朱　明,喬長晟,2,*,李文軍

(1.天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;2.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司,天津 300457;3.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室,天津 300457)

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麥芽三糖生成酶高產(chǎn)菌株的選育

朱明1,喬長晟1,2,*,李文軍3

(1.天津科技大學(xué)工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;2.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司,天津 300457;3.天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全省部共建教育部重點實驗室,天津 300457)

以蛾微桿菌(Microbacteriumimperiale)Mebl-012菌株為出發(fā)菌株,利用常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)和紫外復(fù)合誘變,篩選麥芽三糖生成酶高酶活菌株。將不同ARTP致死率下的菌懸液進行了混合,均勻涂布篩選平板進行初篩,之后用搖瓶發(fā)酵進行復(fù)篩,最終篩選出了一株麥芽三糖生成酶高產(chǎn)突變菌株MicrobacteriumimperialeMetp-57,酶活達到241.32 U/mL,較出發(fā)菌株Mebl-012(產(chǎn)量為116.43 U/mL)提高了107.26%。以ARTP誘變過程中篩選出的高產(chǎn)菌株Metp-57為出發(fā)菌株,進行紫外誘變處理,得到高產(chǎn)突變株Metu-24,其麥芽三糖生成酶酶活可達到408.41 U/mL,較原始菌株Mebl-012提高了250.77%,且遺傳性狀穩(wěn)定。突變株Metu-24較原始菌株Mebl-012的生長速率有明顯提高。以本實驗麥芽三糖生成酶水解淀粉,制備的麥芽三糖糖漿中麥芽三糖占主要成分,含量達到46.7%。

麥芽三糖生成酶,蛾微桿菌,常壓室溫等離子體誘變,紫外誘變

麥芽三糖是一種集營養(yǎng)和保健于一體的新型糖源[1],以α-l,4糖苷鍵連接的直鏈麥芽低聚糖,甜度低,保濕性強,能有效抑制人體腸道內(nèi)有害菌的生長,促進人體有益菌的繁殖,可抑制淀粉老化[2],廣泛應(yīng)用于制作各種飲料、高級糖果、烘焙食品和滋補品等,是一種國內(nèi)外公認(rèn)的功能性食品原料[3]。

麥芽三糖的制備方法主要有兩種,一種是酶解普魯蘭多糖獲得麥芽三糖,另一種是酶解淀粉獲得麥芽三糖[4],由于普魯蘭多糖價格昂貴,酶解淀粉成為麥芽三糖大規(guī)模生產(chǎn)的主要研究途徑。麥芽三糖生成酶是酶解淀粉制備麥芽三糖的關(guān)鍵酶,可以從內(nèi)部水解淀粉的α-l,4糖苷鍵[5],水解得到的糖漿中最主要的成分就是麥芽三糖。

常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)誘變技術(shù)在微生物突變育種及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)操作簡便,成本低,活性粒子濃度高且種類多樣,射流溫度低[6]。采用ARTP能夠有效造成DNA多樣性的損傷,突變率高,并易獲得遺傳穩(wěn)定性良好的突變株,是獲得非轉(zhuǎn)基因生物的有效手段[7]。

隨著麥芽三糖作為新型甜味劑的廣泛使用,麥芽三糖生成酶的研究有明顯的社會和經(jīng)濟效益。目前麥芽三糖及制備麥芽三糖所使用的酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)均被國外大公司壟斷。本課題設(shè)計并篩選出一株高產(chǎn)的麥芽三糖生成酶菌株,實現(xiàn)酶制劑的國產(chǎn)化,降低麥芽三糖的生產(chǎn)成本。本研究以蛾微桿菌(Microbacteriumimperiale)為出發(fā)菌株,將常壓室溫等離子體誘變和紫外誘變復(fù)合,用于麥芽三糖生成酶高酶活菌株的選育,便于其進一步工業(yè)化生產(chǎn),滿足市場需求。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蛾微桿菌(Microbacteriumimperiale),由天津科技大學(xué)和天津北洋百川生物技術(shù)有限公司保存。篩選培養(yǎng)基:牛肉膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L,可溶性淀粉5 g/L,瓊脂20 g/L,pH7.0～7.2;種子培養(yǎng)基:牛肉膏 5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉5 g/L,pH7.0～7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基:可溶性淀粉20 g/L,麩皮粉10 g/L,磷酸氫二鉀2 g/L,七水硫酸鎂2 g/L,硝酸鈉1 g/L,無水氯化鈣1 g/L,吐溫40 1 g/L,pH7.0～7.2,培養(yǎng)基均為121 ℃高壓蒸汽滅菌 20 min。

