劉文穎,任　瑋,谷瑞增,魯　軍,蔡木易

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015)

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海洋骨膠原低聚肽鈣的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定

劉文穎,任瑋,谷瑞增,魯軍*,蔡木易*

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院,北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心,北京 100015)

以三文魚骨作為原料,以碳酸鈣作為鈣源制備出海洋骨膠原低聚肽鈣,對其總蛋白含量、螯合率、得率進(jìn)行測定,結(jié)果表明總蛋白含量為62.56%±0.26%,螯合率為51.38%±0.09%,螯合物得率為42.06%±0.10%。然后利用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對其進(jìn)行分離純化,收集得到8個(gè)組分峰,利用Q-TOF質(zhì)譜儀測定肽序列,共分析出22個(gè)肽段,分子量大多在1000 u以下。

海洋骨膠原低聚肽,肽鈣螯合物,分離純化,結(jié)構(gòu)鑒定

鈣是人體必需的常量元素,參與機(jī)體多種生理活動。缺鈣是全球性營養(yǎng)問題,在我國缺鈣現(xiàn)象更加嚴(yán)重。因此,高效、經(jīng)濟(jì)的補(bǔ)鈣制劑的研發(fā)是當(dāng)今社會急需解決的問題。三文魚屬于硬骨魚綱鮭形目鮭亞目鮭科的種類,是世界上最有益健康的魚類之一。三文魚骨是三文魚加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品,大部分作為飼料魚粉的原料或廢料丟棄,既污染環(huán)境,又造成經(jīng)濟(jì)上的損失[1-2]。以三文魚骨為原料,通過酶解制得海洋骨膠原低聚肽,能夠回收利用魚骨中的膠原蛋白,并且具有天然、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。

低聚肽能夠與鈣離子形成螯合物,與其他補(bǔ)鈣劑相比,更易被快速吸收,穩(wěn)定性更好,能有效地將鈣離子釋放出來,同時(shí)還能補(bǔ)充一定的氨基酸[5-6]。國內(nèi)外已有一些學(xué)者研究了肽鈣螯合物的制備工藝、補(bǔ)鈣作用[5-7],但關(guān)于海洋骨膠原低聚肽的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定方面的研究報(bào)道卻十分少見。因此,本文以三文魚骨作為原料,以碳酸鈣作為鈣源,制備了海洋骨膠原低聚肽鈣,在對其總蛋白含量、螯合率、得率進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上,采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)對其進(jìn)行分離純化,利用Q-TOF質(zhì)譜儀鑒定出肽段結(jié)構(gòu),為新型活性肽補(bǔ)鈣劑的開發(fā)及三文魚骨資源的利用提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

三文魚骨北京中食海氏生物技術(shù)有限公司提供;堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶(2.4 AU/g)諾維信生物技術(shù)有限公司;無水氯化鈣、無水乙醇北京化學(xué)試劑公司,分析純;乙腈美國Fisher公司,色譜純;三氟乙酸英國Alfa Aesar公司,分析純。

HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋普瑞斯機(jī)械有限公司;YG30噴霧干燥機(jī)無錫市陽光干燥設(shè)備廠;LC-20AD型高效液相色譜儀日本島津公司;Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀英國Micromass公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1海洋骨膠原低聚肽鈣的制備三文魚骨粉碎成魚骨粉→溶解于蒸餾水中→90℃熱水中加熱10 min→調(diào)節(jié)溫度為50℃,pH為8.5→以每克蛋白質(zhì)2000單位的酶量加入堿性蛋白酶,酶解3 h→調(diào)節(jié)溫度為60℃,pH為7→以每克蛋白質(zhì)3000單位的酶量加入木瓜蛋白酶,酶解2 h→100℃滅酶10 min→10000×g離心30 min,取上清液→用截留分子量1000 u的超濾膜進(jìn)行超濾,得到分子量小于1000 u的濾過液→用噴霧干燥器進(jìn)行噴霧干燥,得到海洋骨膠原低聚肽干粉→將3 g海洋骨膠原低聚肽和1 g無水氯化鈣溶解于100 mL蒸餾水中→于50℃下水浴反應(yīng)60 min→冷卻至室溫→調(diào)節(jié)pH為5,加入4倍體積的無水乙醇,室溫放置1h→抽濾收集沉淀,干燥后得到海洋膠原低聚肽鈣干粉→干燥器中保存[7]。

1.2.2海洋骨膠原低聚肽鈣指標(biāo)測定總蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法[8],以干基計(jì),蛋白質(zhì)換算系數(shù)為6.25。計(jì)算公式為:總蛋白質(zhì)含量(%)=N×6.25/W×100,N為測定出的氮含量(mg),W為海洋骨膠原低聚肽鈣的質(zhì)量(mg)。

