陳仕勇，馬　嘯，張新全*，陳智華，周　凱（.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川成都630；.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都6004）

不同來(lái)源SSR和EST—SSR在披堿草屬和鵝觀草屬物種中的通用性分析

陳仕勇1，2，馬嘯1，張新全1*，陳智華2，周凱1
（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)系，四川成都611130；2.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041）

披堿草屬和鵝觀草屬是禾本科小麥族兩個(gè)重要的多年生屬，其種屬界限及系統(tǒng)關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，是其種質(zhì)資源利用的難點(diǎn)。本研究基于小麥族中不同來(lái)源的已開發(fā)的SSR標(biāo)記，篩選出在披堿草屬和鵝觀草屬中高通用性的SSR標(biāo)記，為其生物系統(tǒng)關(guān)系研究提供重要參考。試驗(yàn)選用了來(lái)自小麥族小麥、大麥、披堿草屬、擬鵝觀草屬及賴草屬5個(gè)屬的230個(gè)SSR和EST-SSR標(biāo)記對(duì)小麥族St、H、Y基因組的23個(gè)物種進(jìn)行了SSR擴(kuò)增及通用性分析。結(jié)果表明，1）在篩選的230個(gè)標(biāo)記中，163個(gè)（70.87%）SSR和EST-SSR標(biāo)記能在所有的供試物種中擴(kuò)增出清晰的條帶，在披堿草屬和鵝觀草屬等物種中表現(xiàn)出了較高的通用性；2）在擴(kuò)增出的163個(gè)標(biāo)記中，EST-SSR （87.60%）比基因組SSR（49.50%）標(biāo)記在種屬間表現(xiàn)出了較高的通用性，而基因組SSR標(biāo)記（85.98%）則比EST-SSR（79.37%）標(biāo)記表現(xiàn)出更高的多態(tài)性；3）163個(gè)標(biāo)記在供試物種中共擴(kuò)增出579個(gè)清晰條帶，其中多態(tài)性條帶為533個(gè)，多態(tài)性比率為92.05%；每個(gè)標(biāo)記擴(kuò)增的條帶數(shù)變化為1～11條，平均擴(kuò)增條帶數(shù)為3.55條；4）基于UPGMA聚類結(jié)果與供試物種的基因組之間表現(xiàn)出了較高的相關(guān)性，相同或相似基因組物種間表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，其中H基因組與St基因組的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，H基因組二倍體物種與其他物種也表現(xiàn)出了較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。本研究選用的5個(gè)屬的SSR和EST-SSR標(biāo)記均能在披堿草屬和鵝觀草屬物種中擴(kuò)增，最后共篩選出了163個(gè)高通用性的SSR和EST-SSR分子標(biāo)記，揭示了供試物種及不同基因組間的親緣關(guān)系，為下一步披堿草屬和鵝觀草屬的種屬關(guān)系及系統(tǒng)學(xué)研究提供了重要參考。

SSR；披堿草屬；鵝觀草屬；通用性；系統(tǒng)關(guān)系

http：//cyxb.lzu.edu.cn

陳仕勇，馬嘯，張新全，陳智華，周凱.不同來(lái)源SSR和EST-SSR在披堿草屬和鵝觀草屬物種中的通用性分析.草業(yè)學(xué)報(bào)，2016，25（2）：132-140.

CHEN Shi-Yong，MA Xiao，ZHANG Xin-Quan，CHEN Zhi-Hua，ZHOU Kai.The transferability of SSR and EST-SSR markers of different origins in Elymus and Roegneria in the Triticeae（Poaceae）.Acta Prataculturae Sinica，2016，25（2）：132-140.

