口處長(zhǎng)出菌絲后,及時(shí)挑取前端菌絲,轉(zhuǎn)接至新鮮的PSA培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

表面消毒效果的檢查:將表面消毒的最后一遍清洗用過的無(wú)菌水按 0.1 mL/皿涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上37℃下培養(yǎng)2 d后無(wú)菌落長(zhǎng)出,表明表面消毒徹底,已消除了樣品表面的附生菌。

對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離得到的病原真菌的純培養(yǎng)物按照柯赫氏法則進(jìn)行致病性鑒定,鑒定采用針刺接種法。將蘸有各菌株菌懸液的海綿置于培養(yǎng)皿中,將待接種的新生嫩葉置于海綿上,用針刺使葉片產(chǎn)生傷口,接種后用透明塑料袋保濕4 d,觀察是否產(chǎn)生典型的癥狀,并從表現(xiàn)癥狀的葉片上再分離培養(yǎng)病菌,以鑒定是否與原接種菌一致[7]。

1.2.2平板對(duì)峙檢測(cè)

按李小俊的方法[8],在直徑90 mm的LB平板中心接種已活化的直徑8 mm大小的炭疽病菌菌餅,在LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿底部用記號(hào)筆垂直對(duì)稱分為4個(gè)區(qū)域,然后將供試枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)菌株CGMCC 1.354接種于十字方向相同距離處,此為處理組,以僅接種炭疽病菌菌餅的LB平板為對(duì)照組,每組處理3個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)5 d。用十字交叉法測(cè)量炭疽病菌菌落直徑大小,按下列公式計(jì)算供試枯草芽胞桿菌菌株CGMCC 1.354的抗菌活性:

抗菌活性(%)=[(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)-(處理組菌落直徑-菌餅直徑)]/(對(duì)照組菌落直徑-菌餅直徑)×100。

1.3病原真菌的鑒定

1.3.1病原真菌形態(tài)學(xué)鑒定

剪邊長(zhǎng)約2 cm的玻璃紙,經(jīng)滅菌后貼于培養(yǎng)基上,在培養(yǎng)基中央接種病原菌,于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后取玻璃紙于顯微鏡下觀察菌絲體及孢子形態(tài)與著生方式。

1.3.2分子生物學(xué)鑒定

病原真菌ITS區(qū)段通用引物的擴(kuò)增與序列分析:采用玻璃紙PSA平板培養(yǎng)法收集病原真菌菌絲體,采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(生工生物工程上海有限公司),按照使用說明書提取其基因組DNA,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。選用真菌ITS擴(kuò)增的通用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC),對(duì)病原菌菌株進(jìn)行ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增。 反應(yīng)在 25 μL體系中進(jìn)行,包括: 1 μL dNTPs (2.5 mmol/L),0.2 μLTaq酶(5 U/μL),2.5 μL 10×PCR buffer,0.5 μL primer ITS1(10 μmol/L), 0.5 μL primer ITS4 (10 μmol/L),0.5 μL(約20 ng/μL)基因組 DNA,加 ddH2O至 25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;進(jìn)入循環(huán):94℃變性 45 s,55℃退火45 s,72℃延伸 1 min,30 個(gè)循環(huán);72℃延伸 10 min,4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,進(jìn)行 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。于凝膠成像系統(tǒng)顯影,利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物,測(cè)序工作由生工生物工程(上海)有限公司完成。

測(cè)序后的ITS區(qū)的擴(kuò)增序列用Clustal X程序進(jìn)行 rDNA 序列比對(duì),將本研究菌株的 DNA 序列與GenBank 中刺盤孢的 ITS 序列進(jìn)行同源性比較。然后用鄰位加入法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,系統(tǒng)進(jìn)化樹的測(cè)試方法為bootstrap method,重復(fù)次數(shù)為1 000,模型為kimura 2-parameter,其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。