螯合率和得率的測定參照文獻(xiàn)[9]。采用EDTA絡(luò)合滴定法測定鈣的含量,每毫升EDTA-2Na滴定液(0.05 mol/L)相當(dāng)于2.0039 mg鈣。螯合率(%)=M1/M0×100,M1為螯合物中鈣的量(mg);M0為加入反應(yīng)體系中鈣的總量(mg)。螯合物得率(%)=W1/W0×100,W1為海洋骨膠原低聚肽鈣的總量(mg),W0為海洋骨膠原低聚肽與氯化鈣的總質(zhì)量(mg)。

1.2.3RP-HPLC分離海洋骨膠原低聚肽鈣利用RP-HPLC對海洋骨膠原低聚肽鈣進(jìn)行分離純化。色譜條件為:樣品質(zhì)量濃度:10 mg/mL;流動相A:V(水)∶V(三氟乙酸)=100∶0.1;流動相B:V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=80∶20∶0.1;檢測波長:UV 220 nm;流速:0.6 mL/min;柱溫:32℃;進(jìn)樣體積:100 μL。梯度洗脫程序:0～10 min,流動相B:0%～5%;10～20 min,流動相B:5%～5%;20～35 min,流動相B:5%～9%;35～45 min,流動相B:9%～13%;45～60 min,流動相B:13%～13%;60～70 min,流動相B:13%～100%。分管收集8個(gè)組分峰,利用氮吹儀除去三氟乙酸、乙腈等有機(jī)溶劑,冷凍干燥備用[10]。

1.2.4Q-TOF MS測定分子質(zhì)量及肽序列采用Q-TOF2正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,質(zhì)譜條件為:離子化方式:納升電噴霧正離子;霧化氣體:N2;碰撞氣體:Ar;源溫:80℃;錐孔電壓:50 V;TOF加速電壓:9.1 kV;MCP檢測器電壓:2150 V;毛細(xì)管電壓:800 V;MS和MS/MS的質(zhì)量準(zhǔn)確度:0.1 u。首先進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描,得到ESI-MS圖。從ESI-MS圖中選出待測離子,然后進(jìn)行ESI-MS/MS分析。質(zhì)譜圖經(jīng)Micromass的MaxEnt 3轉(zhuǎn)換后,由Peptide Sequencing推導(dǎo)出肽段序列。

2　結(jié)果與討論

2.1海洋骨膠原低聚肽鈣的總蛋白含量、螯合率和得率

海洋骨膠原低聚肽鈣的總蛋白含量為62.56%±0.26%,螯合率為51.38%±0.09%,得率為42.06%±0.10%。表明海洋骨膠原低聚肽鈣中蛋白質(zhì)含量較高,并且具有較高的螯合率和得率。

2.2海洋骨膠原低聚肽鈣的分離純化

海洋骨膠原低聚肽是由多種小分子肽組成的混合物,與鈣螯合后,分離純化方法主要有超濾、高效液相色譜、離子交換層析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝膠過濾色譜等。其中,最常用也是最有效的方法就是RP-HPLC法。RP-HPLC是根據(jù)肽的極性強(qiáng)弱進(jìn)行分離的,具有很好的分離效果。與其它色譜方法相比,RP-HPLC具有分辨率高、色譜過程穩(wěn)定、重復(fù)性好、操作簡便等優(yōu)勢[11]。如圖1所示,利用RP-HPLC將海洋骨膠原低聚肽鈣進(jìn)行分離純化,得到一系列的峰。根據(jù)峰形、峰高、峰面積和分離度四個(gè)指標(biāo),收集8個(gè)組分峰,進(jìn)行質(zhì)譜分析。C18柱分離能夠使得相鄰或相近極性的多肽富集在一起,極性/親水性組分先被洗脫出來,而非極性/疏水性組分后被洗脫出來。因此,收集到的8個(gè)組分峰,極性是由強(qiáng)變?nèi)醯?每個(gè)組分峰里含有的可能不是單一肽段,通過質(zhì)譜分析便可對肽段進(jìn)行鑒定。

圖1　海洋骨膠原低聚肽鈣的RP-HPLC分離色譜圖Fig.1　RP-HPLC separation chromatogram of MBCP-Ca

2.3海洋骨膠原低聚肽鈣的肽序列測定

質(zhì)譜分析法是按照離子的質(zhì)核比(m/z)大小對離子進(jìn)行分離和測定從而進(jìn)行定性和定量分析的一種方法,它是目前測定分子量最準(zhǔn)確且需要樣品量最少的方法[11]。肽段在質(zhì)譜中的斷裂有一定的規(guī)律,在肽鍵處斷裂,可以得到N端系列的碎片離子(b系列)和C端系列的碎片離子(y系列),這些碎片離子還可以進(jìn)一步形成脫水、脫氨的離子。此外,除Phe、Tyr、Trp、和Ala外,氨基酸殘基還可能發(fā)生側(cè)鏈β碳和γ碳之間的斷裂[12]。