披堿草屬（Elymus）和鵝觀草屬（Roegneria）是禾本科小麥族（Triticeae）兩個(gè)重要的多年生屬，它們不僅包括很多重要的牧草資源和抗性基因資源，還是草原和草甸等的重要組成部分，具有重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值［1-2］。披堿草屬和鵝觀草屬的種屬界限等系統(tǒng)關(guān)系一直存在爭(zhēng)議，已成為其種質(zhì)資源研究利用中的難點(diǎn)。本研究通過(guò)對(duì)小麥族近緣屬SSR標(biāo)記的篩選，為披堿草屬和鵝觀草屬種屬間系統(tǒng)關(guān)系的研究提供重要的參考，對(duì)該類群植物資源的利用等具有重要意義。簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSR）由于其分布廣、數(shù)量多、高多態(tài)性、共顯性及重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛運(yùn)用于植物研究的各個(gè)領(lǐng)域，特別在種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)［3］、種屬間親緣關(guān)系［4］研究等方面。雖然SSR和EST-SSR（基于表達(dá)序列標(biāo)簽的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，SSR based on expressed sequence tags）標(biāo)記在植物研究中具有強(qiáng)大的功能，由于SSR標(biāo)記具有物種的特異性，其相關(guān)的引物開發(fā)難度較大、成本較高，這些限制了SSR標(biāo)記在不同植物研究中的廣泛運(yùn)用。但同時(shí)由于SSR兩端的側(cè)翼序列在近緣種屬物種間具有高度保守性，這就為SSR標(biāo)記轉(zhuǎn)移到近緣的種屬間物種中提供了可能［5］。目前很多物種的SSR標(biāo)記已經(jīng)成功的轉(zhuǎn)移到其近緣的物種中，其已經(jīng)被證實(shí)為一種簡(jiǎn)單、有效地獲得SSR標(biāo)記的方法［5-8］。目前也已經(jīng)有研究報(bào)道小麥（Triticum aestivum）、大麥（Hordeum vulgare）等物種的SSR標(biāo)記在小麥族多年生物種中成功運(yùn)用，如冰草屬（Agropyron）、披堿草屬、偃麥草屬（Elytrigia）等［9-11］。在小麥族物種中，小麥和大麥等麥類作物上擁有大量的SSR和EST-SSR標(biāo)記，為小麥族近緣物種SSR標(biāo)記開發(fā)提供了參考。另外，披堿草屬物種如犬草（E.caninus）、阿拉斯加披堿草（E.alaskanus）等也開發(fā)了部分SSR和EST-SSR標(biāo)記［12-14］，其是否能在披堿草屬和鵝觀草屬物種中擴(kuò)增也有待于進(jìn)一步的分析。本研究選用了來(lái)自小麥族中小麥、大麥、擬鵝觀草屬（Pseudoroegneria）、賴草屬、披堿草屬的230個(gè)SSR標(biāo)記，在小麥族披堿草屬、鵝觀草屬（含有St、H、Y基因組）物種中進(jìn)行SSR分析和通用性研究，篩選出高通用性的SSR標(biāo)記，以期為下一步該類群物種的系統(tǒng)關(guān)系等研究提供參考。

1　材料與方法

1.1供試材料

試驗(yàn)選用小麥族St、H、Y基因組物種共23個(gè)，其中包括來(lái)自擬鵝觀草屬St基因組二倍體3個(gè)，大麥屬（Hordeum）H基因組二倍體2個(gè)，披堿草屬St H和鵝觀草屬St Y四倍體材料各4個(gè)，披堿草屬、鵝觀草屬六倍體物種10個(gè)。供試材料由美國(guó)國(guó)家植物種質(zhì)資源庫(kù)（USDA-ARS）提供（表1），材料種植于四川紅原西南民族大學(xué)高原牧草種質(zhì)資源圃內(nèi)。

表1　材料列表Table1　The materials used in the study

1.2DNA提取及SSR分析

試驗(yàn)于2012年進(jìn)行供試材料的取樣，每份材料選取10株左右單株并取幼嫩葉片混合提取DNA，DNA提取采用植物DNA快速提取試劑盒DP305提?。ū本┨旄?。

