陳　山,陳劍鋒,鄭向南,謝友坪

(福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350108)

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動態(tài)連續(xù)逆流提取鮑魚腹足膠原蛋白的研究

陳山,陳劍鋒,鄭向南,謝友坪*

(福州大學生物科學與工程學院,福建福州 350108)

以次品鮑魚腹足為原料,采用酸法提取鮑魚腹足中的膠原蛋白,對其酸溶性膠原蛋白(ASC)的單級動態(tài)間歇式提取和多級動態(tài)連續(xù)逆流提取工藝進行研究與比較。結(jié)果表明,單級動態(tài)間歇式提取鮑魚腹足ASC的最佳條件為:1 mol/L醋酸與0.4 mol/L鹽酸按1∶1(v/v)配制提取液、料液比1∶10、提取流速40 mL/min、單次提取時間1 h和提取次數(shù)2次,在此條件下ASC提取率為11.2%(以干基計),ASC濃度為1.04 mg/mL;而多級動態(tài)連續(xù)逆流提取的最佳級數(shù)為三級,此時ASC提取率可提高至16.9%(以干基計),ASC濃度為3.12 mg/mL。通過調(diào)節(jié)硫酸銨濃度為0.4 mol/L、pH為5.6對提取所得ASC進行初步純化,經(jīng)純化后ASC純度最高可達88.4%,回收率為89.1%。

皺紋盤鮑腹足,酸溶性膠原蛋白,提取,動態(tài)連續(xù)逆流,純化

鮑魚是一種單殼貝類,隸屬于軟體動物門(Mollusca)、腹足綱(Gastropoda)[1]。鮑魚腹足中膠原蛋白(ASC)含量較為豐富,且其含量多少直接影響鮑魚腹足嫩度[2]。鮑魚的蛋白質(zhì)主要由肌原纖維蛋白和膠原蛋白共同構(gòu)成,其中膠原蛋白占總蛋白的20%～35%[3]。相關(guān)研究表明,膠原蛋白具有抗骨質(zhì)疏松、美容、抗氧化和降血壓等多種功效,因此被廣泛應用于醫(yī)藥、保健品和化妝品等領(lǐng)域[4-5]。

目前,國內(nèi)外對魚類膠原蛋白提取有較為深入的研究,但有關(guān)鮑魚的報道較少。水產(chǎn)動物中的膠原蛋白提取方法主要有三種:熱水浸提、酶法浸提和酸法浸提[6]。其中,熱水法提取可得到水溶性膠原蛋白,存在提取效率低、對溫度要求高等缺點;酶法提取的缺點是相關(guān)用酶成本較高;酸法提取可得到酸溶性膠原蛋白,相比前兩種方法,該法具有提取效率較高、成本較低等優(yōu)點。袁起新[7]用酶法提取鮑魚腹足膠原蛋白得率為8.72%(以干基計)。林麗航[8]用酸法提取鮑魚內(nèi)臟膠原蛋白得率為11.8%(以干基計)。傳統(tǒng)膠原蛋白制備一般采用靜態(tài)間歇式,存在提取率不高、物料與設(shè)備利用率低、生產(chǎn)周期長、后期的濃縮純化成本高等缺點,嚴重制約其發(fā)展。

本實驗以次品鮑魚腹足為原料,采用酸法提取其膠原蛋白,考察單級動態(tài)間歇式提取和多級動態(tài)連續(xù)逆流提取的工藝條件,在此基礎(chǔ)上,進一步通過等電點沉淀和鹽析沉淀法初步純化提取所得的膠原蛋白,為實現(xiàn)膠原蛋白的連續(xù)化高效提取提供理論依據(jù)。

圖1　三級動態(tài)連續(xù)逆流提取示意圖Fig.1　Schematic description of three-stages dynamic continuous countercurrent extraction 注:1:提取罐;2:攪拌器;3:蠕動泵;4:流量閥;5:儲液罐;6:進液罐; 7:出液罐;實線箭頭:提取液流動方向;虛線箭頭:物料轉(zhuǎn)移方向。

1　材料與方法

1.1材料和儀器

次品鮑魚腹足即食鮑魚加工過程中產(chǎn)生的體型較小、腹足破損等影響品質(zhì)的稱為次品,由福州捷豐海珍品開發(fā)有限公司提供;醋酸、鹽酸、氯胺T、對二甲氨基苯甲醛、一水檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、正丙醇等均為分析純,國藥集團;羥脯氨酸標準品德國Sigma公司。

