王　霞, 呂　蒙, 徐　虓, 劉志英, 高曉麗

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第五附屬醫(yī)院藥劑科, 2附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科, 3第五附屬醫(yī)院教學(xué)科研辦公室,4第五附屬醫(yī)院病理科, 5第五附屬醫(yī)院超聲科, 烏魯木齊　830011)

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·民族腫瘤學(xué)·

Thrsp蛋白在乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株中表達(dá)及鑒定

王霞1, 呂蒙2, 徐虓3, 劉志英4, 高曉麗5

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第五附屬醫(yī)院藥劑科,2附屬腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,3第五附屬醫(yī)院教學(xué)科研辦公室,4第五附屬醫(yī)院病理科,5第五附屬醫(yī)院超聲科, 烏魯木齊830011)

目的鑒定Thrsp甲狀腺激素應(yīng)答蛋白( Thrsp, S14 )在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞株中的表達(dá)，并建立2株細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線，為研究甲狀腺激素應(yīng)答蛋白在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移增殖中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法取對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞，用CCK8法檢測，用Excel自帶統(tǒng)計軟件求平均值并繪制生長曲線。細(xì)胞爬片，Thrsp蛋白免疫組化SP法染色，DBA顯色，顯微鏡下觀察，采用Western Blot法檢測2株細(xì)胞中Thrsp蛋白表達(dá)及相對量。結(jié)果連續(xù)培養(yǎng)72 h MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞株達(dá)到對數(shù)生長期。Thrsp蛋白在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中呈弱陽性表達(dá)，在MCF-7中呈陽性表達(dá)。Thrsp蛋白電泳大小位于17 ku。MBA-MD-231細(xì)胞株中Thrsp蛋白表達(dá)水平低于MCF-7細(xì)胞株,與免疫組化結(jié)果一致。 結(jié)論Luminal A乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞株中Thrsp蛋白表達(dá)正常；Basal細(xì)胞株MDA-MB-231中Thrsp蛋白表達(dá)下調(diào)。

乳腺癌； MCF-7； MDA-MB-231； Thrsp蛋白

全球癌癥報告最新版中指出乳腺癌占女性惡性腫瘤的29%[1]，已經(jīng)成為影響女性健康的第一殺手[2]。新疆乳腺癌的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢。臨床上觀察發(fā)現(xiàn)維吾爾族乳腺癌具有從發(fā)現(xiàn)包塊至就診的間隔時間長、腫瘤較大、臨床分期較晚、3年生存率和5年生存率低的特點[3-4]。甲狀腺激素可通過甲狀腺激素應(yīng)答蛋白(Thyroid hormone-responsive spot 14 protein，S14 )作用于乳腺癌細(xì)胞，但具體的機(jī)制尚不清楚[5]。THRSP在乳腺癌組織中往往呈現(xiàn)高表達(dá)，關(guān)于甲狀腺激素在乳腺癌晚期患者中的治療價值也存在不一致的報道。Zhu等[6]發(fā)現(xiàn)Thrsp是乳汁中脂質(zhì)合成所必需的，影響著乳腺上皮細(xì)胞的增殖。THRSP在乳腺癌細(xì)胞株T47D(人脂肪合成細(xì)胞株)中過表達(dá)可加速腫瘤細(xì)胞生長，其表達(dá)缺失會使細(xì)胞生長停滯并誘導(dǎo)凋亡[7]。侵襲性乳腺癌病人低水平表達(dá)的Thrsp蛋白與無病長期生存狀態(tài)有關(guān)，而Thrsp蛋白高表達(dá)標(biāo)識乳腺癌的高風(fēng)險，提示預(yù)后不良[8]。Sanchez-Rodriguez等[9]發(fā)現(xiàn)，Thrsp蛋白過表達(dá)，抑制了癌細(xì)胞的增殖和非錨定依賴性生長，誘導(dǎo)了乳腺癌細(xì)胞分化和死亡，使乳腺癌活細(xì)胞數(shù)量明顯減少。其結(jié)果與其他細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或THRSP敲除所觀察的凋亡現(xiàn)象不符合。在人類乳腺癌組織中觀察結(jié)果也強(qiáng)烈表明了相反的結(jié)論，該研究組運用的組織培養(yǎng)體系可能沒有真實地模擬人類乳腺癌。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌晚期患者大多有甲狀腺功能低下。甲狀腺激素不是乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的主導(dǎo)機(jī)制，但因其參與了乳腺細(xì)胞惡變及轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞能量和新陳代謝的重要方面越來越引起臨床醫(yī)生的注意。