試驗(yàn)分別篩選來(lái)自小麥族不同屬的SSR和EST-SSR標(biāo)記共230個(gè)，其中SSR包括小麥55個(gè)［15］、大麥13個(gè)［16］、披堿草屬33個(gè)［12-13］，EST-SSR包括小麥25個(gè)［17］、大麥8個(gè)［18］、披堿草屬51個(gè)［14］、擬鵝觀草屬25個(gè)［14］、賴草屬20個(gè)［19］。所有引物序列均由上海生工生物公司合成。PCR反應(yīng)體系（20μL）：10μL 2×Mix混合液（500μmol/L d NTP each，20 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2），上下游引物各1.5μL （10 pmol/μL），Taq酶0.4μL（2.5 U/μL），模板DNA 2μL（10 ng/μL），dd H2O補(bǔ)齊。PCR擴(kuò)增程序參考相關(guān)引物來(lái)源文獻(xiàn)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%的聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分離，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染并用數(shù)碼相機(jī)照相保存圖片。

1.3數(shù)據(jù)分析

對(duì)本研究中各標(biāo)記目標(biāo)擴(kuò)增區(qū)域的條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后每個(gè)條帶視為1個(gè)位點(diǎn)，按條帶有或無(wú)分別賦值，有帶記為1，無(wú)帶記為0，構(gòu)建相關(guān)二元數(shù)據(jù)矩陣。采用NTSYS-pc2.11x軟件分析材料間的Dice遺傳相似系數(shù)（genetic similarity coefficients，GS）［20-21］。同時(shí)基于Dice遺傳相似系數(shù)進(jìn)行非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（unweighted pair group method with arithmetic average，UPGMA）聚類分析及主成分分析（principal component analysis，PCA），聚類樹形圖節(jié)點(diǎn)分支的可靠性采用Winboot軟件進(jìn)行bootstrap分析，設(shè)定重復(fù)抽樣次數(shù)為1000次［22］。

2　結(jié)果與分析

2.1不同來(lái)源SSR的通用性分析

本研究篩選了230對(duì)引物在St、H及Y基因組物種進(jìn)行通用性分析，其中163對(duì)引物能夠擴(kuò)增出清晰的條帶，標(biāo)記通用率為70.87%（表2，表3，圖1）。這其中包括基因組SSR標(biāo)記101個(gè)，成功擴(kuò)增50個(gè)標(biāo)記，成功率49.50%；EST-SSR標(biāo)記129個(gè)，成功擴(kuò)增113個(gè)標(biāo)記，成功率87.60%。本研究中EST-SSR標(biāo)記的通用性遠(yuǎn)高于基因組SSR標(biāo)記。在不同來(lái)源的基因組SSR標(biāo)記中，披堿草屬SSR通用性最高，在EST-SSR標(biāo)記中，大麥EST-SSR通用性最高，披堿草屬EST-SSR次之。從擴(kuò)增的多態(tài)性標(biāo)記來(lái)看，來(lái)自擬鵝觀草屬的ESTSSR標(biāo)記的多態(tài)性標(biāo)記最多，多態(tài)率為95.65%，而來(lái)自賴草屬的EST-SSR標(biāo)記的多態(tài)性標(biāo)記率較低，為57.14%。本研究中，基因組SSR標(biāo)記的平均擴(kuò)增多態(tài)性為85.98%，EST-SSR標(biāo)記的平均擴(kuò)增多態(tài)性為79.37%，基因組SSR標(biāo)記的擴(kuò)增多態(tài)性高于EST-SSR標(biāo)記。

表2　篩選的引物列表Table2　List of the selected primers

表3　不同來(lái)源SSR標(biāo)記在小麥族St、H、Y基因組物種中的擴(kuò)增情況Table3　Performances of different SSR markers of species with St，H，Y in Triticeae

圖1　不同來(lái)源SSR標(biāo)記在供試物種中的擴(kuò)增電泳圖Fig.1　Amplification electrophoretogram of different SSR markers in selected species