BS 210S電子天平德國Sartorius公司;UV-1700紫外分光光度計日本島津公司;超純水儀湖南科爾頓水務有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋廣東深圳國華電器有限公司;高速勻漿器Philips公司;TGL-15B高速臺式離心機上海安亭科學儀器廠;Fd-1-50真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1單級動態(tài)間歇式提取鮑魚腹足膠原蛋白鮑魚腹足洗凈后勻漿,取一定質(zhì)量(10 g)的漿體,采用不同酸介質(zhì)、料液比、提取時間、提取液流速和提取次數(shù),在室溫條件下進行提取實驗,通過測定膠原蛋白提取率和濃度,以確定最佳提取條件。

固定料液比(w/v)1∶8、提取時間100 min、提取液流速30 mL/min、提取次數(shù)1次,每隔20 min測定膠原蛋白含量,考察不同酸介質(zhì)(1 mol/L鹽酸、乳酸、乙酸、檸檬酸)對膠原蛋白提取的影響。

固定料液比1∶8、提取時間1 h、提取液流速30 mL/min、提取次數(shù)1次,分別考察不同醋酸濃度(0.5、1、1.5、2、2.5 mol/L)和鹽酸濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L)對膠原蛋白提取的影響。

固定料液比1∶8、提取時間1 h、提取液流速30 mL/min、提取次數(shù)1次、醋酸濃度1 mol/L、鹽酸濃度0.4 mol/L,考察不同醋酸與鹽酸體積比(0∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶0)對膠原蛋白提取的影響。

固定醋酸與鹽酸體積比1∶1、提取時間1 h、提取液流速30 mL/min、提取次數(shù)1次,考察不同料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14)對膠原蛋白提取的影響。

固定醋酸與鹽酸體積比1∶1、料液比1∶10、提取液流速30 mL/min、提取次數(shù)1次,考察不同提取時間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對膠原蛋白提取的影響。

固定醋酸與鹽酸體積比1∶1、料液比1∶10、提取時間1 h、提取次數(shù)1次,考察不同提取液流速(10、20、30、40、50 mL/min)對膠原蛋白提取的影響。

固定醋酸與鹽酸體積比1∶1、料液比1∶10、提取時間1 h、提取液流速40 mL/min,考察提取次數(shù)對膠原蛋白提取的影響。

1.2.2多級動態(tài)連續(xù)逆流提取膠原蛋白多級動態(tài)連續(xù)逆流提取實驗裝置(以三級為例),如圖1所示,三級進液罐中為新鮮提取液,以一定流速進入提取系統(tǒng),各級儲液罐通過蠕動泵相連形成連續(xù)流動狀態(tài),并在一級出液罐中收集最終的提取液。同時通過蠕動泵將每級儲液罐中的提取液注入到各級對應的提取罐中,控制好蠕動泵與流量閥的流速,形成動態(tài)提取過程。一個周期結(jié)束后,棄去三級提取罐中物料,將一級和二級提取罐中物料分別轉(zhuǎn)移至二級和三級提取罐中,同時在一級提取罐中加入新鮮物料。根據(jù)單級動態(tài)提取得到的最優(yōu)工藝,設(shè)定提取條件為料液比1∶10,提取周期1 h,1∶1混合酸,分別進行二級、三級、四級提取實驗,考察多級動態(tài)連續(xù)逆流提取效果及確定最佳級數(shù)。

1.2.3膠原蛋白純化

1.2.3.1鹽析沉淀法選擇硫酸銨對目的蛋白(膠原蛋白)進行鹽析沉淀。通過調(diào)節(jié)提取液中硫酸銨濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L),采用5000 r/min條件進行離心,將得到沉淀物用10倍體積的1 mol/L醋酸復溶,以膠原蛋白純度和回收率為評價指標,確定最佳硫酸銨濃度。

1.2.3.2等電點沉淀法由前期實驗得知,膠原蛋白等電點在5.0到6.0之間,本實驗采用5 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)提取液pH分別為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0,采用5000 r/min條件進行離心,將得到沉淀物用10倍體積的1 mol/L醋酸復溶,以膠原蛋白純度和回收率為評價指標,確定最佳pH。

1.2.3.3鹽析與等電點沉淀結(jié)合法同時調(diào)節(jié)提取液中硫酸銨濃度為0.4 mol/L、pH為5.6,得到目的蛋白沉淀物,離心后沉淀物用醋酸復溶,計算膠原蛋白純度和回收率。

1.2.4膠原蛋白含量的測定[9]因羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸,可通過測定羥脯氨酸含量后乘以換算系數(shù)來測定膠原蛋白含量,水生動物常采用11.1作為換算系數(shù)[10],羥脯氨酸含量按照GB/T9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》[11]來測定,其中羥脯氨酸濃度標準曲線方程:

