江　帆,　劉凱強(qiáng),　張?zhí)鞚?　白樹(shù)雄,　王振營(yíng),　何康來(lái)

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京　100193)

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轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)耐除草劑(Cry1Ac+EPSPS)玉米對(duì)草甘膦耐受性研究

江帆,劉凱強(qiáng),張?zhí)鞚?白樹(shù)雄,王振營(yíng),何康來(lái)*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京100193)

將具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗蟲(chóng)、耐除草劑基因轉(zhuǎn)化到玉米中獲得兼具抗蟲(chóng)和耐除草劑的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米,實(shí)現(xiàn)了玉米復(fù)雜性狀的有效改良,研究了轉(zhuǎn)耐除草劑CC-2基因和可表達(dá)Bt毒素的cry1Ac基因的雙抗玉米對(duì)除草劑的耐受性及目標(biāo)蛋白表達(dá)量。通過(guò)調(diào)查噴施除草劑后玉米植株存活率及株高和生長(zhǎng)發(fā)育情況,研究了轉(zhuǎn)抗蟲(chóng)耐除草劑基因玉米‘CC-2×BT799’、抗蟲(chóng)玉米‘BT799’、耐除草劑玉米‘CC-2’,以及常規(guī)玉米‘鄭58’在田間對(duì)除草劑的耐受性,并用ELISA測(cè)定了供試品種中CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白含量。對(duì)草甘膦的耐受性試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)復(fù)合基因玉米‘CC-2×BT799’與單抗草甘膦品種‘CC-2’對(duì)草甘膦均具有良好的耐受性。心葉期噴施草甘膦推薦施用劑量中量和2倍劑量對(duì)其株高和后期生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。ELISA檢測(cè)顯示,CP4 EPSPS蛋白在雄穗中的表達(dá)量較葉片稍高。且雙抗品種‘CC-2×BT799’較‘CC-2’中的CP4 EPSPS蛋白含量稍高。在雄穗中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量與‘CC-2×BT799’相當(dāng)。在葉片中,‘BT799’的Cry1Ac蛋白含量約為‘CC-2×BT799’的2倍。抗蟲(chóng)耐除草劑玉米能夠有效抵御草甘膦的噴施,Cry1Ac蛋白含量在不同品種不同組織中存在差異。

抗蟲(chóng)耐除草劑玉米;存活率;耐受性;ELISA

玉米是我國(guó)種植面積居首的重要的糧、飼和能源作物。蟲(chóng)害和雜草是危害玉米生產(chǎn)的兩大重要生物災(zāi)害因素[1-2]。雖然傳統(tǒng)的玉米害蟲(chóng)防治技術(shù)和除草方法可取得良好的防治效果[3-4],但由于存在操作復(fù)雜、不易實(shí)施、成本高或費(fèi)工費(fèi)時(shí)等缺點(diǎn),生產(chǎn)上推廣應(yīng)用和實(shí)際效果都受到一定影響。作為現(xiàn)代生物技術(shù)的成果,轉(zhuǎn)基因作物為玉米田除草和害蟲(chóng)防治開(kāi)辟了新的途徑。自1996年具有抗蟲(chóng)或耐除草劑單一性狀的轉(zhuǎn)基因玉米在北美商業(yè)化種植以來(lái),全球種植轉(zhuǎn)基因玉米的國(guó)家迅速增加,現(xiàn)已達(dá)到17個(gè),轉(zhuǎn)基因玉米的種植面積占全球玉米種植面積的32%。2013年,菲律賓有將近40萬(wàn)農(nóng)民從轉(zhuǎn)基因玉米種植中獲益[5]。隨著單一抗蟲(chóng)或耐除草劑性狀轉(zhuǎn)基因玉米在生產(chǎn)上成功應(yīng)用,兼具抗蟲(chóng)和耐除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米相繼在2001年用于生產(chǎn),且種植面積迅速增長(zhǎng),到2007年種植抗蟲(chóng)和耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米的面積已超過(guò)轉(zhuǎn)單一性狀基因玉米的種植面積。2009年,陶氏益農(nóng)公司研發(fā)了含有8個(gè)基因(pat、cp4epsps、cry1Fa2、cry1A.105、cry2Ab、cry3Bb1、cry34Ab1、cry35Ab1)的兼抗多種害蟲(chóng)和耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米,該品種一方面可以防治鱗翅目和鞘翅目的害蟲(chóng),另一方面對(duì)含草甘膦和草銨膦的除草劑有很好的耐受性[6]。目前,抗蟲(chóng)和抗除草劑的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米(包括BT/HTBT/BTBT/BT/HT 3種復(fù)合)種植面積達(dá)到3 730萬(wàn)hm2,共有9個(gè)國(guó)家種植[7]。種植復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米保護(hù)玉米免受蟲(chóng)害,并促進(jìn)田間雜草化學(xué)防除。

