李　俊,王　輝,劉　輝,陳中愛(ài),劉　嘉,陳朝軍,唐健波,呂　都,劉永翔

(貴州省生物技術(shù)研究所,貴州貴陽(yáng) 550006)

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鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽衍生-HPLC法測(cè)定果蔬中甲醛含量

李俊,王輝,劉輝,陳中愛(ài),劉嘉,陳朝軍,唐健波,呂都,劉永翔*

(貴州省生物技術(shù)研究所,貴州貴陽(yáng) 550006)

通過(guò)鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽與甲醛衍生,建立了測(cè)定果蔬中甲醛含量的高效液相色譜法。樣品在溫度為70 ℃超聲波條件下直接提取衍生30 min,經(jīng)離心純化后液相色譜檢測(cè),外標(biāo)法定量。優(yōu)化的色譜條件為:Eelipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈和水(70∶30,v/v),流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。結(jié)果表明,該方法的檢出限可達(dá)到0.114 mg/kg,在0.57～57 mg/kg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,平均回收率為82.3%～94.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.1%(n=6)。該方法樣品前處理簡(jiǎn)便,穩(wěn)定性好,檢測(cè)限低,適合果蔬中甲醛的快速定量檢測(cè)。

甲醛,高效液相色譜,鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽,衍生

甲醛(formaldehyde),俗稱(chēng)蟻醛,在常溫下是一種無(wú)色具有強(qiáng)烈刺激性氣味的氣體,易溶于水、醇和醚,35%～40%的甲醛水溶液被稱(chēng)為福爾馬林[1]。甲醛屬于中等毒性物質(zhì),過(guò)量攝入會(huì)導(dǎo)致頭痛、乏力、嘔吐、失眠以及神經(jīng)紊亂[2-3]。研究表明,甲醛還有遺傳毒性和致癌性[4]。甲醛是我國(guó)禁止在食品中添加和使用的物質(zhì),其具有一定的防腐功效,近年來(lái)有關(guān)甲醛污染果蔬的報(bào)道越來(lái)越多,已嚴(yán)重危害到人們的健康[5]。目前測(cè)定食品中甲醛含量的方法主要有分光光度法[6]、高效液相色譜法[7]、氣相色譜法[8]等,甲醛檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法有SC/T 3025-2006、DB44/T 519-2008、SN/T 1547-2011、NY/T1283-2007[9-12]等,主要用于測(cè)定水產(chǎn)品、香菇、米面制品、啤酒、乳飲料等產(chǎn)品中甲醛含量,而針對(duì)果蔬中甲醛的檢測(cè)方法鮮有報(bào)道。因此,急需建立一種高效、穩(wěn)定的果蔬中甲醛含量的檢測(cè)方法。這對(duì)于完善市場(chǎng)監(jiān)管和食品中甲醛檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法體系具有重要意義。

現(xiàn)有甲醛檢測(cè)方法的原理都是通過(guò)一種衍生劑與甲醛結(jié)合生成一種穩(wěn)定的衍生物,通過(guò)檢測(cè)衍生物來(lái)確定甲醛含量,常用的衍生物為乙酰丙酮和2,4-二硝基苯肼。乙酰丙酮分光光度法的原理是乙酰丙酮與甲醛的顯色反應(yīng),果蔬樣品的顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾較大;2,4-二硝基苯肼與甲醛的衍生物在水中溶解度不高[13],且前處理過(guò)程中操作繁瑣,易造成檢測(cè)結(jié)果的不穩(wěn)定。本研究通過(guò)鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽(PFBHA)[14]與甲醛衍生,優(yōu)化衍生反應(yīng)條件,改進(jìn)前處理工藝,通過(guò)高效液相色譜檢測(cè),為果蔬中甲醛檢測(cè)提供一種穩(wěn)定高效的定量檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蘋(píng)果、桔子、白菜、白蘿卜、辣椒、西蘭花、姜購(gòu)于重慶市北碚區(qū)永輝超市;鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽(PFBHA)標(biāo)準(zhǔn)品Sigma公司購(gòu)買(mǎi);乙腈色譜純;37.0%～40.0%甲醛溶液購(gòu)買(mǎi)于成都市科龍化工試劑廠,用碘量法[15]標(biāo)定其精確濃度為1.14 mg/mL,配制甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液濃度為114 μg/mL;其他試劑均為分析純。