病原真菌ITS區(qū)段特異性引物的擴(kuò)增:分別用盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(C.gloeosporioides)特異性引物CgInt:5′-GGCCTCCCGCCTCCGGGCGG-3′/ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′和尖孢炭疽菌(C.acutatum)的特異性引物CaInt2:5′-GGGGAAGCCTCTCGCGG-3′/ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′對(duì)供試菌株基因組DNA進(jìn)行PCR特異性擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL,除引物外其余各組分與其ITS區(qū)段通用引物擴(kuò)增的體系相同。擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;進(jìn)入循環(huán),94℃變性 45 s,55℃退火 75 s (CgInt/ITS4)或64℃退火60 s (CaInt2/ITS4),72℃延伸 1 min,30 個(gè)循環(huán);72℃延伸 10 min,4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后,取 5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物,用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),并在凝膠成像系統(tǒng)中分析特異性產(chǎn)物片段的大小。

1.4枯草芽胞桿菌菌株CGMCC 1.354抑菌物質(zhì)的分離與抑菌特性

1.4.1枯草芽胞桿菌菌株CGMCC 1.354抑菌物質(zhì)的發(fā)酵與提取

將枯草芽胞桿菌菌株CGMCC 1.354接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,30℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)36 h,8 000 r/min離心20 min,取上清液,重復(fù)離心2次,用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌獲得無(wú)菌濾液。將無(wú)菌濾液涂布在LB培養(yǎng)平板上,檢測(cè)有無(wú)活菌體。用3倍體積95%乙醇沉淀上清,4℃靜止過夜。8 000 r/min離心20 min收集沉淀,用75%乙醇洗滌沉淀,并溶于1 mol/L NaCl溶液中。再用95%乙醇抽提2次后溶解于1 mol/L NaCl溶液中。采用HP20大孔樹脂提取抑菌物質(zhì)。將預(yù)處理好的樹脂用玻璃棒引流裝柱,并使柱中無(wú)氣泡,用玻璃棒引流粗提液至柱中,靜置吸附2 h,用蒸餾水洗去雜質(zhì)后用40%乙醇洗脫,并收集洗脫液。洗脫液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至1/5體積,再真空冷凍干燥獲得抑菌物質(zhì),編為BAL-1,備用。

1.4.2BAL-1對(duì)炭疽病菌的抑制作用

采用菌落直徑法,將凍干后的抑菌物質(zhì)BAL-1配制成1.0 g/L溶液分別稀釋至1、1.25、1.67和2.5倍,然后按1∶3與冷卻至50℃左右的PSA培養(yǎng)基混合制成平板,抗菌活性物終濃度分別為0.25、0.192、0.15和0.1 g/L,冷卻后取直徑8 mm的炭疽病菌菌餅置入平板中央,以蒸餾水代替抑菌物質(zhì)的PSA培養(yǎng)平板作對(duì)照,設(shè)3次重復(fù),28℃培養(yǎng)5 d后,檢測(cè)各處理菌落增長(zhǎng)直徑,計(jì)算抗菌活性,并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.4.3BAL-1的初步鑒定

脂類的鑒定采用蘇丹Ⅲ染色法[9],稱取蘇丹Ⅲ干粉0.1 g加入10 mL 95%乙醇過濾后再加入10 mL甘油,制成蘇丹Ⅲ染液。加1滴1%(W/V)的抑菌物質(zhì)BAL-1在載玻片上,加入2～3滴蘇丹Ⅲ染液,染色2 min后在顯微鏡高倍鏡下觀察液滴中是否有橘黃色顆粒出現(xiàn),若有,則含有脂類物質(zhì)。蛋白質(zhì)鑒定采用雙縮脲法[10],在試管中加入1.0 g/L的抑菌物質(zhì)5 mL,0.1 g/mL NaOH 1 mL,振蕩均勻后加入0.01 g/mL CuSO4溶液2～3滴,放置10 min后觀察試管中是否有紫紅色產(chǎn)物出現(xiàn),若有則含蛋白質(zhì)。糖類物質(zhì)鑒定采用菲林試劑法[11],在試管中加入1.0 g/L的抑菌物質(zhì)BAL-1 20 mL,加6 mol/L的HCl 10 mL,沸水浴回流水解6 h,冷卻后加入菲林試劑并放入盛有50～65℃水浴2 min,觀察結(jié)果,若試管中出現(xiàn)磚紅色沉淀,則含有糖類。