SC6010型電子天平梅特勒-托利多常州衡器有限公司;LD5-2A型臺式高速離心機上海醫(yī)用分析儀器廠;GMSX-280型水浴鍋北京匯中順成科技公司;SKY-2102型搖床蘇坤實業(yè)有限公司;ARTP-Ⅱ型常溫室壓等離子體誘變育種機北京思清源生物科技有限公司與清華大學(xué)聯(lián)合開發(fā)[8];Bioscreen C型全自動生長曲線分析儀芬蘭Bioscreen。

1.2實驗方法

1.2.1麥芽三糖含量的測定采用高效液相色譜法檢測麥芽三糖的含量[9],具體的操作條件如下:采用HPLC分析系統(tǒng),色譜條件為:進樣量:20 μL,流速:1.0 mL/min,色譜柱:Luna 5u NH2100A 4.6 mm×250 mm;流動相:乙腈∶水=70∶30;柱溫:25 ℃。

1.2.2酶活性單位定義酶活性單位定義:55 ℃實驗條件下,在20 min內(nèi)水解淀粉產(chǎn)生1 mg麥芽三糖的酶量為1個酶活性單位。

1.3菌株的誘變處理

1.3.1蛾微桿菌的ARTP誘變

1.3.1.1菌懸液的制備選擇生長良好的產(chǎn)麥芽三糖生成酶的蛾微桿菌Mebl-012斜面菌株,制成 108個/mL 的菌懸液。

1.3.1.2ARTP誘變致死率曲線的測定本實驗采用清華大學(xué)研發(fā)的常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)對蛾微桿菌進行誘變處理。ARTP誘變系統(tǒng)以氦氣為工作氣體,產(chǎn)生的等離子體溫度在(30±1) ℃。取 10 μL 菌懸液于直徑為1 cm的圓形鐵片上,在設(shè)備功率為110 W、氣流量為10 L/min、處理距離為 2 mm條件下,分別處理 0、15、30、45、60、75、90、105、120 s。取各照射劑量的菌懸液進行稀釋涂板,于30 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 d,以未經(jīng)ARTP處理的菌懸液(處理0 s)涂布的平板做對比,采用CFU法計算致死率。

1.3.1.3菌株的誘變與初篩選擇40%、60%、80%三個不同致死劑量,對菌株Mebl-012 的菌懸液進行ARTP處理,三個不同致死率的10 μL菌懸液混合均勻,進行梯度稀釋,涂布于篩選培養(yǎng)基平板上,30 ℃,培養(yǎng)3 d。盧戈碘液染色法進行初篩,培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以能夠產(chǎn)麥芽三糖生成酶的菌落為中心的透明圈,淀粉水解圈直徑(D)/菌落直徑(d)比值越大,菌落的產(chǎn)酶能力越強,以D/d比值來衡量菌株產(chǎn)麥芽三糖生成酶的能力大小,在平板上噴灑碘液,選取淀粉水解圈直徑(D)/菌落直徑(d)比值較大的菌落,進一步劃線分離后,轉(zhuǎn)接斜面保存。

1.3.1.4菌株的復(fù)篩對初篩出的菌株進行發(fā)酵復(fù)篩,以1%的接種量,接種于種子培養(yǎng)基中,30 ℃,150 r/min,培養(yǎng)48 h,以5%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基,30 ℃,150 r/min 培養(yǎng)80 h后,從發(fā)酵液中提取粗酶液,測酶活。