1290超高效液相色譜儀、二極管陣列檢測(cè)器美國(guó)Agilent公司;DK-8D型三孔電熱恒溫水槽上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;722-P型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海現(xiàn)代儀器有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1液相色譜條件的選擇準(zhǔn)確移取200 μL 114 μg/mL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mg/mL PFBHA衍生劑,用蒸餾水定容至10 mL,在60 ℃水浴條件下加熱30 min,冷卻后過(guò)0.22 μm混合相濾膜,然后置于高效液相色譜儀上用DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,確定最佳吸收波長(zhǎng)。選取乙腈和水作為流動(dòng)相,流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,使流動(dòng)相比例分別為乙腈∶水=60∶40、70∶30、75∶25、80∶20、90∶10來(lái)確定最佳流動(dòng)相比例。同時(shí)根據(jù)最佳流動(dòng)相比例調(diào)節(jié)柱溫分別為30、35、40 ℃來(lái)確定最佳柱溫。

1.2.2同時(shí)提取衍生條件的確定

1.2.2.1衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇對(duì)衍生反應(yīng)有影響的3個(gè)因素:衍生劑加入量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間,進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn),分別測(cè)定每組的峰面積。

1.2.2.2超聲波提取法中乙酸鋅和亞鐵氰化鉀用量的確定準(zhǔn)確稱(chēng)取打碎后的白菜樣品10.00 g,置于100 mL具塞離心管中,在每份樣品中分別加入21.9%的乙酸鋅、106 g/L的亞鐵氰化鉀和二者(1∶1)混合溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mL,補(bǔ)足蒸餾水至50 mL,設(shè)定超聲波功率100 W,溫度60 ℃,超聲提取30 min,然后在離心機(jī)上8000 r/min離心5 min,將上清液移入50 mL容量瓶中,用蒸餾水定容至50 mL,移取2.0 mL提取液,用分光光度計(jì)在413 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)其吸光值[7](若溶液中有少許雜質(zhì)需過(guò)0.22 μm水相濾膜),并做空白實(shí)驗(yàn)。

表1　衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.2.3超聲波提取條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇對(duì)超聲波提取有較大影響的3個(gè)因素:提取時(shí)間、超聲波功率、提取溫度,進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。選擇西蘭花作為樣品。

表2　超聲波提取條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素水平表

1.2.3乙酸鋅和亞鐵氰化鉀對(duì)甲醛-PFBHA衍生物的影響準(zhǔn)確移取50、100、200 μL 114 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液各兩份于10 mL容量瓶中,其中一份依次加入0.5 mL 21.9%的乙酸鋅溶液,0.5 mL 106 g/L的亞鐵氰化鉀溶液,1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑;另一份依次加入1.0 mL蒸餾水,1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑,兩份溶液均用蒸餾水定容至10 mL,然后在60 ℃水浴中加熱20 min,取出后在流水中快速冷卻,在離心機(jī)上8000 r/min離心5 min,取少許溶液過(guò)0.22 μm混合相濾膜,液相色譜檢測(cè)。重復(fù)3次。

1.2.4顏色干擾實(shí)驗(yàn)和衍生物顯色穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)通過(guò)將少量莧菜紅、肼黃、靛藍(lán)三種顏色分別加入2.28 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)品中和白蘿卜樣品中,測(cè)定其峰面積變化,確定果蔬樣品顏色對(duì)甲醛檢測(cè)過(guò)程是否產(chǎn)生干擾。

準(zhǔn)確移取50、200、500 μL 114 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑,用蒸餾水定容至10 mL,置于60 ℃水浴中衍生20 min,取出后在流水中快速冷卻,取少許溶液過(guò)0.22 μm混合相濾膜,然后分別放置0、2、4、6、8、10、12、18、24 h,液相色譜法測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)溶液的峰面積,確定甲醛-PFBHA衍生物的顯色穩(wěn)定時(shí)間。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確移取0、20、50、100、200、500 μL甲醛標(biāo)準(zhǔn)使用液于10 mL容量瓶中,加入1.0 mL 1.0 mg/mL的PFBHA衍生劑,用蒸餾水定容至10 mL,70 ℃水浴衍生30 min,取出后流水中快速冷卻,然后加入0.5 mL乙酸鋅溶液,0.5 mL亞鐵氰化鉀溶液,攪拌均勻,8000 r/min離心5 min,過(guò)0.22 μm濾頭,液相色譜測(cè)定。重復(fù)測(cè)定3次。

樣品中甲醛含量M=(C×50×1000)/(m×1000)

式中:M為樣品中甲醛的殘留量(mg/kg);C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的樣液中甲醛的濃度(mg/L);m為稱(chēng)取試樣質(zhì)量(g);50為提取液最終定容體積(mL)。

1.2.6方法的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)原料中7種樣品打碎,每種樣品分別精確稱(chēng)取4份,每份10.00 g,置于100 mL具塞離心管中,每種樣品中甲醛的添加水平分別為0、1.14、8.55、17.10 mg/kg,然后按照實(shí)驗(yàn)所得檢測(cè)方法測(cè)定甲醛含量。重復(fù)6次。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Origin(Version 8.6)進(jìn)行作圖,采用SPSS(Version 17.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異,p<0.01認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著性差異。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的確定