本研究以乳腺癌細(xì)胞系中典型的LuminalA乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和Basal細(xì)胞株MDA-MB-231[10]為研究對象，體外培養(yǎng)并鑒定2株細(xì)胞中甲狀腺激素應(yīng)答蛋白(Thrsp)的表達(dá)，為進(jìn)一步研究甲狀腺激素及甲狀腺激素應(yīng)答蛋白在乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移增殖中的作用及機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1實驗材料人MCF-7、人MDA-MB-231細(xì)胞株均購自南京凱基生物有限公司。

1.2主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (上海力康儀器有限公司Smart Cell HF-90)，熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司 Eclipse)，全光柵酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司X-marktm)，電子分析天平(德國梅特勒 AB304-S)，化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司Chemiscope 3000)，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(Mini-PROTEAN Tetra system ，Bio-Rad， USA)。

1.3主要試劑胎牛血清(美國Life technologies公司)，DMEM(高糖)(美國Life technologies公司)，0.25%胰酶(美國Life technologies公司)，青霉素-鏈霉素雙抗(10000U)(美國Hyclone公司)，CCK8試劑(上海貝博生物試劑公司)，Anti-THRSP antibody(Abcam)，β-actin(Abcam)，BCA Protein Assay Kit(Beijing Tiangen)， PVDF Transfer Membrane (0.45 μm) (Millipore)。

1.4MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞生長曲線的繪制取生長良好的MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞，用DMEM完全培養(yǎng)基制備成 5×104/mL單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中(100 μL/孔，即每孔5×103個細(xì)胞/孔)，分別培養(yǎng)6 h及1、2、3、4、5、6 d，每組5個重復(fù)，用CCK8試劑檢查OD450值，以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)擬合細(xì)胞生長曲線。

1.5MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株Thrsp蛋白表達(dá)免疫組化及Western Blot鑒定取對數(shù)生長期細(xì)胞胰酶消化后計數(shù)重懸于完全培養(yǎng)基中，在6孔板中滴入少許培養(yǎng)基后放入蓋玻片，每孔加入2 mL 5×105/mL細(xì)胞懸液。37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h 貼壁，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出蓋玻片，PBS洗2遍后用4%的多聚甲醛室溫固定15 min。漂洗晾干后1% TritonX-100 37℃通透30 min，PBS清洗2遍。加入3%過氧化氫15 min，PBS清洗2遍。滴加一抗Thrsp (1∶200)， 4℃過夜，加通用型生物素化二抗，室溫孵育15 min。DAB顯色，蘇木素染色，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。常規(guī)裂解乳腺癌細(xì)胞，按照Western Blot標(biāo)準(zhǔn)實驗步驟點樣、轉(zhuǎn)膜。β-actin抗體濃度為1∶5 000，Thrsp蛋白抗體濃度為1∶500；二抗孵育后顯色，顯色后用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測、拍照，計算目的蛋白的積分光密度值，并與β-actin比較，計算目的蛋白的表達(dá)豐度。

1.6Thrsp陽性表達(dá)判斷標(biāo)準(zhǔn)高倍鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)粗大棕黃色顆粒定為陽性表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)少量細(xì)小棕黃色顆粒定為弱陽性表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)無棕黃色顆粒定為陰性表達(dá)。

2　結(jié)果

2.1MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株標(biāo)準(zhǔn)生長曲線由細(xì)胞培養(yǎng)曲線可以看出連續(xù)培養(yǎng)72 h， 2株細(xì)胞均達(dá)到對數(shù)生長期，生長良好(圖1)，可用于進(jìn)一步實驗。

2.2MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株的Thrsp蛋白免疫組化鑒定結(jié)果在MDA-MB-231中PBS代替一抗Thrsp蛋白不顯色，細(xì)胞胞漿內(nèi)未見棕黃色顆粒(圖a、b)； Thrsp蛋白在乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231中呈弱陽性表達(dá)，胞漿內(nèi)可見細(xì)小棕黃色顆粒(圖c、d )。在MCF-7中PBS代替一抗Thrsp蛋白不顯色，細(xì)胞胞漿內(nèi)未見棕黃色顆粒(圖e、f)； Thrsp蛋白在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中呈陽性表達(dá)，胞漿內(nèi)可見粗大棕黃色顆粒(圖g、h)。

a： MDA-MB-231細(xì)胞陰性對照(×100)

b： MDA-MB-231細(xì)胞陰性對照( ×400)

c： MDA-MB-231細(xì)胞弱陽性表達(dá)Thrsp(×100)

d： MDA-MB-231細(xì)胞弱陽性表達(dá)Thrsp(×400)

e： MCF-7細(xì)胞陰性對照(×100)

f： MCF-7細(xì)胞陰性對照(×400)

g： MCF-7細(xì)胞陽性表達(dá)Thrsp(×100)

h： MCF-7細(xì)胞陽性表達(dá)Thrsp(×400 )