取發(fā)酵液于離心管中,4 ℃,7000 r/min離心10 min,取離心上清液1 mL,加入裝有10 mL的2%可溶性淀粉的大號試管中,于50 ℃的水浴搖床上水浴20 min,取酶解液過有機濾膜后,利用高效液相色譜法測定麥芽三糖的產(chǎn)量,通過此方法篩選出麥芽三糖生成酶酶活高的誘變菌株。

1.3.1.5菌株遺傳性狀穩(wěn)定性實驗將篩選出的高產(chǎn)菌株在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接6代[10],發(fā)酵培養(yǎng),檢測麥芽三糖生成酶的酶活,并對各代菌株的麥芽三糖生成酶酶活進行分析比較,檢驗菌株的遺傳性狀是否穩(wěn)定。

1.3.2高產(chǎn)菌株的紫外誘變對ARTP誘變獲得的高產(chǎn)菌株,進行紫外誘變處理,以通過復(fù)合誘變的手段,進一步獲得高產(chǎn)菌株。按照 1.5.1的方法制作高產(chǎn)菌的菌懸液,取4 mL于直徑7 cm的平皿中,將平皿放在誘變箱中,置于功率為30 W的紫外燈下30 cm處,分別照射0、20、40、60、80、100、120、140 s。將上述8個不同照射時間的菌懸液分別進行梯度稀釋涂板,30 ℃避光培養(yǎng),3 d。以未經(jīng)紫外線處理(處理0 s)的菌懸液涂布的平板作對比,利用活菌計數(shù)法(CFU)來計算致死率。

致死率的計算公式為:

式(1)

對初篩菌株斜面按照1.3.1中的方法進行菌株的初篩和復(fù)篩,并對篩選得到的高產(chǎn)菌株按照1.3.1中的方法檢驗其遺傳穩(wěn)定性。

1.4生長曲線的測定

按照5%的接種量將種子液接種至含300 μL培養(yǎng)基的生長板中,30 ℃條件下在全自動生長曲線分析儀上培養(yǎng)88 h,每隔8 h取樣測定OD600 nm一次。實驗結(jié)束后,根據(jù)培養(yǎng)過程中不同時間的吸光度,繪制OD600 nm與培養(yǎng)時間(h)的關(guān)系曲線。

1.5麥芽三糖生成酶水解淀粉液中麥芽三糖含量測定

麥芽三糖的生產(chǎn)主要是以淀粉為原料,經(jīng)α-高溫淀粉酶液化,再經(jīng)麥芽三糖生成酶和普魯蘭酶的協(xié)同作用,得到含有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等為主要成分的混合糖漿,具體工藝如圖1所示。通過高效液相色譜法檢測糖漿中麥芽三糖和其他寡糖的含量。

圖1　麥芽三糖制備流程圖Fig.1　The flow chart of producing maltotriose

2　結(jié)果與討論

2.1ARTP誘變選育

2.1.1ARTP誘變的致死率曲線及誘變劑量的選擇蛾微桿菌的常壓室溫等離子體誘變的致死率曲線如圖2所示。

圖2　ARTP誘變的致死率曲線Fig.2　The fatality rate curve of ARTP mutagenesis

從圖2可以看出,隨著ARTP照射時間增長,致死率也不斷增大。在ARTP照射時間為60 s時,致死率達到了79.81%,在ARTP照射時間為30 s和45 s時,對菌株的致死率分別為25.72%和52.15%。對于不同的菌株,在不同的致死率下,其正突變率不容易確定,所以為了增加篩選出高產(chǎn)菌株的概率,對誘變劑量為30、45、60 s,三個不同致死率下的菌懸液進行混合均勻后,稀釋涂布,進行初篩。