羥脯氨酸濃度(mg/mL)=0.277×OD558 nm+0.107(R2=0.9985);總蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法,得到總蛋白濃度標準曲線方程:總蛋白濃度(mg/mL)=211.74×OD595 nm-14.11(R2=0.9991)。

ASC提取率(%)=提取液中ASC濃度(mg/mL)×提取液體積(mL)/物料干重(mg)×100

ASC純度(%)=提取液中ASC濃度(mg/mL)/提取液中總蛋白濃度(mg/mL)×100

純化回收率(%)=純化后復溶液中ASC濃度(mg/mL)/純化前提取液中ASC濃度(mg/mL)×100

ASC得率(%)=ASC提取率×純化回收率×100

1.3數(shù)據(jù)處理

本實驗采用Excel進行數(shù)據(jù)處理和作圖。

2　結(jié)果與分析

2.1單級動態(tài)間歇式提取膠原蛋白

圖2　不同酸條件下ASC提取率隨時間變化的曲線Fig.2　Time-course profile of ASC extraction rate under different types of acid

2.1.1最佳酸介質(zhì)的確定由圖2可知,在提取初始階段,膠原蛋白提取率高低依次為鹽酸、檸檬酸、乳酸和醋酸,但提取60 min后醋酸等弱酸提取率高于鹽酸。分析原因可能與酸的電離程度相關(guān),對于1 mol/L酸濃度,其提取液中氫離子濃度高低依次為鹽酸、檸檬酸、乳酸和醋酸,在較高氫離子濃度下,膠原蛋白分子可較快與氫離子結(jié)合發(fā)生質(zhì)子化作用,因此在提取初始階段鹽酸提取率高于其他酸。但隨著提取時間延長,氫離子被消耗,弱酸提取液的pH上升趨勢明顯高于鹽酸。相關(guān)研究表明,溶液pH對酸溶性膠原蛋白溶解度有較大影響,當pH為2～4時可達最大溶解度[12-13]。在整個提取階段,鹽酸提取液pH遠低于1,而醋酸提取液pH一直處于2～4之間,因此最終分別達最低和最高提取率。綜上所述,選擇醋酸為最佳酸介質(zhì),并考慮與鹽酸組成混合酸作為酸介質(zhì)。

由圖3和圖4可知,隨著醋酸、鹽酸濃度的升高,膠原蛋白提取率和濃度均逐漸提高。當醋酸濃度超過1 mol/L后,膠原蛋白提取率和濃度趨于平緩;而鹽酸濃度超過0.4 mol/L后,膠原蛋白提取率和濃度略有下降。分析原因可能是膠原蛋白在一定的H+濃度下有較高的溶解度,高于這個值溶解度趨于飽和,甚至下降。結(jié)合成本問題,分別選擇醋酸濃度1 mol/L、鹽酸濃度0.4 mol/L為各自最佳濃度。

圖3　醋酸濃度對ASC提取率及其濃度的影響Fig.3　Effect of acetic acid concentration on ASC extraction rate and ASC concentration

圖4　鹽酸濃度對ASC提取率及其濃度的影響Fig.4　Effect of hydrochloric acid concentration on ASC extraction rate and ASC concentration

由圖5可知,將1 mol/L醋酸和0.4 mol/L鹽酸按不同比例配制提取液,膠原蛋白提取率和濃度也不同。當醋酸:鹽酸(v/v)為1∶1時,膠原蛋白提取率最高,且均高于單獨使用醋酸或鹽酸時的提取率,原因可能是開始階段主要是由鹽酸起作用,后續(xù)醋酸起到緩沖酸的作用,綜合了兩者的優(yōu)勢。綜上所述,選擇配比為1∶1的混合酸為最佳提取液。

圖5　混合酸配比對ASC提取率及其濃度的影響Fig.5　Effect of mixed acid ratio on ASC extraction rate and ASC concentration

圖6　料液比對ASC提取率及其濃度的影響Fig.6　Effect of solid-liquid ratio on ASC extraction rate and ASC concentration

2.1.2最佳料液比的確定由圖6可知,隨液料比的增大,膠原蛋白的提取率也逐漸提高,分析原因可能是提取液越多,物料中膠原蛋白的擴散能力越強,使得提取率也越大。但同時考慮到提取液越多,也會使得提取液中的膠原蛋白濃度逐漸降低,從而大大提高后續(xù)純化成本。綜合考慮兩個評價指標,選擇1∶10作為膠原蛋白提取的最佳料液比。