圖2MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株的Thrsp蛋白免疫組化鑒定結(jié)果

2.3MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株THRSP蛋白Western Blot電泳檢測結(jié)果Thrsp蛋白電泳大小位于17 ku，在MCF-7細(xì)胞株條帶明顯，在MDA-MB-231條帶欠明顯，見圖3。

1： MCF7細(xì)胞株Thrsp蛋白的表達(dá); 2： MBA-MD-231細(xì)胞株Thrsp蛋白的表達(dá)

圖3不同樣本Thrsp蛋白的表達(dá)(β-actin作為內(nèi)參照)

2.4MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株Thrsp蛋白半定量灰度值分析結(jié)果MCF-7 Thrsp/β-actin蛋白半定量灰度值分析結(jié)果為(0.460 3±0.0 162)； MBA-MD-231 Thrsp/β-actin蛋白半定量灰度值分析結(jié)果為(0.134 0±0.0 149)，低于MCF-7細(xì)胞株的表達(dá)，與免疫組化結(jié)果一致，見表1，圖4。

細(xì)胞株Thrspβ-actionThrsp/β-actionMCF-792318±32482005480.4603±0.0162MBA-AD-23128368±31602116140.1340±0.0149t值31.55133.113P值<0.001<0.001

3　討論

國內(nèi)外許多研究表明，THRSP基因是調(diào)控蘋果酸酶及脂肪酸合成酶等脂肪生成酶活性的轉(zhuǎn)錄因子，與脂肪肝、肥胖、糖尿病、脂肪代謝相關(guān)腫瘤(尤其是乳腺癌)等關(guān)系密切，然而其確切分子機(jī)制尚不明確[5]。近年來，THRSP基因與脂肪代謝的密切相關(guān)性而逐漸被重視，研究者們期待進(jìn)一步明確其作用機(jī)制，從而為乳腺癌等脂質(zhì)代謝性疾病的治療提供新的方向。本研究針對乳腺癌細(xì)胞系中典型的LuminalA型乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和Basal(三陰)型細(xì)胞株MDA-MB-231[10]為研究對象，通過培養(yǎng)細(xì)胞爬片免疫組化，Western Blot電泳檢測及半定量灰度分析，實驗結(jié)果表明，在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中Thrsp呈陽性表達(dá)，在細(xì)胞株MDA-MB-231中Thrsp呈弱陽性表達(dá)，Thrsp蛋白在MCF-7細(xì)胞株中相對表達(dá)量高于MDA-MB-231細(xì)胞株。由以上實驗結(jié)果推論，ER、PR、Her-2受體完整型乳腺癌細(xì)胞株(LuminalA型乳腺癌細(xì)胞株)MCF-7中Thrsp蛋白表達(dá)正常；ER、PR、Her-2受體缺失型乳腺癌細(xì)胞株(Basal型細(xì)胞株)MDA-MB-231中Thrsp蛋白表達(dá)下調(diào)。

Her-2/neu基因轉(zhuǎn)染的乳腺細(xì)胞cDNA微陣列顯示FAS為Her-2/neu信號的主要目標(biāo)[13]。增加HER2/neu陽性細(xì)胞中FAS的mRNA的表達(dá)，THRSP基因表達(dá)亦增加[14]。然而，Hilvo等[15]使用超高效液相色譜/質(zhì)譜法獲取了267例乳腺癌組織的綜合脂類組學(xué)并聯(lián)合免疫組化方法，發(fā)現(xiàn)FAS與HER2狀態(tài)間并沒有重要聯(lián)系。本研究顯示，ER、PR、Her-2受體完整型乳腺癌細(xì)胞MCF-7 Thrsp蛋白陽性表達(dá)，而ER、PR、Her-2受體缺失型細(xì)胞株MDA-MB-231 Thrsp蛋白表達(dá)較低，Thrsp蛋白與ER、PR、Her-2受體之間的聯(lián)系尚待進(jìn)一步研究的證實。孕激素和活性SREBP- 1c在乳腺癌細(xì)胞中協(xié)同誘導(dǎo)S14和FAS[16]。隨后，Weels等[17]分析了131例乳腺癌組織中Thrsp和FAS表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Thrsp高表達(dá)不受性類固醇激素受體、HER2/neu或cyclin D1指定。

本課題組之前研究利用免疫組化方法研究了112例乳腺癌組織中Thrsp蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)人乳腺癌組織中Thrsp蛋白的表達(dá)與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物(ER、PR、Her-2)及基因分型間無顯著相關(guān)性[18]。對于分子生物學(xué)水平的研究與部分臨床病理參數(shù)之間的不一致性還有待進(jìn)一步研究。