2.1.2菌株的篩選結(jié)果經(jīng)盧戈碘液染色法初選,再進行搖瓶發(fā)酵胞外酶活性測定法進行復(fù)篩。菌株篩選結(jié)果如表1所示。

表1　菌株篩選結(jié)果

通過ARTP誘變的方法,共獲得了358株誘變處理后的菌株,根據(jù)透明圈初篩結(jié)果,在358株菌株中,有93株菌株的D/d值較出發(fā)菌株提高了20%,正突變率達到了25.97%。經(jīng)發(fā)酵復(fù)篩最終篩選,從突變菌株中得到一株酶活比較高的菌株Metp-57,其麥芽三糖生成酶酶活可達到241.32 U/mL,較出發(fā)菌株Mebl-012的產(chǎn)量116.43 U/mL,提高了107.26%。

2.1.3高產(chǎn)菌株Metp-57的遺傳穩(wěn)定性實驗將篩選出的高產(chǎn)菌株Metp-57在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接6代,對每一代進行搖床驗證;麥芽三糖生成酶酶活穩(wěn)定在240.40 U/mL,其結(jié)果見表2,表明該菌株的遺傳性能穩(wěn)定。

表2　Metp-57的遺傳穩(wěn)定性

2.2紫外誘變選育

2.2.1紫外誘變的致死率曲線及誘變劑量的選擇菌株Metp-57的紫外誘變致死率曲線如圖3所示。

圖3　紫外誘變的致死率曲線Fig.3　The fatality rate curve of UV mutagenesis

從圖3可以看出,隨著紫外線照射時間增長,致死率不斷增大。在紫外照射時間為60 s時,致死率達到88.32%,在UV照射時間為20 s和40 s時,對菌株的致死率分別為31.41%和57.33%。對于不同的菌株,在不同的致死率下,其正突變率不容易確定,所以為了增加篩選出高產(chǎn)菌株的概率,將紫外誘變劑量為20、40、60 s,三個不同致死率下的菌懸液進行混合后轉(zhuǎn)接于種子搖瓶中,篩選高產(chǎn)菌株。

2.2.2菌株的篩選結(jié)果紫外誘變株篩選結(jié)果如表3所示,共獲得了246株誘變處理后的菌株。按照1.3.1的方法對誘變后的菌株進行平板初篩,在進行搖床發(fā)酵復(fù)篩。根據(jù)初篩結(jié)果,在246株菌株中,有48株發(fā)生了正突變,正突變率達到了19.51%。經(jīng)發(fā)酵復(fù)篩最終篩選,從突變菌株中得到一株產(chǎn)量比較高的菌株Metu-24,其麥芽三糖生成酶酶活可達到408.41 U/mL,較出發(fā)菌株Metp-57的產(chǎn)量241.32 U/mL,提高了69.24%。較原始菌株Mebl-012的產(chǎn)量116.43 U/mL,提高了250.77%。

表3　菌株篩選結(jié)果

2.2.3菌株的篩選結(jié)果遺傳穩(wěn)定性實驗將篩選出的高產(chǎn)菌株Metu-24在斜面培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接6代,對每一代進行搖床驗證;麥芽三糖生成酶酶活穩(wěn)定在407.42 U/mL,其結(jié)果見表4,表明該菌株的遺傳性能穩(wěn)定。

表4　Metu-24的遺傳穩(wěn)定性

2.3高麥芽三糖生成酶活力突變株的生長特性分析

通過發(fā)酵復(fù)篩得到突變株Metu-24的麥芽三糖生成酶活力比原始菌株有顯著提高。為了準(zhǔn)確得到突變株的生長特性,按照1.3.1中的方法進行種子培養(yǎng),得到突變株和原始菌株的生長曲線如圖4所示。

圖4　突變株Metu-24和原始菌株Mebl-012的生長曲線Fig.4　The growth curve of Metu-24 and Mebl-012

從圖4可以看出,突變株Metu-24和原始菌株Mebl-012的生長趨勢大致相同,但突變株比原始菌株的生長速率要高于原始菌株,突變株與原始菌株的生長速率在32 h前差距不大,經(jīng)過培養(yǎng)32 h后突變株在600 nm處的吸光度值明顯高于原始菌株。菌株在培養(yǎng)32 h后進入生長對數(shù)期,32～64 h蛾微桿菌呈指數(shù)增長,64～80 h為蛾微桿菌生長穩(wěn)定期,80 h后步入衰亡期,菌體消亡。

