王吉明，尚建立，李 娜，馬雙武，徐永陽(yáng)

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所 鄭州 450009）

DNA是遺傳物質(zhì)的重要信息載體，DNA提取的數(shù)量及質(zhì)量與PCR擴(kuò)增、限制性酶切、Southern雜交、測(cè)序等分子生物學(xué)研究密切相關(guān)[1]。在西瓜研究中通常從真葉中提取DNA[2-4]，以滿足SSR、SRAP等分子標(biāo)記的需求。西瓜種子是最常見和易獲得的樣品材料之一，但很少直接用于DNA提取，僅國(guó)外有從西瓜種子中提取DNA的報(bào)道[5]。在實(shí)際研究和工作中為了提高效率，可能需要對(duì)現(xiàn)有的特定類型西瓜樣品進(jìn)行DNA提取，如進(jìn)行種子純度分子標(biāo)記檢測(cè)時(shí)，若能從種子樣品中提取DNA，而不必播種育苗后從真葉提取DNA，可以縮短鑒定時(shí)間1周以上，對(duì)于快速實(shí)現(xiàn)種子純度檢測(cè)具有重要意義。為此筆者以西瓜種子、下胚軸、子葉、種芽（下胚軸+子葉）、新鮮真葉和干燥真葉6種不同類型樣品為試驗(yàn)材料，比較不同類型樣品的DNA提取數(shù)量和質(zhì)量，并對(duì)提取的DNA進(jìn)行dCAPS擴(kuò)增和酶切，判斷不同類型西瓜樣品中提取的DNA在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用價(jià)值，為合理利用西瓜樣品材料提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2016年3—7月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所進(jìn)行，以來(lái)自國(guó)家西瓜甜瓜中期庫(kù)的西瓜種質(zhì)資源父本‘14CB11’（感枯萎?。?、母本‘Sugarlee’（抗枯萎?。┘半s交F1為研究材料，種子經(jīng)過(guò)25℃清水浸種24 h后用棉布包裹，于32℃條件下恒溫催芽48 h，然后播種于營(yíng)養(yǎng)缽中育苗，取催芽前備份的單粒種子，以及催芽或育苗后的下胚軸、種芽（下胚軸+子葉）、子葉、新鮮真葉各0.05 g為材料，另取0.05 g新鮮真葉置于國(guó)家西瓜甜瓜中期庫(kù)種質(zhì)保存冷庫(kù)中（5℃，40%相對(duì)濕度）放置72 h后脫水為干燥真葉，一起用于DNA提取研究。

1.2 DNA提取

采用天根DNA提取試劑盒［由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)］進(jìn)行提取，提取方法參照天根DNA提取試劑盒操作說(shuō)明書的操作步驟并略加改進(jìn)，改進(jìn)地方為將操作步驟第4步的GP2替換為預(yù)冷的0.7倍體積異丙醇，以增加DNA析出產(chǎn)量。

1.3 DNA檢測(cè)

采用 Nano Drop 1000（Thermo Scientific）微量紫外分光光度計(jì)對(duì)提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)提取DNA的含量、OD260/280值和OD260/230值進(jìn)行測(cè)量和計(jì)算，同一類型樣品提取DNA的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算平均值。

1.4 dCAPS擴(kuò)增

采用2×Taq Master Mix（北京百泰客生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25μL，包括 2×Taq Master Mix 12.5μL，模板 DNA 2.0μL，10 μmol·μL-1上、下游混合引物 2.0 μL，ddH2O 8.5μL；擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存。

dCAPS引物為國(guó)內(nèi)公開發(fā)表的抗枯萎病生理小種1緊密連鎖的dCAPS標(biāo)記502124_fon[6]，該標(biāo)記引物信息如下：

上游引物序列為5′-AACACCACCCACTTTG?GAGCTTCG-3′，下游引物序列為 5′-TTTTAGGGT?GAAAATGGGTATTGTA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 dCAPS酶切

dCAPS產(chǎn)物采用內(nèi)切酶Taq I進(jìn)行酶切，酶切識(shí)別位點(diǎn)為 T’CGA，酶切體系為：10×Buffer 1.5 μL，限制內(nèi)切酶1.0μL；dCAPS擴(kuò)增產(chǎn)物5.0μL，ddH2O 7.5μL，總體系為15.0μL。酶切程序?yàn)椋?5℃條件下酶切16 h，80℃條件變性20 min，4℃保存，Taq I來(lái)自Fermentas公司。

