劉榮，　余芳菲，　王琳，　許能貴

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州　510006）

腦缺血后酪氨酸激酶1與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)性及電針干預(yù)作用研究

劉榮，余芳菲，王琳，許能貴

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)針灸康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510006）

【目的】研究電針對局灶性腦缺血大鼠缺血側(cè)皮層神經(jīng)細(xì)胞凋亡及磷酸化酪氨酸激酶1（p-JAK1）表達(dá)的影響。【方法】采用熱凝閉大腦中動脈法復(fù)制局灶性腦缺血模型，運用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL法）檢測缺血側(cè)病灶局部神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)，采用熒光免疫法觀察局灶性腦缺血大鼠p-JAK1表達(dá)情況及電針干預(yù)作用。【結(jié)果】（1）電針組缺血側(cè)皮質(zhì)細(xì)胞凋亡表達(dá)在缺血后各時間段均低于模型組，以1 d、3 d時間相點尤為顯著（P＜0.01）。（2）模型組p-JAK1表達(dá)量與同時間段假手術(shù)組比較均顯著增多（P＜0.01），其中以1 d組表達(dá)量增高最為顯著；電針組p-JAK1表達(dá)量增加，1 d、3 d組與同時段模型組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（3）p-JAK1與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析方面，JAK1磷酸化表達(dá)與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡在腦缺血高峰期（即缺血后1 d、3 d時間段）密切相關(guān)?！窘Y(jié)論】電針治療的介入能顯著提高腦缺血早期缺血側(cè)皮質(zhì)JAK1的活性，激發(fā)機體自我保護(hù)機制，參與受損組織的修復(fù)。

腦缺血/針刺療法；JAK1；細(xì)胞凋亡；腦/病理學(xué)；疾病模型，動物；大鼠

缺血性腦血管病是一種嚴(yán)重影響人類健康的常見病。針灸一直是缺血性中風(fēng)的中醫(yī)臨床最常用的治療手段，并在挽救缺血半暗帶瀕臨死亡的神經(jīng)元和促進(jìn)損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)方面有獨特的療效［1］。目前研究證明，腦缺血損傷引起的細(xì)胞凋亡多與白細(xì)胞介素、半胱氨酸蛋白酶（caspase）、原癌基因（c-fos）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等家族參與有關(guān)，而酪氨酸激酶（JAKs）系統(tǒng)可能在以上因子發(fā)生作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用［2］。因此，研究JAKs在腦缺血后的調(diào)控機制，了解其在損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中的作用機理及電針干預(yù)作用，對于探索電針治療腦缺血的作用機理有著重要意義［3-4］。

本課題組前期研究工作初步證實，腦缺血后電針治療可下調(diào)磷酸化酪氨酸激酶2（p-JAK2）、信號傳導(dǎo)與磷酸化轉(zhuǎn)錄激活因子3（p-STAT3）蛋白的表達(dá)水平，阻斷JAK2-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異常激活，為電針治療腦缺血損傷的重要機制之一［5-7］。本研究采用TUNEL法檢測各時段病灶局部神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)，采用熒光免疫法觀察局灶性腦缺血大鼠p-JAK1表達(dá)情況及電針干預(yù)作用，以探討腦缺血后JAK1與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)性，進(jìn)一步揭示電針治療缺血性腦疾病的可能作用機制，現(xiàn)報道如下。

1　材料和方法

1.1實驗動物SPF級SD大鼠90只，雄性，體質(zhì)量200～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：SCXK（粵）2013-0020。按照區(qū)組隨機化法將動物分為假手術(shù)組、模型組、電針組各30只，各組再分為2 h組、1 d組、3 d組3個時間段組，每小組10只大鼠。

1.2主要試劑原位末端細(xì)胞凋亡檢測（TUNEL）試劑盒（天津灝洋生物工程有限公司）；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒（武漢博士德公司）；山羊抗兔p-JAK1多克隆抗體（美國Santa公司）；羊抗兔羅丹明B異硫氰酸標(biāo)記抗體（RBITC/IgG，美國Santa公司）。

