劉 萍　馬全英　宋玉霞　劉學(xué)榮　牟克斌　王超英　董金杰（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司　甘肅 蘭州　730046）

DAPI染色法在檢測(cè)BHK-21細(xì)胞周期的應(yīng)用

劉 萍馬全英宋玉霞劉學(xué)榮牟克斌王超英董金杰*
（中農(nóng)威特生物科技股份有限公司甘肅 蘭州730046）

為建立一種檢測(cè)細(xì)胞周期的方法，取懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞按照4，6-聯(lián)脒-2苯基吲哚（DAPI） 染色方法進(jìn)行染色，利用NC-3000細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果表明，DAPI標(biāo)記法簡(jiǎn)單易行，DAPI標(biāo)記法能夠準(zhǔn)確的進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

DAPI染色法細(xì)胞周期流式細(xì)胞技術(shù)

細(xì)胞周期分析，對(duì)反映一個(gè)細(xì)胞群體的增殖活性具有重要意義，利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行DNA含量測(cè)定是細(xì)胞周期分析的重要手段，直到目前仍然是廣泛使用的方法之一，應(yīng)用細(xì)胞流式技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，其結(jié)果不僅受樣品固有性、樣品的處理方法及熒光染色的影響，還受分析方法的影響目前，用于檢測(cè)細(xì)胞周期的染料種類較多，其中碘化丙啶（PI）是常用染料，但嵌入到雙鏈DNA 和RNA 的堿基對(duì)中與之結(jié)合，無堿基特異性，故染色前必須用核糖核酸酶A處理細(xì)胞，排除雙鏈RNA的干擾［1-2］。4，6-聯(lián)脒-2苯基吲哚（DAPI）是DNA特異性的熒光染料，與DNA結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在A-T堿基區(qū)，使用時(shí)無需用RnaseA處理細(xì)胞， 但由于配置紫外激光源的流式細(xì)胞儀非常昂貴，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都沒有配備。因此，以DAPI 標(biāo)記DNA 分析細(xì)胞周期的方法尚未成為常規(guī)檢測(cè)方法被普遍采納，也沒有簡(jiǎn)單的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程可供參考［3-4］。

本試驗(yàn)擬采用DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞以探索簡(jiǎn)便易行的DNA 檢測(cè)技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞周期中各期的DNA 含量，以便及時(shí)預(yù)測(cè)規(guī)模化培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞增殖活性的情況，為規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1儀器及試劑NucleoCounter NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀，DAPI試劑盒均為chemometec公司產(chǎn)品，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為INNOVATIS產(chǎn)品，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞BHK-21為中農(nóng)威特生物科技股份有限公司馴化并保存。

1.2樣品的制備將生長狀態(tài)良好的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行傳代批式培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以4x105個(gè)/ml的密度接種于含200ml培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)三角瓶中，與37℃，150r/min培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，分別在24、48、60h對(duì)細(xì)胞取樣，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞濃度和細(xì)胞活力檢測(cè)。將樣品用PBS洗2次，1000r/min離心5min，棄上清液。用冰凍的70%無水乙醇固定，放4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3染色與上機(jī)檢測(cè)將處理好的細(xì)胞樣品，每份懸浮于0.5ml DAPI染色液中，37℃避光染色5min，取適量染色后的細(xì)胞樣加入到NC-Slide A8的檢測(cè)室中，將上樣后的NC-Slide A8放置于NC3000主機(jī)的托盤中，進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，大多數(shù)細(xì)胞散在分布，單個(gè)細(xì)胞透亮，邊緣光滑，形態(tài)長良好。

2.2細(xì)胞生長濃度與活性在起始濃度為4x105個(gè)/ml，經(jīng)過一段時(shí)間培養(yǎng)，0～48h檢測(cè)結(jié)果細(xì)胞密度逐漸呈上升趨勢(shì)，48h后繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞濃度逐漸呈下降趨勢(shì)；細(xì)胞活力先有所增加，達(dá)到最大值呈下降趨勢(shì)，直至細(xì)胞大部分死亡（見圖1、2）。

圖1　批式培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞濃度變化

圖2　批式培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞活性變化

2.2細(xì)胞周期分析上述經(jīng)DAPI染色后的BHK-21細(xì)胞上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)NC-3000系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析，結(jié)果48h以前，S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)呈上升趨勢(shì)，大部分細(xì)胞逐進(jìn)入DNA合成期，培養(yǎng)48h后，S期和G2/M期的DNA含量總數(shù)明顯呈下降趨勢(shì)（見圖3）。

圖3　BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)0-72h細(xì)胞周期DNA含量變化

3　討論

（1）細(xì)胞濃度與細(xì)胞活力都是監(jiān)測(cè)細(xì)胞質(zhì)量好壞的重要指標(biāo)［5］。本試驗(yàn)細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，在細(xì)胞培養(yǎng)到48h，細(xì)胞S期和G2/M期含量逐漸呈上升趨勢(shì)并達(dá)到最高，同時(shí)這一培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞密度也達(dá)到最大值，且細(xì)胞活力高達(dá)95%以上，兩者的檢測(cè)結(jié)果一致。試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)胞培養(yǎng)開始階段，培養(yǎng)液中營養(yǎng)豐富，細(xì)胞在較低密度下生長，代謝活躍，大部分處在G0/G1期，為下一階段DNA 合成S期貯備足夠營養(yǎng)物質(zhì)和能量，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞逐漸向DNA合成期過渡，完成DNA合成，最后進(jìn)入G2/M，細(xì)胞開始分裂增殖。試驗(yàn)中，細(xì)胞生長到72h，大部分細(xì)胞被阻滯在G0/G1期，此期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞不能在增殖，表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)大量被消耗，同時(shí)細(xì)胞代謝產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，這些因素都嚴(yán)重影響細(xì)胞的生長［6-7］。因此檢測(cè)細(xì)胞周期可預(yù)測(cè)下一個(gè)階段細(xì)胞生長趨勢(shì)與增值情況，為規(guī)膜化細(xì)胞培養(yǎng)提共理論參考。（2）細(xì)胞周期染色方法很多，本實(shí)驗(yàn)以探討了DAPI標(biāo)記BHK-21細(xì)胞，結(jié)果表明，DAPI是一種可靠的DNA檢測(cè)方法，并且其樣本制備更簡(jiǎn)單、易行。這種染料可做為帶紫外激光器的分選儀上檢測(cè)DNA的最佳選擇。雖然PI的DNA染色效果好，適用于普通流式細(xì)胞儀上檢測(cè)（488 nm激發(fā)），但由于其具有毒性，污染后不易清除，且不能標(biāo)記活體細(xì)胞等局限性，因此，不適用于在分選儀上檢測(cè)［8-9］。（3）本試驗(yàn)借助NC-3000自動(dòng)化全光譜定量細(xì)胞成像分析儀所建立的DAPI染色法簡(jiǎn)單易行，不必加通透劑，也不分離核，是一種適用于多參數(shù)分析的檢測(cè)細(xì)胞DNA含量的方法，而且實(shí)驗(yàn)流程更簡(jiǎn)單、快速，可做為具備紫外激光器的流式細(xì)胞儀上首選的DNA熒光染料。能夠準(zhǔn)確的檢測(cè)細(xì)胞周期，為規(guī)模化細(xì)胞培養(yǎng)過程中監(jiān)控細(xì)胞生長狀態(tài)提供一種良好的檢測(cè)方法。

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S818.9

A

1007-1733（2016）08-0010-02

甘肅省科技計(jì)劃資助（1008FCCA006）

2016-04-21）