1.4.4溫度、pH和金屬離子對(duì)BAL-1的抗菌活性的影響

溫度對(duì)BAL-1抗菌活性的影響:將1.0 g/L的抑菌物質(zhì)裝入6個(gè)無(wú)菌50 mL三角瓶中,分別置于20、40、60、80、100、121℃下處理30 min,然后按1∶3與冷卻至50℃ 左右的PSA培養(yǎng)基混合制成平板,冷卻凝固后,接種直徑8.0 mm的炭疽病菌菌餅于平板中央,以加蒸餾水代替抑菌物質(zhì)的平板作對(duì)照,計(jì)算抗菌活性。

pH對(duì)BAL-1抗菌活性的影響:將1.0 g/L的抑菌物質(zhì)調(diào)節(jié)pH至3.0、5.0、7.0、9.0、11.0后置4℃下靜置8 h,再將其pH調(diào)回7.0,然后按1∶3與冷卻至50℃左右PDA培養(yǎng)基混合制成平板,冷卻凝固后,接種直徑8.0 mm的炭疽病菌菌餅于平板中央,以加蒸餾水代替抑菌物質(zhì)的平板作對(duì)照,計(jì)算抗菌活性。

金屬離子對(duì)BAL-1抗菌活性的影響:將滅菌干燥后的NaCl(Na+)、MgCl2(Mg2+)、KCl (K+)、CaCl2(Ca2+)、ZnCl2(Zn2+)和FeCl3(Fe3+)分別溶解于1.0 g/L的抑菌物質(zhì)溶液中,至金屬離子濃度為0.05 mol/L。然后按1∶3與冷卻至50℃左右 PDA培養(yǎng)基混合制成平板,金屬離子終濃度為0.012 5 mol/L。冷卻凝固后,接種直徑8.0 mm的炭疽病菌菌餅于平板中央,以加蒸餾水代替抑菌物質(zhì)的平板作對(duì)照,計(jì)算抗菌活性。

2　結(jié)果與分析

2.1柑橘炭疽病菌的分離鑒定

將從柑橘莖、葉、果實(shí)炭疽病病斑處分離到的供試菌株接種至健康柑橘嫩葉的帶傷表皮上,室溫下保濕4 d,接種后柑橘嫩葉出現(xiàn)了與炭疽病相似的病斑,重新分離獲得了與供試菌株形態(tài)相同的菌落,因而證實(shí)了供試菌株對(duì)柑橘的致病性,并將該菌株編號(hào)為spb1。spb1菌株在PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快,7 d可長(zhǎng)滿直徑90 mm的培養(yǎng)皿。菌落圓形,氣生菌絲呈白色,絨狀,茂密,后期菌絲顏色逐漸變深呈灰褐色,培養(yǎng)皿背面呈黑褐色(圖1a);分生孢子黏孢團(tuán)呈灰褐色,剛毛少,直立,分生孢子梗短小,基部淡褐色,有分枝,梗無(wú)隔膜;分生孢子無(wú)色,單胞,圓柱形,頂端鈍,基部稍尖,(12～18)μm×(4～6)μm;(圖1b);附著胞扁球形,褐色,大小(6～15)μm×(4～9)μm。這些形態(tài)特征與陸家云[12]和王震等[13]描述的盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(C.gloeosporioides)的形態(tài)特征吻合。