1.3主要儀器G6805-Ⅰ型電針儀（青島鑫升廠）；華佗牌無菌針灸針（0.3 mm×25 mm，蘇州醫(yī)療用品廠）；932型電熱凝器（上海醫(yī)療器械八廠）；Leica CM1950型冰凍切片機（德國Leica公司）；蔡司AxioCam-MR顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.4局灶性腦缺血模型制備采用熱凝閉大腦中動脈致局灶性腦缺血模型。用100 mg/L水合氯醛溶液，按3.3 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。沿耳眼連線中點切開皮膚，分離顳肌，暴露顳骨做一骨窗，顯露大腦中動脈，用電熱凝器輕觸大腦中動脈，使之凝閉，造成局灶性腦缺血模型［8］。

1.5治療方法電針組術(shù)后給予電針治療，選取百會、大椎2穴。以1寸毫針（0.3 mm×25 mm，華佗牌，蘇州醫(yī)療用品廠生產(chǎn)）向后平刺百會0.5寸，直刺大椎0.3寸，兩穴接上G6805-Ⅰ型電針儀，采用疏密波，疏波為4 Hz，密波為20 Hz，疏密波調(diào)制頻率為20次/min，強度1～2 mA，每次電針治療30 min，每天治療1次［6］。

1.6TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡步驟用新制備的40 g/L多聚甲醛溶液（溶于pH 7.4 PBS中）固定，用20 μg/mL蛋白酶K（試劑盒提供）于37℃恒溫水浴箱孵育20 min；洗片后，與阻斷劑（體積分?jǐn)?shù)0.3%H2O2甲醇溶液）室溫孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次；通透液在冰浴中孵育2 min；PBS沖洗5 min×2次；滴加50 μL的TUNEL反應(yīng)混合溶液（試劑盒提供），濕盒中37℃孵育60 min，陰性對照組滴加50 μL含有核苷酸混合液的反應(yīng)液代替TUNEL反應(yīng)混合溶液；PBS漂洗5 min×3次；信號轉(zhuǎn)化與分析：吸干樣品周圍的水分，加入50 μL轉(zhuǎn)化劑-POD（試劑盒提供），在濕盒中37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次；滴加DAB顯色液，1 mL蒸餾水加顯色劑A、B、C各1滴，混勻，加至標(biāo)本上，室溫孵育5～10 min，光鏡下觀察至顯色程度恰當(dāng)時，以蒸餾水洗終止反應(yīng)；P BS漂洗5 min×3次；DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染。脫水，透明，晾干后中性膠封片。在目鏡10×和物鏡10×的視野下選取缺血灶周圍區(qū)大腦皮質(zhì)Ⅴ層大致相同部位為觀察區(qū)域。在目鏡10×和物鏡40×的視野下，應(yīng)用Image-PorPlus6.0圖像分析系統(tǒng)測定凋亡細(xì)胞陽性反應(yīng)物的平均光密度（Dmean）值。

1.7免疫熒光法檢測將腦組織冰凍切片置于冷丙酮固定15 min，以0.01 mol/L的PBS（pH值7.4）漂洗10 min×3次，PBS/0.3%Triton浸泡5 min，PBS漂洗5 min×3次，5 g/L牛血清白蛋白（BSA）37℃封閉20 min，甩干封閉液。滴加p-JAK1山羊抗兔抗體（1∶200），37℃恒溫水浴箱孵育1.5 h。陰性對照滴加PBS代替一抗。PBS漂洗5 min×3次。滴加RBITC/IgG（1∶50），37℃恒溫水浴箱孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次。晾干后，用抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦掃描顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察及拍片。光源用550 nm波長的激光激發(fā)綠色和紅色熒光，掃描分辨率為1024×1024 pixel。以平均熒光強度的值來表示各組p-JAK1的表達(dá)量。