Thrsp在脂肪合成的人乳腺癌細(xì)胞株(T47D)中過表達(dá)加速腫瘤細(xì)胞生長，其表達(dá)缺失會使細(xì)胞生長停滯并誘導(dǎo)凋亡[7]。低水平的Thrsp與侵襲性乳腺癌病人無病長期生存狀態(tài)有關(guān)，而Thrsp高表達(dá)標(biāo)識乳腺癌的高風(fēng)險，提示預(yù)后不良[8]。然而，Sanchez-Rodriguez等[9]觀察到Thrsp過表達(dá)抑制了癌細(xì)胞的增殖和非錨定依賴性生長，誘導(dǎo)了癌細(xì)胞分化和死亡，活癌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，這一結(jié)果不符合于其他細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)或Thrsp敲除所觀察的凋亡現(xiàn)象；在實際的人類乳腺癌觀察結(jié)果也強(qiáng)烈表明了相反的結(jié)論。Sanchez-Rodriguez等[9]研究組運用的組織培養(yǎng)體系可能沒有真實地模擬人類乳腺癌。對此，目前實驗研究證實FAS抑制劑可通過減少腫瘤組織中脂肪形成抑制腫瘤生長[19-20]。相信THRSP基因在脂質(zhì)合成表型乳腺癌的研究將會成為未來一大熱點，尤其是針對于THRSP基因的抗腫瘤藥物的研發(fā)會是人類克服乳腺癌的福音。

THRSP的編碼基因位于染色體11q13上，此處的基因通常在乳腺癌中高表達(dá)，因此THRSP又被認(rèn)為可能在這類腫瘤中起著控制代謝和生長的作用。目前對于Thrsp蛋白參與脂肪酸合成及參與乳腺癌的發(fā)生及發(fā)展得到較多分子生物研究層面的支持。但是Thrsp蛋白調(diào)控的具體生物化學(xué)機(jī)制尚不明確，如何參與調(diào)控脂肪合成、抑制腫瘤細(xì)胞生長和誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制、Thrsp蛋白是否可以作為乳腺癌潛在的治療靶點等等問題需要進(jìn)一步研究去解決。

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(本文編輯楊晨晨)

Expression and identification of Thrsp protein in breast cancer MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines

WANG Xia1, LV Meng2, XU Xiao3, LIU Zhiying4, GAO Xiaoli5

(1DepartmentofPharmacy，theFifthAffiliatedHospital；2DepartmentofNuclearMedicine,AffiliatedTumourHospital;3DepartmentofTeachingandResearch,TheFifthAffiliatedHospital;4DepartmentofPathology,TheFifthAffiliatedHospital,5DepartmentofUltrasonography,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo identify the expression of thyroid hormone responsive prote (Thrsp) in MCF-7 and MDA-MB-231 cell Lines of breast cancer. The standard growth curve of the 2 cell line was established. In order to lay the foundation for the founction and mechanism of transfer and proliferation of the breast cancer cell lines by Thrsp protein. MethodsTo select breast cancer MCF-7, MDA-MB-231 cells in the logarithmic growth phase, detected by CCK8 method, using Excel to calculate the mean value and built the growth curve, the cell climbing piece, Thrsp protein was stained by immunohistochemistry SP method, DBA coloration, observed by microscope, the Western Blot method was used to detect the expression and the relative amount of Thrsp protein in 2 cells. ResultsContinuous culturing for 72 hours, MCF-7 and MDA-MB-231 cell line were reaching the logarithmic growth phase. Thrsp protein were expressed weakly positive in MBA-MD-231,and positive in MCF-7. The electrophoresis size of Thrsp protein were 17 ku. The expression of Thrsp protein in MBA-MD-231 were a bit lower than that in MCF-7 which were tested by Western-blot. And the results were consistent with immunohistochemical results. ConclusionThrsp protein was expressed normally in Luminal A breast cancer MCF-7cell line. Thrsp protein was expressed a bit lower in Basal-like cell line MDA-MB-231.

breast cancer; MCF-7; MDA-MB-231; Thrsp protein identification

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211C128)

王霞(1976-)，女，碩士，副主任藥師，副教授,研究方向：乳腺癌、甲狀腺癌分子致病機(jī)制及藥學(xué)應(yīng)對策略。

徐虓，男，博士，副主任醫(yī)師，副教授, 研究方向：乳腺癌、甲狀腺癌分子致病機(jī)制及應(yīng)對策略，E-mail：329590035@qq.com。

R73-35; R73-37

A

1009-5551(2016)06-0692-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.007

2016-03-21]