利用質(zhì)譜共從海洋膠原低聚肽鈣的8個(gè)主要組分中分析出22個(gè)肽段序列,肽段結(jié)構(gòu)具體信息見表1。19個(gè)肽段的分子量在1000 u以下,其余3個(gè)肽段分子量在1000～1050 u之間,均為不高于十肽的小肽。本中心前期研究結(jié)果表明,海洋膠原低聚肽鈣中鈣與多肽是以離子鍵和配位鍵形式結(jié)合的,也有一部分鈣是以物理吸附形式沉積在多肽鈣表面[13]。質(zhì)譜分析中未發(fā)現(xiàn)Ca2+峰,說明Ca2+與小肽結(jié)合較弱,電離過程中Ca2+脫落,因此未檢測出來。Bao等[14]和Kumagai[15]通過紅外光譜分析法對大豆肽鈣的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果表明大豆肽段能夠通過Glu和Asp殘基上的羧基與鈣螯合[14-15]。鑒定出的22個(gè)肽段中,有17個(gè)肽段具有Glu或Asp殘基,這表明Glu和Asp殘基可能在海洋骨膠原低聚肽與鈣的螯合過程中起到了關(guān)鍵作用。此外,有研究報(bào)道,Ser、Thr、Met、Tyr等氨基酸也具有促進(jìn)肽鈣螯合的作用[14],不具有Glu和Asp殘基的5個(gè)肽段中,有4個(gè)肽段具有Ser或Thr殘基。22個(gè)肽段中,只有1個(gè)肽段(Leu-Arg)不具備這些促進(jìn)肽鈣螯合的氨基酸,這表明可能是Leu與Arg之間的協(xié)同作用或者Leu-Arg的空間結(jié)構(gòu)對肽鈣的結(jié)合起到了一定的作用,還有待進(jìn)一步研究探討。

表1　Q-TOF MS鑒定出的海洋骨膠原低聚肽鈣的肽段結(jié)構(gòu)

3　結(jié)論

本研究以三文魚骨為原料制備海洋骨膠原低聚肽鈣,其總蛋白含量為62.56%±0.26%,螯合率為51.38%±0.09%,得率為42.06%±0.10%。利用RP-HPLC對其進(jìn)行分離純化,收集得到的8個(gè)組分峰,然后利用Q-TOF質(zhì)譜儀測定肽序列,共分析出22個(gè)肽段。19個(gè)肽段的分子量在1000 u以下,其余3個(gè)肽段分子量在1000～1050 u之間,均為不高于十肽的小肽。氨基酸組成分析推測,Glu、Asp、Ser、Thr殘基以及肽段的空間結(jié)構(gòu)可能在海洋骨膠原低聚肽與鈣的螯合過程中起到了關(guān)鍵作用。本研究為新型活性肽補(bǔ)鈣劑的開發(fā)及三文魚骨資源的利用提供了一定的理論依據(jù),但關(guān)于海洋骨膠原低聚肽鈣中鑒定出的肽段與鈣的螯合作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Separation,purification and structural identification of calcium-chelating Marine bone collagen oligopeptides

LIU Wen-ying,REN Wei,GU Rui-zeng,LU Jun*,CAI Mu-yi*

(Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

Calcium-chelating Marine bone collagen oligopeptides(MBCP-Ca)were prepared by using salmon bone as raw material and calcium carbonate as calcium resource.The total protein content,chelating rate and yield were determined.Results showed that the total protein content,chelating rate and yield were 62.56%±0.26%,51.38%±0.09% and 42.06%±0.10%,respectively.Then,MBCP-Ca was separated and purified by reversed phase high performance liquid chromatography(RP-HPLC).A total of 8 fractions were collected and subjected to Q-TOF mass spectrometer to identify peptide sequences.A total of 22 peptide sequences were identified,and most molecular weights of the peptides were below 1000 u.

Marine bone collagen oligopeptides;calcium-chelating peptides;separation and purification;structural identification

2015-08-27

劉文穎(1984-)，女，碩士研究生，工程師，研究方向：食源性低聚肽研究，E-mail：wenyingliu888@126.com。

蔡木易(1962-)，男，本科，教授級高工，研究方向：功能肽研究與產(chǎn)業(yè)化，E-mail：caimuyi@vip.sina.com。

魯軍(1973-)，男，博士，高級工程師，研究方向：食品營養(yǎng)與生物技術(shù)，E-mail：johnljsmith@163.com。

國家十二五科技支撐項(xiàng)目(2012BAD33B04-02)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)項(xiàng)目(2013AA102205-02)；北京市科委農(nóng)村中心國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技城成果惠民科技示范工程項(xiàng)目(Z131100003113010)；科技北京百名領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目(Z131110000513026)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)07-0049-03

10.13386/j.issn1002-0306.2016.07.001