用引物ITS1和ITS4對(duì)病原真菌rDNA的ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增,獲得長(zhǎng)約為600 bp的DNA片段,序列經(jīng)過Clustal X比較排列后,提交到GenBank 中,獲得序列登錄號(hào)為KP036394。登陸NCBI(http:∥www.ncbi. nlm.nih.gov/),將該序列與核酸數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì),顯示該病原真菌與GenBank中已登錄的盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(C.gloeosporioides) 序列的同源性均在 99%以上。利用MEGA4.1 軟件的NJ(neighbor-joining)聚類分析法,構(gòu)建了該病原菌株與王震等[13]報(bào)道的同源性在99%以上10個(gè)柑橘炭疽病菌(其在GenBank序列登錄號(hào)分別為:GU108948、GU108949、GU108950、GU108951、GU108952、GU108953、GU108954、GU108955、GU108956 和GU108957)和3 個(gè)柑橘花后落果病菌(C.acutatum) 菌株(序列登錄號(hào):AF090853、FJ972610、GU059863)的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2),結(jié)果表明，spb1菌株與已報(bào)道的上述10株柑橘炭疽病菌以100%的相似度聚類在一起,而3個(gè)柑橘花后落果病菌則以較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系處于系統(tǒng)發(fā)育樹的外圍。ITS 區(qū)段的特異性引物檢測(cè)結(jié)果表明,C.gloeosporioides的特異性引物CgInt/ITS4能從spb1菌株的基因組 DNA中擴(kuò)增出約為500 bp的特異性條帶, 而用尖刺盤孢(C.acutatum)特異性引物CaInt2/ITS4未能擴(kuò)增出相應(yīng)的 DNA 條帶(圖3)。綜合以上證據(jù),表明本研究的病原真菌spb1菌株屬于盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(Colletotrichumgloeosporioides)。

圖1　柑橘炭疽病菌spb1菌株的菌落和分生孢子形態(tài)Fig.1　Colonies and conidia of strain spb1 causing citrus anthracnose

2.2平板對(duì)峙檢測(cè)

平板對(duì)峙試驗(yàn)表明，枯草芽胞桿菌CGMCC 1.354對(duì)柑橘炭疽病菌spb1菌株具有明顯的拮抗作用。該細(xì)菌除了產(chǎn)生明顯的抑菌帶外,對(duì)病菌菌落生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,表現(xiàn)在菌落邊緣和抑菌帶接觸部位的菌絲生長(zhǎng)緩慢,而正常生長(zhǎng)的菌落鋪展平板呈圓形擴(kuò)展。鏡檢發(fā)現(xiàn)受抑制的病菌菌絲頂端、中部等部位膨大呈泡狀, 部分前端膨脹泡破裂、消解,內(nèi)含物外溢,菌絲因枯草芽胞桿菌的致畸作用而停止生長(zhǎng)(圖4)。觀察發(fā)現(xiàn)炭疽病菌的孢子雖能萌發(fā),但萌發(fā)產(chǎn)生的芽管粗短、扭曲、畸形,不能進(jìn)一步生長(zhǎng)為菌絲體。

圖2　NJ法構(gòu)建的基于菌株spb1(KP036394)和柑橘其他刺盤孢ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2　The phylogenetic dendrogram of the strain spb1 (KP036394) and other strains of Collectotrichum spp. constructed by using neighbor-joining (NJ) method based on the ITS sequences

圖3　特異性引物CgInt/ITS4對(duì)spb1菌株的PCR擴(kuò)增Fig.3　PCR amplification results of strain spb1 using specific primer pair of CgInt/ITS4

2.3抑菌物質(zhì)BAL-1的初步鑒定與抑菌性能

2.3.1抑菌物質(zhì)BAL-1的鑒定

200～400 nm紫外掃描(圖5)顯示抑菌物質(zhì)BAL-1在220 nm左右和270 nm左右有較大的吸收峰,表明BAL-1可能含蛋白類物質(zhì)。雙縮脲反應(yīng)呈紫色,進(jìn)一步證實(shí)BAL-1中含有蛋白質(zhì)類物質(zhì)。斐林試劑法有磚紅色的沉淀生成,證明該抑菌水解物含還原糖類。蘇丹Ⅲ染色未發(fā)現(xiàn)橘黃色顆粒出現(xiàn),初步判斷該BAL-1無(wú)脂類物質(zhì)。