2.2不同來(lái)源SSR在不同基因組物種中的通用性分析

不同來(lái)源SSR標(biāo)記在本研究中不同基因組類型中的擴(kuò)增情況分析見表4。不同來(lái)源SSR標(biāo)記在St、H、Y基因組不同類型物種均能有效的擴(kuò)增，在不同基因組物種中的擴(kuò)增成功率變化為75.46%～96.32%。其中在H基因組的二倍體物種中的擴(kuò)增成功率相對(duì)較低，為75.5%。在披堿草屬和鵝觀草屬四倍體St H、St Y及六倍體St HY物種的擴(kuò)增成功率相對(duì)較高，分別達(dá)到92.64%、95.09%、96.32%。

2.3遺傳相似系數(shù)

本研究中共選用230對(duì)SSR引物，其中163對(duì)引物成功擴(kuò)增，其中多態(tài)性引物136對(duì)。進(jìn)一步篩選的163對(duì)引物在供試的23個(gè)物種材料中共擴(kuò)增出579條帶，其中多態(tài)性條帶為533條，多態(tài)性條帶比率為92.05%。每對(duì)SSR引物擴(kuò)增的條帶數(shù)變化為1～11條，平均每對(duì)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為3.55條。供試23個(gè)物種的Nei-Li平均遺傳相似系數(shù)為0.630，其中最大值為0.954（同為St YY基因組的E.glausicussimus與E.tschimganicus之間），最小值為0.383（具有H基因組的H.stenostachys與St Y基因組物種E.caucasicus之間）。

2.4聚類分析

基于Dice遺傳相似系數(shù)對(duì)23個(gè)物種進(jìn)行UPGMA聚類分析（圖2）。供試的23個(gè)物種可以明顯的被分成2大類（100%支持率），包括含有St基因組物種一類，H基因組二倍體物種一類，表明St與H基因組具有相關(guān)較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。其中H基因組聚類即第1類中包括了兩份材料，分別是具有H基因組的二倍體物種H.bogdanii與H.stenostachys（100%的支持率）。St基因組聚類中又能繼續(xù)劃分成3個(gè)亞類，包括St、St+H及St+Y三類。首先第2類包括5個(gè)物種，具有St與H基因組物種，包括3個(gè)St基因組的二倍體物種，St H四倍體和StSt H六倍體物種各1個(gè)。第3類包括6個(gè)物種，同樣具有St及H基因組，包括St H四倍體物種3個(gè)及St HH和StSt H六倍體物種3個(gè)。第4類包括10個(gè)物種，該類物種均含有Y基因組，包括St HY的兩個(gè)物種、St Y的4個(gè)物種及StSt Y的兩個(gè)物種，其中StSt Y物種E.tschim ganicus和E.glausicussimus表現(xiàn)出了較近的親緣關(guān)系（100%的支持率）。聚類分析結(jié)果與物種的基因組組成表現(xiàn)出極高的相關(guān)性。主成分分析與聚類分析結(jié)果基本保持一致，主成分分析圖直觀的反映了供試材料間的親緣關(guān)系，其中前3個(gè)主成分分別能解釋總變異的65.07%，5.48%，3.82%（圖3）。

表4　不同來(lái)源SSR標(biāo)記在不同基因組物種中的通用性Table4　Transferability of SSR markers in species with different genome constitutions

圖2　基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.2　Dendrogram based on SSR data using UPGMA method