玉米螟是我國(guó)玉米上的主要害蟲(chóng)。國(guó)外轉(zhuǎn)Bt基因玉米對(duì)亞洲玉米螟(Ostriniafurnacalis)和歐洲玉米螟(O.nubilalis)等鱗翅目害蟲(chóng)具有良好的防治效果[7-10]。近年來(lái),已有國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)Bt基因玉米防治玉米螟效果的報(bào)道[4,11]。王月琴等[12]報(bào)道了通過(guò)傳統(tǒng)回交轉(zhuǎn)育方法將轉(zhuǎn)cry1Ac基因抗蟲(chóng)玉米‘BT799’和轉(zhuǎn)epsps基因耐草甘膦(glyphosate)玉米‘CC-2’的2個(gè)基因?qū)氲焦歉勺越幌怠?8’中,獲得具有抗玉米螟和耐草甘膦的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米品系。

本研究以具有抗蟲(chóng)、耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米‘CC-2×BT799’為研究對(duì)象,從目標(biāo)蛋白表達(dá)量、目標(biāo)性狀的表達(dá)方面將其與單性狀轉(zhuǎn)基因玉米品系‘CC-2’及常規(guī)玉米進(jìn)行了比較研究。

1　材料與方法

1.1供試轉(zhuǎn)基因玉米

試驗(yàn)所用玉米品系包括表達(dá)mCry1Ac基因的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米‘BT799’,表達(dá)maroACC基因的轉(zhuǎn)基因耐除草劑玉米‘CC-2’和具有抗蟲(chóng)、耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米‘CC-2×BT799’,以及受體對(duì)照玉米‘鄭58’,均由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米中心提供?！瓸T799’和‘CC-2’轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化受體為HiIIA×HiIIB,后期以‘鄭58’為輪回親本進(jìn)行回交,本試驗(yàn)所使用的抗蟲(chóng)試驗(yàn)材料為‘BT799×鄭58 BC4F3’純合家系,耐除草劑試驗(yàn)材料為‘CC-2×鄭58BC4F2’分離群體,群體中陽(yáng)性植株占75%?？瓜x(chóng)、耐除草劑復(fù)合性狀材料為(‘CC-2×鄭58BC4F1’)×(‘BT799×鄭58 BC4F3’)分離群體,群體中抗蟲(chóng)陽(yáng)性植株為100%,耐除草劑陽(yáng)性植株為50%。供試玉米品系分別種植在河北省廊坊市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所科研中試基地和吉林省公主嶺市吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所試驗(yàn)基地。

1.2供試除草劑

41%草甘膦異丙胺鹽(glyphosate-isopropylammonium)水劑,由美國(guó)孟山都公司生產(chǎn)。

1.3CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白表達(dá)量測(cè)定

將田間待檢植株標(biāo)記、編號(hào),采集待測(cè)玉米組織立即放于液氮中。冷凍干燥后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。采用Agdia公司的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒測(cè)定。

1.4草甘膦耐受性試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)草甘膦濃度,0(清水對(duì)照)、3 000和6 000 mL/hm2,兌水525 L。用Agrolex新加坡利農(nóng)噴霧器,在玉米生長(zhǎng)至7～8葉期均勻噴施。噴施草甘膦前,記錄每小區(qū)的玉米植株數(shù)。在廊坊試驗(yàn)田分別于噴施后1周、2周和4周記錄各小區(qū)內(nèi)存活玉米植株數(shù)、藥害癥狀。于噴施草甘膦后第4周(播種后第62天)采用五點(diǎn)取樣法調(diào)查各小區(qū)存活的玉米株高15株。在公主嶺試驗(yàn)田于噴施后1周記錄各小區(qū)內(nèi)存活玉米植株數(shù)及藥害癥狀。