2.3.2溫度、pH和金屬離子對(duì)BAL-1的抗菌活性的影響

抑菌物質(zhì)BAL-1濃度對(duì)柑橘炭疽病菌spb1菌絲生長(zhǎng)的影響見表1。由表1可知,同一BAL-1濃度下,炭疽病菌菌絲的生長(zhǎng)直徑數(shù)值波動(dòng)較小,數(shù)值穩(wěn)定,具有統(tǒng)計(jì)分析意義。在5個(gè)BAL-1梯度濃度處理下,當(dāng)BAL-1濃度低于0.15 g/L時(shí),抗菌活性差異不顯著,BAL-1濃度為0.192和0.25 g/L時(shí)的抗菌活性有明顯差異,且當(dāng)BAL-1濃度達(dá)0.25 g/L時(shí),抗菌活性最高(71.96%)?？傮w看來(lái),BAL-1對(duì)柑橘炭疽病菌spb1菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用,且隨BAL-1濃度的增大抑制作用增強(qiáng)。

表1　BAL-1濃度對(duì)抗菌活性的影響1)Table 1　Effects of BAL-1 concentration on antagonistic activity

1) 表中“增長(zhǎng)直徑”數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,數(shù)據(jù)后標(biāo)有不同小寫字母表示經(jīng)多重比較后差異顯著(P<0.05),不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Data of increased diameter are mean±SE; different lowercase and uppercase letters indicate significant difference at the 0.05 level and extremely significant difference at the 0.01 level, by multiple range test.

圖4　柑橘炭疽病菌的菌落、菌絲和孢子形態(tài)Fig.4　Colonies, mycelia and conidia of Collectotrichum gloeosporioides spb1

圖5　BAL-1在200～400 nm下的吸光值Fig.5　200-400 nm light absorption value of BAL-1

從圖6可知,在經(jīng)60℃以下溫度處理30 min后,BAL-1對(duì)柑橘炭疽病菌spb1菌絲生長(zhǎng)的抑制作用隨溫度的升高而增強(qiáng),當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí),抗菌活性達(dá)到峰值(86.3%),其后隨溫度的進(jìn)一步升高抗菌活性顯著下降,當(dāng)溫度達(dá)到121℃時(shí),幾乎喪失抗菌活性。這可能是由于BAL-1含有多糖骨架,因而具備一定高溫耐受性,即在60℃以下都具有良好的抗菌活性;同時(shí)因其BAL-1中含有蛋白,過高溫度使蛋白質(zhì)變性而導(dǎo)致BAL-1活性喪失。溫度對(duì)BAL-1抗菌活性的影響進(jìn)一步驗(yàn)證了BAL-1中含有糖蛋白。類似情況常見于溫度對(duì)枯草芽胞桿菌所產(chǎn)抗菌蛋白活性影響的研究中[14-15]。

BAL-1在pH為7.0時(shí)抗菌活性最強(qiáng)(89.8%),酸性或者堿性條件都不利于其對(duì)柑橘炭疽病菌(C.gloeosporioides)spb1的抑制作用,在pH低于6或者高于8時(shí),BAL-1對(duì)柑橘炭疽病菌的抑制作用都顯著下降至65%以下,當(dāng)pH低于5或者高于9時(shí)幾乎喪失抗菌活性。由此表明:在偏酸和偏堿條件下,BAL-1易變性失活。這可能是由于BAL-1中的蛋白在較高濃度的H+或OH-條件下空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而失去對(duì)柑橘炭疽病菌spb1抗菌活性。在抗菌蛋白類的研究中已有類似報(bào)道[15-17]。

圖6　溫度和pH對(duì)BAL-1抗菌活性的影響Fig.6　Effects of temperature and pH on the antagonistic activity of BAL-1

圖7　金屬離子對(duì)BAL-1抗菌活性的影響Fig.7　Effects of metal ions on the antagonistic activity of BAL-1