圖3　基于Dice系數(shù)的主成分分析圖Fig.3　The PCA based on Dice coefficients

3　討論

3.1SSR標(biāo)記的通用性

目前，大量作物如小麥、大豆（Glycine max）及棉花（Gossypium arboreum）等SSR引物成功轉(zhuǎn)移到近緣的野生物種中成功運(yùn)用［15，23］，特別在小麥族物種中，大量的小麥、大麥等麥類作物SSR標(biāo)記的成熟開發(fā)為該類群的其他物種的SSR標(biāo)記開發(fā)提供了參考，成為了一種較簡(jiǎn)便、快速的方法［8，17］。Hernández等［24］選擇了36個(gè)小麥、35個(gè)大麥SSR標(biāo)記在Hordeum chilense進(jìn)行通用性分析，其中13個(gè)（36.11%）小麥、10個(gè)（28.57%）大麥SSR標(biāo)記具有較好的擴(kuò)增效果。MacRitchie和Sun［25］評(píng)價(jià)了25個(gè)大麥及3個(gè)小麥SSR標(biāo)記在披堿草屬四倍體物種E.trachycaulus復(fù)合群體中的通用性，其中13（52.00%）個(gè)大麥SSR、2（66.67%）個(gè)小麥SSR標(biāo)記能成功在供試材料中擴(kuò)增出清晰和重復(fù)性好的位點(diǎn)，同時(shí)還表明小麥及大麥的SSR標(biāo)記是小麥族相關(guān)物種遺傳分析重要的標(biāo)記。本研究選用的230個(gè)不同來(lái)源的SSR標(biāo)記，其中163個(gè)SSR（70.87%）能夠成功擴(kuò)增出位點(diǎn)，與前人的研究報(bào)道結(jié)果相似。本研究篩選的引物表現(xiàn)了較好的通用性以及高效性，為下一步披堿草屬、鵝觀草屬物種的系統(tǒng)學(xué)等研究提供了重要的參考。

另外，就EST-SSR與基因組SSR通用性相比，在本研究中EST-SSR的通用性（87.60%）明顯高于基因組SSR標(biāo)記（49.50%），但是其中基因組SSR標(biāo)記的多態(tài)性（85.98%）高于EST-SSR（79.37%）。其中ESTSSR的高通用性可能與EST-SSR來(lái)自功能基因序列有關(guān)，相關(guān)的功能序列在不同物種間具有較高的保守性。兩種類型SSR的比較分析結(jié)果與小麥族相關(guān)物種的研究結(jié)果相一致，Eufayl等［26］選用20個(gè)EST-SSR標(biāo)記和基因組SSR標(biāo)記22個(gè)對(duì)A、B基因組類型的小麥材料進(jìn)行擴(kuò)增分析，結(jié)果基因組SSR標(biāo)記的多態(tài)性（53.00%）高于EST-SSR（25.00%）。同時(shí)需要指出的是，不同類型的SSR的通用性及其產(chǎn)生的多態(tài)性與物種的繁育方式相關(guān)性較高，如在高羊茅（Festuca arundinacea）、黑麥草屬（Lolium）等異花授粉牧草中的SSR標(biāo)記的通用性及產(chǎn)生的多態(tài)性高于自花授粉的作物小麥、水稻（Oryza sativa）等［6］。

3.2披堿草屬、鵝觀草屬的種屬關(guān)系

基于Dice遺傳相似系數(shù)的聚類結(jié)果與供試物種的基因組組成表現(xiàn)出了極大的相關(guān)性，具有相同或者相似基因組組成的物種能夠聚在一起，其表現(xiàn)出了較近的親緣關(guān)系。聚類分析首先將H基因組的二倍體物種與其他物種分開，形成明顯的St和H基因組兩類，表明了St和H基因組之間表現(xiàn)出了較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，這也與細(xì)胞遺傳學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)的研究結(jié)果一致［27-28］。同時(shí)在St基因組分支中，供試材料又被分為St+H（StSt H、St HH、St H）、St+Y（St YY、St Y、St HY）、St三類，這又很好的揭示了St、H、Y基因組不同組合類型物種之間的種屬界限，也體現(xiàn)了小麥族中基因組分類體系的合理性。在小麥族基因組分類體系中，披堿草屬物種為含有St和H基因組的物種（St H、St H H、StSt H），鵝觀草屬物種則為含有St和Y基因組的物種（St Y、St YY），而St HY基因組物種則歸為曲穗草屬（Cam peiostachys）［29-30］。在本研究中，基于SSR標(biāo)記的結(jié)果基本上支持該種分類體系，但同時(shí)由于本研究不同基因組類型物種僅選取了少量代表物種，披堿草屬和鵝觀草屬等種屬界限還有待于基于更多材料的進(jìn)一步研究。