1.5試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析

除草劑試驗(yàn)小區(qū)面積24 m2,每個(gè)處理重復(fù)3次,小區(qū)間隔1.0 m。整個(gè)生育期不使用農(nóng)藥,抗螟性鑒定小區(qū)面積24 m2,每個(gè)處理重復(fù)3次。

對(duì)除草劑試驗(yàn)各處理存活植株數(shù)和株高,抗螟性鑒定各品系食葉級(jí)別、單株活蟲(chóng)數(shù)、單株蛀孔數(shù)和單株隧道長(zhǎng)度,各玉米品系蛋白表達(dá)量等的差異顯著性進(jìn)行方差分析。平均數(shù)比較采用Duncan’s測(cè)驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算采用SAS分析軟件進(jìn)行。

2　結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)基因玉米CP4 EPSPS和Cry1Ac蛋白表達(dá)量

在轉(zhuǎn)CP4 EPSPS基因耐除草劑玉米品系‘CC-2’中均能檢測(cè)出CP4 EPSPS蛋白表達(dá)。抗蟲(chóng)耐除草劑復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米品系‘CC-2×BT799’的CP4 EPSPS蛋白在葉片中檢出率為37.5%,在雄穗中的檢出率為50.0%?！瓹C-2’與‘CC-2×BT799’ 葉片中CP4 EPSPS蛋白的平均含量分別為35.42 μg/g(蛋白/組織干重)和49.85 μg/g,雄穗中平均為44.54 μg/g和58.63 μg/g(圖1)。

圖1　轉(zhuǎn)基因玉米不同部位中CP4 EPSPS蛋白的表達(dá)量Fig.1　Expression levels of CP4 EPSPS in different part of transgenic corn

在雄穗中,‘BT799’的Cry1Ac含量與‘CC-2×BT799’相當(dāng),分別為581.06 ng/g和585.23 ng/g。在葉片中,‘BT799’的Cry1Ac含量約為‘CC-2XBT799’的2倍,分別為1 146.82 ng/g和501.65 ng/g(圖2)。

在玉米組織中,CP4 EPSPS與Cry1Ac蛋白的含量比約為5∶1～7∶1之間。

2.2轉(zhuǎn)基因玉米對(duì)草甘膦的耐受程度

在廊坊和公主嶺實(shí)驗(yàn)基地,噴施草甘膦1周后,常規(guī)玉米品系‘鄭58’和轉(zhuǎn)單基因抗蟲(chóng)玉米品系‘BT799’

植株開(kāi)始出現(xiàn)葉片失綠、萎蔫、下部葉片變黃、生長(zhǎng)減緩甚至停滯等藥害癥狀,隨時(shí)間推移,藥害程度不斷加重,1周后絕大多數(shù)植株萎蔫、干枯直至死亡。2013年在廊坊種植的單抗草甘膦‘CC-2’在噴施草甘膦4周后,噴施正常劑量和2倍劑量的存活率分別為87.7%和86.5%以上(理論存活率75%)。雜交后未經(jīng)篩選的抗蟲(chóng)耐除草劑品種‘CC-2×BT7999’噴施除草劑正常劑量和2倍劑量的存活率分別為47.8%和43.8%,與理論存活率50%左右基本接近。存活的植株能正常生長(zhǎng)發(fā)育,沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的受害癥狀。2014年種植的單抗草甘膦‘CC-2’在噴施草甘膦正常劑量和2倍劑量4周后的存活率分別為74.4%和75.3%(表1,2)。

圖2　轉(zhuǎn)基因玉米不同部位中Cry1Ac的表達(dá)量Fig.2　Expression levels of Cry1Ac in different part of transgenic corn

噴施后第4周,噴施清水的4個(gè)玉米品系間株高無(wú)顯著差異,噴施草甘膦正常劑量和2倍劑量后,‘鄭58’和‘BT799’全部死亡,‘CC-2×BT799’和‘CC-2’間無(wú)顯著差異(表3)。