1.6 電泳

擴(kuò)增/酶切產(chǎn)物采用8.0%非變性聚丙烯酰胺電泳，280 V恒定電壓下電泳50 min，銀染染色，拍照分析，以判斷不同類型樣品中提取的DNA的dCAPS擴(kuò)增和酶切效果。

dCAPS產(chǎn)物酶切后電泳出116 bp條帶判定為感病純合基因型，出現(xiàn)單條帶94 bp為抗病純合基因型，同時(shí)出現(xiàn)116 bp和94 bp 2條帶為抗病雜合基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類型樣品DNA提取結(jié)果

采用改進(jìn)的試劑盒提取方法均可以不同類型的西瓜樣品中提取出DNA，其中新鮮真葉和干燥真葉提取的DNA質(zhì)量濃度最大，分別為 1 130.18、1 039.74 ng·μL-1，二者比較接近，表明西瓜真葉經(jīng)過(guò)低溫干燥后對(duì)DNA的提取量影響不大；子葉、下胚抽、種芽稍低，質(zhì)量濃度分別為434.33、406.21、428.98 ng·μL-1，而種子中提取的DNA 質(zhì)量濃度最低，為 55.08 ng·μL-1。

表1 不同類型西瓜樣品提取DNA的檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同類型樣品提取DNA的dCAPS擴(kuò)增及酶切

全部樣品中提取的DNA均可擴(kuò)增出條帶，電泳背景干凈，條帶清晰，大小在116 bp附近，與該引物開發(fā)的信息相符，表明采用改進(jìn)的DNA試劑盒提取方法從西瓜種子、子葉、下胚軸、種芽、新鮮真葉和干燥真葉提取的DNA可以滿足dCAPS擴(kuò)增的需求，提取的DNA樣品中殘留的RNA和鹽分對(duì)dCAPS擴(kuò)增沒(méi)有明顯的影響（圖1）。

酶切結(jié)果表明，感病母本的dCAPS擴(kuò)增產(chǎn)物被酶切成94 bp，抗病父本的dCAPS擴(kuò)增產(chǎn)物未被酶切，而雜交1代擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)了94 bp和116 bp的共顯性條帶，各類型樣品提取的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物酶切正常，酶切片段大小一致，表明不同類型樣品中提取的DNA可以滿足dCAPS酶切的需求。

圖1 西瓜不同類型樣品中提取DNA的d Caps擴(kuò)增與酶切結(jié)果

3 討論與結(jié)論

筆者采用改進(jìn)的DNA試劑盒提取法對(duì)西瓜種子、下胚軸、子葉、種芽、新鮮真葉和干燥真葉共6種樣品進(jìn)行了DNA提取，結(jié)果表明從各樣品中均可有效提取DNA，但提取的DNA質(zhì)量濃度相差比較大，如從真葉提取的DNA質(zhì)量濃度在1 130 ng·μL-1左右，而從種子中提取的DNA質(zhì)量濃度僅為55 ng·μL-1左右，2者相差20倍左右，出現(xiàn)這種情況是否與樣品中DNA含量差異或提取效率有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

利用種子提取 DNA 已經(jīng)在棉花[7-10]、大豆[1，11-13]、玉米[14-17]、水稻[18-19]和小麥[20-21]等作物上實(shí)現(xiàn)，在同為葫蘆科園藝作物的甜瓜上也有從種子中提取DNA的報(bào)道[22]。西瓜種子富含氨基酸和脂肪酸[23]，可能會(huì)對(duì)DNA提取有不利影響，筆者曾采用常規(guī)的CTAB法和SDS法進(jìn)行過(guò)多次提取，均無(wú)法有效提取DNA，而本研究采用改進(jìn)的DNA試劑盒提取法成功地從西瓜種子中提取出DNA，表明從西瓜種子中提取DNA有較大的改進(jìn)和提高的空間。

dCAPS擴(kuò)增涉及錯(cuò)配堿基的擴(kuò)增，對(duì)DNA質(zhì)量要求較高，筆者在dCAPS操作中曾發(fā)現(xiàn)，提取的DNA在4℃冰箱中保存一段時(shí)間后雖然能夠擴(kuò)增出條帶，但擴(kuò)增產(chǎn)物卻無(wú)法被酶切出目的條帶，筆者用改進(jìn)的DNA試劑盒提取法使用了吸附柱，能夠通過(guò)吸附作用進(jìn)一步去除雜質(zhì)，提高DNA的質(zhì)量，所提取的DNA可以滿足dCAPS擴(kuò)增及酶切的需求，根據(jù)本研究結(jié)果，按照研究目的和具體的試材條件，可以選擇從種子到種芽、育苗和瓜苗生長(zhǎng)過(guò)程中的任一樣品提取DNA用于西瓜分子生物學(xué)的研究。