4　結(jié)論

本研究選用來(lái)自小麥、大麥、披堿草屬、擬鵝觀草屬、賴草屬的230個(gè)SSR和EST-SSR標(biāo)記，其中163個(gè)SSR標(biāo)記能夠成功在供試物種中擴(kuò)增，其中EST-SSR的通用性遠(yuǎn)高于基因組SSR標(biāo)記，但是基因組SSR標(biāo)記的多態(tài)性高于EST-SSR?；赟SR標(biāo)記結(jié)果揭示了供試材料間的親緣關(guān)系，具有相同或相似基因組的物種表現(xiàn)出了較近的親緣關(guān)系，其中St基因組與H基因組具有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系。本研究結(jié)果為披堿草屬、鵝觀草屬物種的系統(tǒng)學(xué)研究提供了重要的參考。

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The transferability of SSR and EST—SSR markers of different origins in Elymus and Roegneria in the Triticeae（Poaceae）

CHEN Shi-Yong1，2，MA Xiao1，ZHANG Xin-Quan1*，CHEN Zhi-Hua2，ZHOU Kai1
1.Department of Grassland Science，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China

Elymus and Roegneria，two important genera in the tribe Triticeae，include many important forage grasses，and also carry elite genes for improving cereal crops.However，there is ongoing dispute on the species boundaries and interspecific systematic relationships in the two genera.The biosystematic relationships in the group are of keen interest to agrostologists around the world.Based on known SSR markers in Triticeae，the objective of this study was to screen out the high transferability markers for Elymus and Roegneria，which would provide important information for understanding the biosystematic relationships of the two genera.A total of 230 simple sequence repeats（SSR）and SSR based on expressed sequence tags（EST-SSR）markers from 5 different genera including wheat，barley，Elymus，Pseudoroegneria and Leymus，were used to study the transferability to 23 species containing the St，H，and Y genomes.Among the 230 SSR markers，163 （70.87%）markers could generate clear bands，which showed a high transferability for those markers.The EST-SSR markers（87.60%）showed a higher transferability than genomic SSR markers（49.50%），but the genomic SSR markers showed a higher polymorphism（85.98%）than the EST-SSR markers（79.37%）.A total of 579 bands were amplified from the 163 SSR markers able to generate clear bands，of which 533 bands were polymorphic.The number of amplified bands of each of these 163 SSR markers ranged from 1 to 11 with an average of 3.55 bands.Cluster analysis using the unweighted pair group method with arithmetic average （UPGMA）showed that the species with same or similar genome could be grouped together.Additionally，the H genome showed a rather distant phylogenetic relationship with St genome，and distant phylogenetic relationships were also revealed between the diploid species containing the H genome and other species in the study. The selected SSR markers from 5 genera could be amplified successfully in Elymus and Roegneria.To summarise，a total of 163 high transferability SSR markers were found to be suiTablefor the further phylogeny analysis，which also revealed the phylogenetic relationships among the species.The results from this study provide important information for improving understanding of biosystematic relationships between Elymus and Roegneria.

SSR；Elymus；Roegneria；transferability；phylogenetic relationship

10.11686/cyxb2015324

2015-06-29；改回日期：2015-08-25

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃973項(xiàng)目（2014CB138705），四川省科技支撐計(jì)劃（2015SZ0062）和四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（15ZA0388）資助。

陳仕勇（1984-），男，四川三臺(tái)人，講師，博士。E-mail：chengshi8827@163.com

Corresponding author.E-mail：zhangxq@sicau.edu.cn