表1　噴施不同濃度草甘膦后轉(zhuǎn)基因玉米存活率1)Table 1　Survival rates of transgenic corn after spraying glyphosate at different concentrations

續(xù)表1Table 1(Continued)

品種Variety施藥劑量/mL·(667m2)-1Dosage玉米存活率/% Survivalrate廊坊(2013)Langfang公主嶺(2013)Gongzhuling1周后Oneweek2周后Twoweeks4周后Fourweeks1周后Oneweek鄭58400(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)cBT799(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)c(0.0±0.0)cCC-2(98.8±0.4)a(90.6±3.6)a(89.0±2.5)a(99.5±0.5)aCC-2×BT799(53.1±5.7)b(50.3±3.7)b(48.8±3.1)b(47.7±3.9)b

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同一施藥劑量下不同品種后面有不同字母者表示差異顯著P<0.05。

Data are mean±SE, The lowercase letters in the same list indicate significant difference (LSD test,P<0.05).

表2　2014年于廊坊試驗(yàn)田噴施不同濃度草甘膦4周后轉(zhuǎn)基因玉米存活率Table 2　Survival rates of transgenic corn four weeks after spraying glyphosate with different concentrations in Langfang, 2014

表3　噴施草甘膦4周后各玉米品系的株高1)Table 3　Plant heights of transgenic corn after spraying glyphosate with different concentrations

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。同一施藥劑量下不同品種后面有不同字母者表示差異顯著P<0.05。

Data are mean±SE; the lowercase letters in the same list indicate significant difference (LSD test,P<0.05).

3　討論

性狀復(fù)合有多種途徑[13]。然而,國(guó)際上已商業(yè)化應(yīng)用的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物大都是采用育種復(fù)合獲得的產(chǎn)品[5,14]。在一些國(guó)家,通過(guò)育種復(fù)合多個(gè)性狀的轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化在監(jiān)管上不需要再評(píng)估[15]。通過(guò)育種復(fù)合可獲得不同性狀如既抗蟲(chóng)又耐除草劑或抗不同種類的害蟲(chóng)或具有抗性治理功能的轉(zhuǎn)基因作物[16-18]。本研究選用的表達(dá)Cry1Ac抗蟲(chóng)和CP4 EPSPS耐除草劑的轉(zhuǎn)基因玉米是通過(guò)常規(guī)育種復(fù)合獲得的既抗蟲(chóng)又耐除草劑的玉米材料,既有良好的抗玉米螟性,又有良好的草甘膦耐受性。

本研究表明,CP4 EPSPS蛋白在雄穗中的表達(dá)較葉片稍高,且雙抗品種較‘CC-2’中的CP4 EPSPS蛋白含量稍高。在玉米組織中,CP4 EPSPS蛋白含量高達(dá)Bt蛋白的5倍。ELISA檢測(cè),雄穗中‘CC-2×BT799’‘的Cry1Ac含量與BT799’近似,在葉片中 ‘CC-2×BT799’‘的Cry1Ac含量只有‘BT799’的1/2,較王月琴等[12]報(bào)道的‘BT799’的葉片、花絲、苞葉和籽粒中的含量均低,介于BT-X、BT-181、BT-38、BT-105和BT-43這幾個(gè)轉(zhuǎn)化事件之間[11]。根據(jù)葉片中‘CC-2×BT799’的Cry1Ac含量與‘BT799’中含量的比例關(guān)系推測(cè),抗除草劑基因maroACC在一定程度上影響了Cry1Ac蛋白的表達(dá),這在前人的研究中未見(jiàn)報(bào)道。而‘BT799’、‘CC-2×BT799’在各器官中Bt蛋白的時(shí)空表達(dá)與‘MON810’和‘BT11’也存在差異[18],說(shuō)明不同品系的Bt蛋白時(shí)空表達(dá)存在差異,其抗蟲(chóng)效果也有不同。