2.1.3最佳單次提取時間的確定由圖7可知,隨提取時間延長,膠原蛋白提取率和濃度均不斷提高,但當提取時間超過1 h后,其提取率和濃度變化均趨于平緩。分析原因可能是膠原蛋白從固相溶解擴散至液相中需要一定的時間,故開始階段提取時間對其提取率影響較大,但一定時間以后提取液中的膠原蛋白濃度逐漸接近飽和狀態(tài),使得提取時間對其影響變?nèi)酢？紤]到時間成本,選擇1 h為最佳單次提取時間。

圖7　提取時間對ASC提取率及其濃度的影響Fig.7　Effect of extraction time on ASC extraction rate and ASC concentration

2.1.4最佳提取液流速的確定由圖8可知,隨提取液流速的增大,膠原蛋白的提取率和濃度均緩慢提高,但當流速大于40 mL/min時,其提取率和濃度均有下降趨勢。分析原因可能是一定范圍內(nèi)提取液流速越快,帶動膠原蛋白擴散越快,使得提取率略有增加,但流速超過一定值時,提取液與物料接觸時間過短,影響膠原蛋白的提取。綜上所述,選擇最佳提取液流速為40 mL/min。

圖8　提取液流速對ASC提取率及其濃度的影響Fig.8　Effect of flow rate on ASC extraction rate and ASC concentration

2.1.5最佳提取次數(shù)的確定由表1可知,經(jīng)過兩次提取后,進一步增加提取次數(shù)對提高膠原蛋白提取率已不再明顯,說明第二次提取結(jié)束后,酸溶性膠原蛋白已被基本提取完全,故單級動態(tài)間歇式提取選擇兩次為最佳提取次數(shù)。

表1　提取次數(shù)對ASC提取率及其濃度的影響Table 1　Effect of extraction times on ASC extraction rate and ASC concentration

2.2多級動態(tài)連續(xù)逆流提取膠原蛋白

由圖9和圖10可知,不同級數(shù)的膠原蛋白提取率和濃度均隨出液輪數(shù)的增加而不斷提高,在第六輪出液之后趨于穩(wěn)定,二級、三級、四級動態(tài)連續(xù)逆流的膠原蛋白提取率穩(wěn)定值分別為13.4%、16.9%和16.1%,而其膠原蛋白濃度穩(wěn)定值分別為2.53、3.12、3.05 mg/mL。

圖9　不同提取級數(shù)對ASC提取率的影響Fig.9　Effect of different extraction stages on ASC extraction rate

在多級動態(tài)連續(xù)逆流提取過程中,開始階段提取液中膠原蛋白含量并沒有形成穩(wěn)態(tài),且是一個膠原蛋白含量不斷上升的過程,在一定的出液輪數(shù)以后,提取液中膠原蛋白含量才會趨于穩(wěn)定值。多級動態(tài)連續(xù)逆流提取充分利用了提取液與物料有效成分之間的濃度差,在本實驗條件下三級提取效率最高。綜上所述,多級動態(tài)連續(xù)逆流提取選擇三級為最佳級數(shù)。

表2　單級動態(tài)間歇式提取與三級動態(tài)連續(xù)逆流提取的比較Table 2　Comparison of single-stage dynamic extraction and three-stages dynamic continuous countercurrent extraction

圖10　不同提取級數(shù)對ASC濃度的影響Fig.10　Effect of different extraction stages on ASC concentration

2.3單級動態(tài)提取和多級動態(tài)連續(xù)逆流提取的比較

本實驗所使用的兩種提取方式均采用相同的提取條件:1 mol/L醋酸與0.4 mol/L鹽酸按1∶1(v/v)混合配制提取液,料液比1∶10,提取時間1 h,提取液流速為40 mL/min。多級動態(tài)連續(xù)逆流提取選用三級,每級投料10 g;而單級動態(tài)間歇式提取投料10 g,提取兩次。由表2可知,采用三級動態(tài)連續(xù)逆流提取工藝,其膠原蛋白提取率要明顯高于單級動態(tài)間歇式提取模式,不僅提取時間縮短1/2,節(jié)省了換料補液時間,大大縮短了提取周期,而且提取液用量也減少1/2,使得膠原蛋白濃度遠高于單級提取模式,可大大減少后續(xù)的濃縮成本。