金屬離子對(duì)BAL-1抗菌活性的影響如圖7所示。Na+和Mg2+能提高BAL-1對(duì)柑橘炭疽病菌spb1的抑制作用,K+對(duì)該BAL-1活性影響不明顯。而Ca2+、Zn2+、Fe3+的存在會(huì)降低BAL-1對(duì)柑橘炭疽病菌spb1抑制作用。因此在生防過程中可適當(dāng)?shù)卦黾逾c鹽和鎂鹽來(lái)提高菌劑對(duì)柑橘炭疽病菌的防控能力。

3　討論

湖南麻陽(yáng)苗族自治縣的柑橘炭疽病是由病原菌盤長(zhǎng)孢狀刺盤孢(C.gloeosporioides)所引起的,病原菌通過菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管侵入寄主導(dǎo)致發(fā)病?？莶菅堪麠U菌CGMCC 1.354已廣泛應(yīng)用于微生物肥料和養(yǎng)殖水體凈化[6]。本研究首次發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)柑橘炭疽病菌(C.gloeosporioides)的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用,其分泌的抑菌物質(zhì)能抑制病原菌C.gloeosporioides菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā),并使部分孢子萌發(fā)畸形,可減弱C.gloeosporioides對(duì)柑橘的侵染能力, 起到較好的防控作用?？莶菅堪麠U菌CGMCC 1.354的抗菌粗提物經(jīng)鑒定含有糖蛋白,其抗菌活性在pH為7.0時(shí)最高;溫度在60℃以下時(shí),均具有良好的抗菌活性,但過高的溫度易使其抗菌活性降低甚至失活;Na+和Mg2+可以明顯增強(qiáng)其抗菌活性,而Ca2+、Zn2+和Fe3+會(huì)抑制抑菌物質(zhì)的活性。因此枯草芽胞桿菌CGMCC 1.354不僅可應(yīng)用于微生物肥料還能通過添加一定濃度的鈉鹽和鎂鹽來(lái)提高菌劑對(duì)柑橘炭疽病菌的防控能力,且抑菌物質(zhì)在pH 6～8范圍內(nèi)均具良好的抗菌活性并對(duì)高溫具較好的耐受能力,不需低溫保存,便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸,具潛在的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。但如果要應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐, 還需進(jìn)一步的活體試驗(yàn)和深入研究,分析該枯草芽胞桿菌在柑橘植株上的生存能力,觀察該菌株對(duì)柑橘植株的影響和活體條件下對(duì)柑橘炭疽病菌的抗菌效果,才能保證其防效。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Biological characteristics of citrus pathogenColletotrichumgloeosporioidesand the inhibitory effect ofBacillussubtilison the fungus

Zou Juan,Yao Zhuo,Shang Yonghua

(Key Laboratory of Research and Utilization of Ethnomedicinal Plant Resources of Hunan Province,Department of Life Sciences, Huaihua University, Huaihua418000, China)

Anthracnose on citrus has occurred in Mayang Miao Autonomous County, Hunan Province in the recent five years. The pathogen causing citrus anthracnose was isolated from citrus orchards of Mayang Miao Autonomous County. Based on cultural and morphological characteristics, ribosomal DNA (rDNA) internal transcribed spacer (ITS) sequence analysis and phylogenetic relationships with other species ofColletotrichum, the pathogen was identified asColletotrichumgloeosporioides.BacillussubtilisCGMCC 1.354 showed strong antagonistic activity against the pathogen, and the antifungal substance produced byB.subtilisCGMCC 1.354 strongly inhibited the hyphal growth and spore germination ofC.gloeosporioides.

citrus anthracnose;Colletotrichumgloeosporioides;Bacillussubtilis;antagonistic activity

2014-11-25

2015-02-02

湖南省重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(201142)；懷化學(xué)院科研項(xiàng)目(HHUY2014-03)；湖南省教育廳科研項(xiàng)目(11C0988)

E-mail:zoujuantone@163.com

S 436.661.14

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.01.011