2.4淀粉水解液中麥芽三糖的含量

按照1.5中的方法酶解淀粉,制備麥芽三糖,結(jié)果如圖5所示。在麥芽三糖糖漿中,麥芽三糖含量達到46.7%,是酶解液中最主要的產(chǎn)物。糖漿中含有少量葡萄糖和麥芽四糖,它們分別達到3.5%和4.7%,麥芽糖含量達到了16.8%,剩余的其他雜質(zhì)含量達到26.3%。

圖5　酶解液中麥芽三糖含量Fig.5　The maltotriose content of hydrolyzate

3　結(jié)論

通過對蛾微桿菌進行ARTP誘變處理,篩選得到了一株麥芽三糖生成酶高產(chǎn)菌株Metp-57,其麥芽三糖生成酶酶活可達到241.32 U/mL,較出發(fā)菌株Mebl-012的產(chǎn)量116.43 U/mL,提高了107.26%,且其遺傳穩(wěn)定性良好。在此過程中,根據(jù)淀粉透明圈法初篩的結(jié)果,可以得出此方法不適用于蛾微桿菌麥芽三糖生成酶的產(chǎn)酶能力檢測。以ARTP誘變過程中篩選出的高產(chǎn)菌株Metp-57為出發(fā)菌株,進行紫外誘變處理,得到高產(chǎn)突變株Metu-24,其麥芽三糖生成酶酶活可達到408.41 U/mL,較出發(fā)菌株Metp-57的產(chǎn)量241.32 U/mL,提高了69.24%。較原始菌株Mebl-012的產(chǎn)量116.43 U/mL,提高了250.77%。

通過突變株與原始菌株的生長曲線對比,突變株Metu-24比原始菌株Mebl-012生長速率明顯提高。以本實驗麥芽三糖生成酶水解淀粉,制備的麥芽三糖糖漿中麥芽三糖占主要成分,含量達到46.7%。

綜合以上結(jié)果可知,對蛾微桿菌行常壓室溫等離子體和紫外復(fù)合誘變,能大幅度提高其產(chǎn)生麥芽三糖生成酶的能力,為大規(guī)模生產(chǎn)麥芽三糖生成酶提供了穩(wěn)定菌株。有關(guān)突變菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化需要進一步研究。

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Breeding of high-yielding strains of maltotriose-forming enzyme

ZHU Ming1,QIAO Chang-sheng1,2，*,LI Wen-jun3

(1.Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China；2.Tianjin Peiyang Biotrans Biotech Co.,Ltd,Tianjin 300457,China;3.College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China)

TheMicrobacteriumimperialeof Mebl-012 was selected as the original strain,and the composite mutagenesis of Atmospheric and room temperature plasma(ARTP)-UV were used to treat it,in order to obtain a strain of high maltotriose-forming enzyme activity. The bacterial suspension under different ARTP mortality rates were mixed,and then were coated filter plate,followed by fermentation rescreening. Eventually a high-yielding strainMicrobacteriumimperialeof Metp-57 was screened out,production of this strain reached 241.32 U/mL,which was increased by 107.26% comparing with the original strain Mebl-012(yield of 116.43 U/mL). Choosing high-producing strain Metp-57 as starting strain,UV mutagenesis was conducted,maltotriose-forming enzyme activity of the mutant Metu-24 reached 408.41 U/mL,which was increased by 250.77% compared with the original strain Mebl-012,and its genetic stability was good. Compared with the original strain Mebl-012,the growth rate of metant strains Metu-24 was significantly improved. Hydrolyzing starch by this enzyme,maltotriose was predominant component,maltotriose content reached 46.7% in maltotriose syrup.

maltotriose-forming enzyme;microbacteriumimperiale;ARTP;UV mutagenesis

2015-10-30

朱明(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程，E-mail:1163347822@qq.com。

喬長晟(1969-)，男，博士，教授，研究方向：代謝控制發(fā)酵， E-mail：qiaochangsheng@163.com。

天津市科委科技支撐項目(14ZCZDTG00025)資助。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0165-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.026