2.4純化

2.4.1鹽析沉淀法由圖11可知,當硫酸銨濃度為0.4 mol/L時,膠原蛋白純度可達到最高為62.1%。分析原因:膠原蛋白在此硫酸銨濃度下溶解度最小,使大部分的膠原蛋白沉淀,而大部分雜蛋白還未發(fā)生沉淀,從而達到去除雜蛋白的目的。綜上所述,選擇0.4 mol/L硫酸銨為最佳鹽析條件,此時膠原蛋白回收率為82.1%,得率為13.9%。

圖11　硫酸銨濃度對ASC回收率及其純度的影響Fig.11　Effect of ammonium sulfate concentration on ASC recovery ratio and ASC purity

2.4.2等電點沉淀法由圖12可知,當調(diào)節(jié)pH為5.6時,膠原蛋白純度可達最高為76.6%。分析原因可能是該膠原蛋白等電點為5.6,在此條件下膠原蛋白溶解度最低,其沉淀量可達最大值,而其他雜蛋白沉淀較少,從而達到去除雜蛋白的目的。綜上所述,等電點沉淀所選最佳pH為5.6,此時膠原蛋白回收率為93.8%,得率為15.9%。

圖12　pH對ASC回收率及其純度的影響Fig.12　Effect of pH value on ASC recovery ratio and ASC purity

2.4.3鹽析與等電點沉淀結(jié)合法為進一步提高膠原蛋白純度,本實驗同時采用鹽析沉淀和等電點沉淀法進行初步純化。同時調(diào)節(jié)提取液中硫酸銨濃度為0.4 mol/L、pH為5.6,將得到的沉淀復溶后測定其膠原蛋白與雜蛋白含量。結(jié)果表明,采用此法膠原蛋白純度可進一步提高至88.4%,此時膠原蛋白回收率為89.1%,得率為15.1%。

3　結(jié)論

酸法單級動態(tài)間歇式提取膠原蛋白的最佳條件為:1 mol/L醋酸與0.4 mol/L鹽酸按1∶1(v/v)配制提取液、料液比1∶10、提取流速40 mL/min、單次提取時間1 h和提取次數(shù)2次,在此條件下膠原蛋白的提取率為11.2%(以干基計),濃度為1.04 mg/mL;多級動態(tài)連續(xù)逆流提取的最佳級數(shù)為三級,在此條件下膠原蛋白的提取率為16.9%(以干基計),濃度為3.12 mg/mL。兩者相比,采用多級動態(tài)連續(xù)逆流可實現(xiàn)連續(xù)化提取,不僅提取時間縮短1/2,大大縮短了周期,而且提取液用量減少1/2,使得膠原蛋白濃度遠大于單級動態(tài)間歇式提取模式。此外,同時結(jié)合鹽析沉淀法和等電點沉淀法可明顯進一步提高膠原蛋白純度,當硫酸銨濃度為0.4 mol/L、pH為5.6時,膠原蛋白純度達到88.4%。

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Dynamic continuous countercurrent extraction of collagen from the foot ofHaliotisdiscus

CHEN Shan,CHEN Jian-feng,ZHENG Xiang-nan,XIE You-ping*

(College of Biological Science and Engineering,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

In order to extract acid soluble collagen(ASC)from the foot of defectiveHaliotisdiscus,the process conditions of single-stage dynamic intermittent extraction and multi-stage dynamic continuous countercurrent extraction were investigated and compared. The results showed that the optimum conditions for single-stage dynamic extraction were as follows:acetic acid(1 mol/L)/hydrochloric acid(0.4 mol/L)50%(v/v),solid to liquid ratio 1∶10,flow rate 40 mL/min,extraction time 1 h and extraction times 2. Under these conditions,the ASC extraction rate and ASC concentration reached a highest value of 11.2% and 1.04 mg/mL,respectively. Moreover,it was found that three-stages was the best condition for dynamic continuous countercurrent extraction and obtained a higher ASC extraction rate(16.9%)and ASC concentration(3.12 mg/mL). Based on these results,ASC was further purified by regulating ammonium sulfate concentration and pH value simultaneously. The highest ASC recovery ratio(89.1%)and ASC purity(88.4%)were obtained when ammonium sulfate concentration and pH value were controlled at 0.4 mol/L and 5.6,respectively.

Haliotisdiscusfoot;acid soluble collagen;extraction;dynamic continuous countercurrent;purification

2016-02-17

陳山(1990-)，男，碩士研究生，研究方向：生物化工，E-mail：1101733130@qq.com。

謝友坪(1986-)，男，助理研究員，研究方向：生物化工，E-mail：ypxie@fzu.edu.cn。

福州市科技公共服務平臺建設(shè)項目(2015-PT-94)；福州大學校人才基金項目(XRC-1464)。

TS254.1

B

1002-0306(2016)14-0262-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.14.044