2　結(jié)果

2.1腦缺血后各組大鼠腦缺血灶周圍區(qū)神經(jīng)元凋亡的變化表1、圖1結(jié)果顯示：各時間段模型組凋亡細(xì)胞陽性反應(yīng)物數(shù)量均顯著增多，與假手術(shù)組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；1 d、3 d電針組可顯著降低凋亡細(xì)胞陽性反應(yīng)物的數(shù)量，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1　各組大鼠缺血灶皮質(zhì)TUNEL陽性細(xì)胞檢測結(jié)果比較Table 1　Comparison of TUNEL-positive cells in ischemic cortex of various groups?。ā纒，Dmean）

表1　各組大鼠缺血灶皮質(zhì)TUNEL陽性細(xì)胞檢測結(jié)果比較Table 1　Comparison of TUNEL-positive cells in ischemic cortex of various groups?。ā纒，Dmean）

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.01，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組N 10 10 10 t=2 h 0.082 3±0.012 0 0.231 7±0.021 6①0.216 9±0.021 6①t=1 d 0.092 5±0.016 8 0.523 1±0.030 6①0.358 6±0.028 0②t=3 d 0.087 4±0.014 2 0.476 7±0.040 8①0.286 7±0.045 0②

圖1　腦缺血后1d各組大鼠腦缺血灶周圍區(qū)神經(jīng)元凋亡情況（×400）Figure 1　Comparison of neuronal cell apoptosis in the area around cerebral ischemia foci of various groups on the first day after cerebral ischemia（×400）

2.2腦缺血后不同時間段各組腦組織p-JAK1免疫熒光檢測結(jié)果激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察到p-JAK1熒光陽性反應(yīng)物呈紅色，神經(jīng)元細(xì)胞核呈藍(lán)色。表2、圖2結(jié)果顯示：各時間段模型組中p-JAK1熒光陽性反應(yīng)物數(shù)量均顯著升高，與假手術(shù)組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；1 d、3 d電針組可顯著增加p-JAK1熒光陽性反應(yīng)物數(shù)量，與模型組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠缺血灶周圍區(qū)p-JAK1免疫熒光法檢測結(jié)果比較Table 2　Comparison of p-JAK1 level in the area around cerebral ischemia foci of various groups detected by immumofluorescence method?。ā纒，I平均熒光強度）

表2　各組大鼠缺血灶周圍區(qū)p-JAK1免疫熒光法檢測結(jié)果比較Table 2　Comparison of p-JAK1 level in the area around cerebral ischemia foci of various groups detected by immumofluorescence method?。ā纒，I平均熒光強度）

①P＜0.01，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，③P＜0.01，與模型組比較

組別假手術(shù)組模型組電針組N 10 10 10 t=2 h 90.08±18.27 396.00±41.26①404.89±48.75①t=1 d 88.17±20.14 516.85±54.79①593.18±52.30②t=3d 86.33±35.18 473.95±40.24①568.11±46.77③

圖2　腦缺血后1 d各組大鼠腦缺血灶周圍區(qū)p-JAK1免疫熒光檢測情況（×400）Figure 2　Immunofluorescence results of p-JAK1 in the area around cerebral ischemia foci of various groups on the first day after cerebral ischemia（×400）

2.3p-JAK1與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析表3顯示：經(jīng)正態(tài)分布檢驗后，雙尾Pearson相關(guān)檢驗結(jié)果顯示，腦缺血后2 h模型組p-JAK1平均熒光強度值與TUNEL細(xì)胞凋亡平均光密度值的相關(guān)系數(shù)r=-0.592，P＞0.05，即相關(guān)無統(tǒng)計學(xué)意義，兩個變量之間無相關(guān)性。腦缺血后1 d和3 d模型組p-JAK1平均熒光強度值與TUNEL細(xì)胞凋亡平均光密度值的相關(guān)系數(shù)分別為rs=-0.841，P＜0.05，rs=-0.815，P＜0.05，相關(guān)有統(tǒng)計學(xué)意義，腦缺血后1 d和3 d模型組p-JAK1與TUNEL細(xì)胞凋亡之間均存在負(fù)相關(guān)性。