由圖1可知PFBHA衍生液相色譜法檢測(cè)的最佳波長(zhǎng)為210 nm。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相比例乙腈∶水=70∶30,柱溫40 ℃時(shí),所得標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的分離效果最佳,如圖2所示,衍生物色譜峰和其他峰能完全分離,完成一個(gè)樣品的分析耗時(shí)7 min,甲醛衍生物保留時(shí)間在5.3 min。因此高效液相色譜法色譜條件為:流速:1.0 mL/min;流動(dòng)相:乙腈∶水=70∶30;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)器:二極管列陣檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;色譜柱為C18柱。

圖1　PFBHA-甲醛衍生物全波長(zhǎng)掃描圖Fig.1　Full wavelength scans of PFBHA-formaldehyde derivatives

圖2　甲醛標(biāo)準(zhǔn)品(A)和白菜樣品(B)的HPLC圖Fig.2　HPLC profile of formaldehyde standards(A)and cabbage sample(B)

2.2衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表3分析可得,影響衍生反應(yīng)條件的因素主次順序?yàn)?衍生劑加入量>水浴溫度>水浴時(shí)間。綜合各因素,最優(yōu)的衍生反應(yīng)條件為:A3B2C2,即水浴溫度為70 ℃,衍生劑加入量為1.0 mL,水浴時(shí)間為30 min,在該最佳衍生反應(yīng)條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)3次,測(cè)得平均峰面積為486.1±3.1。

表3　衍生反應(yīng)條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9(34)

2.3乙酸鋅和亞鐵氰化鉀用量的選擇

所得結(jié)果如圖3所示,隨著乙酸鋅和亞鐵氰化鉀加入量的增多,溶液的吸光值不斷降低,說(shuō)明溶液的澄清度不斷升高。當(dāng)兩者混合加入量達(dá)到5 mL后,溶液的吸光值隨加入量增加趨于穩(wěn)定,且加入5 mL乙酸鋅和亞鐵氰化鉀(1∶1)混合溶液時(shí)吸光值比單一加入乙酸鋅或者單一加入亞鐵氰化鉀更低,說(shuō)明溶液更加澄清透明,此時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果影響更小,所以選擇加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀(1∶1)溶液5 mL為較適宜加入量。

圖3　乙酸鋅和亞鐵氰化鉀加入量對(duì)澄清度的影響Fig.3　Effect of the amount of Zinc acetateand Potassium hexacyanoferrate on the clarity of the solution

2.4超聲波提取條件的確定

由表4分析可得,影響超聲波提取條件的因素主次順序?yàn)?超聲波功率>提取時(shí)間>提取溫度。綜合各因素,最優(yōu)的超聲波提取條件為:A2B2C2,即提取溫度60 ℃,超聲波功率80 W,提取時(shí)間30 min,在該最佳超聲波提取條件下補(bǔ)充驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),重復(fù)3次,提取出的甲醛平均含量為2.40±0.53 mg/kg。

表6　不同顏色對(duì)甲醛-PFBHA衍生液相色譜法檢測(cè)結(jié)果的影響

表4　超聲波提取條件的正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果L9(34)

2.5乙酸鋅和亞鐵氰化鉀對(duì)甲醛-PFBHA衍生物的影響

由表5可知,加與不加乙酸鋅和亞鐵氰化鉀在三種濃度下測(cè)得的甲醛-PFBHA衍生物峰面積無(wú)顯著差異(p>0.05),說(shuō)明加入乙酸鋅和亞鐵氰化鉀對(duì)甲醛-PFBHA衍生物沒(méi)有影響,乙酸鋅和亞鐵氰化鉀可以作為PFBHA衍生液相色譜法前處理過(guò)程中的有效澄清劑。

因此改進(jìn)后的樣品處理方法為:準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)打碎的樣品10.00 g,置于100 mL具塞離心管中,依次加入5.0 mL PFBHA衍生劑,35 mL蒸餾水。在超聲波功率80 W,溫度60 ℃條件下超聲提取30 min,然后依次加入2.5 mL乙酸鋅溶液,2.5 mL亞鐵氰化鉀溶液,在離心機(jī)上8000 r/min離心5 min,將上清液移入50 mL容量瓶中,再用少量蒸餾水(約5 mL)清洗殘?jiān)?次,在離心機(jī)上8000 r/min離心5 min,合并上清液并用蒸餾水定容至50 mL,即為樣品待測(cè)液。

表5　乙酸鋅和亞鐵氰化鉀

注:每一行中相同字母表示衍生物色譜峰平均面積無(wú)顯著差異(p>0.05),表6同。

2.6顏色干擾實(shí)驗(yàn)