‘BT799’田間抗螟性鑒定表明,‘CC-2×BT799’和‘BT799’在心葉期和花絲期玉米螟為害比常規(guī)種‘鄭58’和單耐除草劑品種‘CC-2’顯著降低,與已報(bào)道的轉(zhuǎn)cry1Ac基因玉米‘BT-X’結(jié)果一致,說(shuō)明‘CC-2×BT799’和‘BT799’均能有效防治亞洲玉米螟的一代和二代為害[12]。盡管雙抗品種葉片中的Cry1Ac含量比‘BT799’較低,但其也達(dá)到了良好的抗蟲(chóng)效果。但本試驗(yàn)結(jié)果也顯示,供試復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因玉米‘CC-2×BT799’和單抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米‘BT799’中的Cry1Ac蛋白含量與美國(guó)孟山都公司研發(fā)的第1代轉(zhuǎn)Bt基因玉米轉(zhuǎn)化事件MON810葉片中Cry1Ab蛋白的表達(dá)量還有一定差距[20]。

對(duì)草甘膦的耐受性試驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)復(fù)合基因玉米‘CC-2×BT799’與單耐草甘膦品種‘CC-2’對(duì)草甘膦均具有良好的耐受性。心葉期噴施草甘膦推薦劑量和2倍劑量對(duì)其株高和后期生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。與赫福霞報(bào)道的同樣具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)cry1Ah、cry1Ie和耐草甘膦基因2mG2-epsps的多價(jià)轉(zhuǎn)基因玉米結(jié)果相似[21]。金丹也篩選得到了11個(gè)T0代高表達(dá)單拷貝的轉(zhuǎn)CrylAbNJB殺蟲(chóng)蛋白基因和epsps抗草甘膦基因的抗蟲(chóng)耐除草劑玉米 ‘G3-NJB’株系[22]。這都是我國(guó)通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功培育的具有抗蟲(chóng)耐除草劑優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因玉米新品種,為加快推進(jìn)我國(guó)抗蟲(chóng)耐除草劑玉米的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程邁出重要一步。

本研究通過(guò)蛋白表達(dá)量的測(cè)定以及對(duì)草甘膦耐受性的檢測(cè)證明,供試品系‘CC-2×BT799’盡管在表達(dá)量上與‘CC-2’和‘BT799’存在一定差異,但該品系‘BT799’能高效表達(dá)Cry1Ac和CP4 EPSPS蛋白,且對(duì)草甘膦的耐受性良好,具有應(yīng)用和推廣價(jià)值。

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(責(zé)任編輯：田喆)

Tolerance of transgenic and herbicide-and insect-resistant corn to glyphosate

Jiang Fan,Liu Kaiqiang,Zhang Tiantao,Bai Shuxiong,Wang Zhenying,He Kanglai

(Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing100193, China)

Insect-resistantcry1Acgene and glyphosate-tolerant gene were used to construct an insect-resistant/glyphosate-tolerant bivalent plant which had been patented. It effectively improved complex traits in corn. This study mainly evaluated the tolerance of insect-resistant/glyphosate-tolerant bivalent corn and glyphosate-tolerant corn to glyphosate, and measured the quantity of Cry1Ac and CP4 EPSPS protein expressed in corn tissues, in order to provide the basis for the improvement and application of the maize varieties. Insect-resistant/glyphosate-tolerant bivalent corn ‘CC-2×BT799’, insect-resistant corn ‘BT799’, herbicide-resistant corn ‘CC-2’, and conventional corn ‘Zheng 58’ were compared by investigating the survival rates and heights of plants after spraying herbicides. Cry1Ac and CP4 EPSPS protein expression was measured by ELISA. ‘CC-2’ and ‘CC-2×BT799’ performed excellent tolerance to glyphosate after spraying glyphosate with recommended and double recommended rates at the whorl stage. ELISA detection showed that CP4 EPSPS protein expression in the tassel was slightly higher than in leaves. CP4 EPSPS protein expression in ‘CC-2×BT799’ was slightly higher than in ‘CC-2’. Cry1Ac protein expression in BT799 and ‘CC-2×BT799’ was nearly the same in the tassel. However, Cry1Ac protein expression in BT799 leaves was about 2 times of that in ‘CC-2×BT799’. Insect-resistant/glyphosate-tolerant corn showed strong resistance to glyphosate. Cry1Ac protein expression varied among the corn varieties and tissues.

insect-resistant/glyphosate-tolerant corn;survival rate;tolerance;ELISA

2015-02-25

2015-07-07

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)(2013ZX08003-001)

E-mail:klhe@ippcaas.cn

S 435.13, Q 78

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.012