表3　p-JAK1與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析Table 3　Analysis of correlation of p-JAK1 with neural cell apoptosis

3　討論

JAK1是JAKs激酶家族的成員之一，是一種重要的酪氨酸蛋白激酶，幾乎在所有細(xì)胞中表達(dá)，其與γ鏈亞單位受體家族及gp130亞單位受體家族均可發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)育及成年的腦內(nèi)有廣泛JAKs的表達(dá)及活化，隨著腦發(fā)育的進(jìn)程還存在著表達(dá)水平的變化，這表明JAKs激酶參與了腦的發(fā)育過程［9］。

腦缺血后腦組織JAK1的表達(dá)水平、分布以及活性等存在動態(tài)的變化，與腦缺血后的時程相關(guān)。Justicia等［10］用免疫熒光技術(shù)和 Western-blot檢測JAK1在局灶性腦缺血大鼠模型大腦中的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，在缺血后第3天，缺血側(cè)皮質(zhì)和紋狀體的星形膠質(zhì)細(xì)胞中有大量JAK1免疫陽性細(xì)胞的表達(dá)，并一直持續(xù)到缺血第7天。其結(jié)果表明：大腦皮質(zhì)缺血后，星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)JAK1活化可以誘導(dǎo)STAT3核轉(zhuǎn)位，從而引發(fā)了膠質(zhì)細(xì)胞在缺血后的各種反應(yīng)。徐玉婷等［11］研究發(fā)現(xiàn)，在假手術(shù)組大鼠腦組織中僅有極少量的JAK1表達(dá)，腦缺血再灌注6 h后，JAK1表達(dá)開始增加，24 h達(dá)高峰，陽性細(xì)胞主要分布在梗死灶的邊緣區(qū)及梗死區(qū)外的缺血區(qū)域內(nèi)尚存活且結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元中。于此同時，腦缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡發(fā)生于再灌注24～72 h，JAK1及其下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)高峰與神經(jīng)元凋亡發(fā)生時間吻合，表明了JAK1信號通路的激活與腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過程密切相關(guān)。

本研究TUNEL細(xì)胞凋亡染色結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠腦組織內(nèi)偶有少數(shù)細(xì)胞凋亡陽性反應(yīng)物。大鼠腦缺血2 h后，在缺血側(cè)腦組織皮質(zhì)可見較多的凋亡細(xì)胞，腦缺血1 d后凋亡細(xì)胞的表達(dá)達(dá)到峰值，腦缺血3 d細(xì)胞凋亡陽性反應(yīng)物仍處較高的表達(dá)水平。電針組在缺血后各時間段其細(xì)胞凋亡表達(dá)水平均低于模型組，以1 d、3 d時間相點尤為顯著（P＜0.01）。結(jié)果表明電針對神經(jīng)元的保護(hù)作用在腦缺血后凋亡高峰時段更為突出，電針治療對腦缺血后皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡有明顯的抑制作用。本研究運用免疫熒光結(jié)合激光共聚焦顯微鏡來觀測電針對局灶性腦缺血大鼠缺血灶周圍區(qū)JAK1磷酸化的影響。腦缺血后2 h大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)即可檢測到相當(dāng)數(shù)量的JAK1磷酸化表達(dá)，缺血后1 d其含量繼續(xù)上升。模型3 d組雖然較前有所下降，但與假手術(shù)組比較仍有顯著性差異（P＜0.01）。p-JAK1在腦缺血后缺血側(cè)皮質(zhì)的表達(dá)規(guī)律與以往研究的結(jié)果基本一致［6-9］，其表達(dá)的峰值均是出現(xiàn)在腦缺血早期，可能是腦缺血后機體JAK1磷酸化介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的應(yīng)激反應(yīng)，以起到減輕腦組織的損傷，提高受損神經(jīng)元的修復(fù)能力的作用。電針1 d、3 d 組p-JAK1表達(dá)量與同時段模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明電針治療的介入能顯著提高腦缺血早期缺血側(cè)皮質(zhì)JAK1的活性。