由表6可知,經(jīng)過(guò)添加莧菜紅、肼黃和靛藍(lán)三種顏色,甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液和白蘿卜樣品溶液中測(cè)得的衍生物峰面積與未加色素測(cè)得的衍生物峰面積均無(wú)顯著差異(p>0.05),說(shuō)明顏色對(duì)衍生物的生成量沒(méi)有影響,即果蔬樣品的顏色對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響,所以鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽衍生液相色譜法前處理過(guò)程中不需要進(jìn)行脫色處理。

2.7衍生物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

所得結(jié)果如圖4所示,鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽-甲醛衍生物在放置6 h后,峰面積有減少的趨勢(shì),隨著放置時(shí)間延長(zhǎng),峰面積逐漸減少,可能是因?yàn)檠苌镌诜胖? h后開(kāi)始慢慢分解,所以處理完的樣品應(yīng)盡量在6 h以?xún)?nèi)檢測(cè),以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖4　衍生物穩(wěn)定性隨時(shí)間變化曲線Fig.4　The curve of derivatives stability changed with time

2.8標(biāo)準(zhǔn)曲線、方法的線性范圍及檢出限

按上述步驟處理,繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=210.37x+6.2804,相關(guān)系數(shù)為0.9997,在0.57～57 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。根據(jù)3倍信噪比(S/N=3)確定檢出限,該方法的檢出限為0.114 mg/kg。

圖5　甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5　Standard curve of formaldehyde

2.9方法的回收率和精密度

由表7可知,當(dāng)樣品中甲醛的添加水平為1.14 mg/kg時(shí),回收率為82.3%～88.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.0%;添加水平為8.55 mg/kg時(shí),回收率為90.5%～94.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～6.1%;添加水平為17.10 mg/kg時(shí),回收率為89.2%～93.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.5%～7.1%。在三個(gè)不同濃度的添加水平下,平均回收率為82.3%～94.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.1%,說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性均為良好。

表7　不同樣品中甲醛的回收率和精密度(n=6)

3　結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽與甲醛的衍生物在水中溶解性較好,且檢測(cè)過(guò)程中不受樣品顏色干擾,所以可以?xún)?yōu)化前處理步驟,直接用水提取且同時(shí)衍生,經(jīng)乙酸鋅和亞鐵氰化鉀純化處理后液相色譜檢測(cè),操作簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確度高。鄰-(2,3,4,5,6-五氟芐基)羥胺鹽酸鹽與甲醛衍生反應(yīng)的最佳條件為水浴溫度70 ℃,衍生劑加入量1.0 mL,反應(yīng)30 min,生成的衍生物最佳吸收波長(zhǎng)為210 nm。該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=210.37x+6.2804,相關(guān)系數(shù)為0.9997,在0.57～57 mg/kg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,檢出限0.114 mg/kg,能有效檢測(cè)出甲醛含量較低的樣品中甲醛含量。當(dāng)甲醛添加水平分別為1.14、8.55、17.1 mg/kg時(shí),平均回收率為82.3%～94.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%～7.1%(n=6),方法的回收率和準(zhǔn)確度都較高。本方法完成一個(gè)果蔬樣品的檢測(cè)只需47 min,可以用于果蔬中甲醛含量的快速定量檢測(cè)。

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Determination of formaldehyde in fruits and vegetables by HPLC derived with o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride

LI Jun,WANG Hui,LIU Hui,CHEN Zhong-ai,LIU Jia,CHEN Zhao-jun,TANG Jian-bo,LV Du,LIU Yong-xiang*

(Biological Technology Institute of Guizhou Province,Guiyang 550006,China)

A high performance liquid chromatography method was used to determine formaldehyde in fruits and vegetables by o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride derived with formaldehyde,Samples was directly extracted and derived at a temperature of 70 ℃ under the conditions of ultrasonic 30 min,then monitored by liquid chromatography after centrifugation and purified and quantified using the external standard method. The detection was performed on a XDB-C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)in an isocratic elution mode using a mobile phase consisting of acetonitrile and water(70∶30,v/v)at a flow rate of 1.0 mL/min,the column temperature was 40 ℃ and detection wavelength was 210 nm. The results showed that the quantification limit of the method was 0.114 mg/kg,with a good linear relationship between 0.57～57 mg/kg. The average recovery rate were 82.3%～94.1%,with RSD of 4.0%～8.1%(n=6). The method was simple,stability,low detection limits and suitable for the determination formaldehyde in fruits and vegetables.

formaldehyde;HPLC;o-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride;derivatives

2015-11-23

李俊(1990-)，男，碩士，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：食品化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)，E-mail:lijunsjs2015@163.com。

劉永翔(1978-)，女，博士，研究員，研究方向：食品化學(xué)，E-mail:kittyliu0211@163.com。

TS255.7

B

1002-0306(2016)11-0305-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.054