從p-JAK1與神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)性分析來看，JAK1磷酸化表達(dá)與神經(jīng)元細(xì)胞凋亡在腦缺血高峰期（即缺血后1 d、3 d時間段）密切相關(guān)。此外，p-JAK1蛋白表達(dá)與TUNEL細(xì)胞凋亡分別呈負(fù)相關(guān)性，因此可認(rèn)為JAK1和抗細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果顯示：電針治療的介入能顯著提高腦缺血早期缺血側(cè)皮質(zhì)JAK1的活性，激發(fā)機體自我保護(hù)機制，參與受損組織的修復(fù)，這可能為電針治療腦缺血損傷、抑制神經(jīng)元凋亡的重要機制之一。

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［6］劉榮，許能貴，易瑋，等.電針對局灶性腦缺血大鼠JAKSTAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響［J］.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2011，27（6）：617.

［7］劉榮，許能貴.電針對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)及酪氨酸激酶JAK2的影響［J］.中國老年學(xué)雜志，2015，35（8）：4143.

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［9］劉榮.JAKs激酶在電針抗缺血性腦損傷中作用的研究［D］.廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2012：64.

［10］Justicia C，Gabriel C，Planas A M.Activation of the JAKs/STATs pathway following transient focal cerebral ischemia：signaling thigh Jakl and Stat3 in astrocytes［J］.Glia，2000，30（3）：253.

［11］徐玉婷，柳紅，趙瑞波.亞低溫對大鼠缺血性腦損傷后JAK1-STAT1通路的作用［J］.臨床與實驗病理學(xué)雜志，2011，27（3）：1862.

【責(zé)任編輯：黃玲】

Correlation of Janus Kinase 1 with Neuronal Cell Apoptosis After Cerebral Ischemia and Intervention Effects of Electroacupuncture

LIU Rong，YU Fangfei，WANG Lin，XU Nenggui
（Clinical Medical College of Acupuncture，Moxibustion and Rehabilitation，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006 Guangdong，China）

ObjectiveTo study the effect of electroacupuncture on neuronal apoptosis and phosphorylated-Janus kinase 1（p-JAK1）expression in the cerebral cortex of focal cerebral ischemia rats.Methods Rat model of focal cerebral ischemia was established by occlusion of the middle cerebral artery with heat-coagulation.We used TUNEL assay to detect the neuronal apoptosis in the cerebral cortex of focal cerebral ischemia rats，and applied fluorescence immunoassay to observe the p-JAK1 expression at different time points after ischemia. Results（1）The apoptotic neuron number of ischemic cortex in electroacupuncture group was lower than that in the model group，especially on the first day and third day of electroacupuncture（P＜0.01）.（2）The p-JAK1 expression level in the model group was obviously higher than that in the sham operation group at the same time period（P＜0.01），the increase of the model group on the first day being more obvious.The differences of p-JAK1 expression between electroacupuncture group and model group on the first day and third day after ischemia were statistically significant（P＜0.05 or P＜0.01）.（3）The p-JAK1 expression had close relation with neuronal apoptosis at the peak period of ischemia（on the first day and third day after ischemia）.Conclusion Electroacupuncture intervention can significantly improve JAK1 activity of ischemic cortex on the early stage of cerebral ischemia，which can stimulate the body self-protection mechanism and participate in the repair of damaged tissue.

cerebral ischemia/acupuncture therapy；JAK1；apoptosis；brain/pathology；disease models，animal；rats

R246.9

A

1007-3213（2016）04-0510-05

10.13359/j.cnki.gzxbtcm.2016.04.017

2016-02-29

劉榮（1981-），女，醫(yī)學(xué)博士，講師；E-mail：liurong@gzucm.edu.cn

許能貴（1964-），男，博士研究生導(dǎo)師，研究員；E-mail：75093604@qq.com

廣東省自然科學(xué)基金博士啟動項目（編號：2014A030310051）