張　晗,張安星,高　琳,陽　琰,廖　鑫,李明澤,楊孟雪

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州遵義 563003)

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論著·基礎(chǔ)研究

糖尿病大鼠骨骼肌內(nèi)脂素和磷脂酰肌醇3激酶的表達*

張晗,張安星,高琳△,陽琰,廖鑫,李明澤,楊孟雪

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，貴州遵義 563003)

目的觀察糖尿病大鼠骨骼肌中內(nèi)脂素(visfatin)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的表達，探討visfatin在糖尿病中的作用及可能機制。方法8周齡雄性SD大鼠55只(造模成功39只)，采用隨機數(shù)字表法分為4組：正常對照組(A組)10只，飲食誘導肥胖組(B組)10只，血糖未控制糖尿病組(C組)10只，血糖控制糖尿病組(D組)9只。喂養(yǎng)至12周末，測定空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)、空腹胰島素(FINS)，計算穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)及胰島素敏感指數(shù)(ISI)；RT-PCR測定骨骼肌組織visfatin、PI3K mRNA表達；Western blot測定骨骼肌組織visfatin、PI3K蛋白表達。結(jié)果C組FBG較A、B組明顯增高(P<0.01)；D組FBG較C組明顯降低(P<0.01)。B組TG較A組明顯增高(P<0.05)；C組TG、TC、LDL-C、FFA較A、B組明顯增高(P<0.01)；D組TG、TC、FFA較A組明顯增高(P<0.05)；D組TG較A、B組明顯增高(P<0.05)；D組TG、TC、LDL-C、FFA較C組明顯降低(P<0.01)。B、C組較A組FINS、HOMA-IR明顯增高，ISI明顯降低(P<0.01)，C組較B組FINS、HOMA-IR明顯增高，ISI明顯降低(P<0.01)。C、D組visfatin mRNA和蛋白表達較A組均明顯增高(P<0.05)，C組visfatin蛋白較B組明顯增高(P<0.01)。C組PI3K mRNA和蛋白表達較A、B組均明顯降低(P<0.01)，D組PI3K mRNA和蛋白表達較A組均明顯降低(P<0.05)。結(jié)論visfatin在骨骼肌中的表達水平與骨骼肌糖脂代謝狀態(tài)有關(guān)，可能通過PI3K參與骨骼肌糖脂代謝的調(diào)節(jié)。

1-磷脂酰肌醇3-激酶；糖尿??；肥胖癥；肌,骨骼；內(nèi)臟脂肪素；SD大鼠

我國糖尿病患者群數(shù)量占據(jù)全球的1/3，極大地加重了社會及家庭的負擔，但該病的發(fā)病機制至今尚未完全闡明。內(nèi)脂素(visfatin)主要在內(nèi)臟脂肪中高表達，在肝臟、骨骼肌等組織中亦有表達[1]。visfatin作為胰島素抵抗(IR)、糖尿病及其他代謝性疾病的影響因素，已成為近年來研究的熱點。眾多研究均認為其在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中具有一定作用，但關(guān)于visfatin與肥胖、糖脂代謝、IR的關(guān)系一直存有爭議，具體作用機制尚不明確。開展visfatin的相關(guān)研究對于糖尿病的發(fā)病機制、預(yù)防及治療具有重要意義。

骨骼肌作為胰島素的主要靶器官之一，是機體廓清葡萄糖最主要的組織，能攝取、消耗人體80%～90%的葡萄糖[2]，其糖代謝狀態(tài)與機體IR密切相關(guān)。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)是胰島素信號傳導級聯(lián)反應(yīng)中關(guān)鍵信息分子，介導胰島素刺激葡萄糖的轉(zhuǎn)運和攝取。本實驗通過建立肥胖大鼠及糖尿病大鼠模型，予胰島素進行干預(yù)使各組大鼠處于不同的血糖水平，觀察各組大鼠骨骼肌組織中visfatin、PI3K的基因及蛋白表達的變化，以進一步了解visfatin在骨骼肌糖脂代謝中的作用、與PI3K的關(guān)系及作用機制，以期為糖尿病的發(fā)病機制及治療提供新的視點。

1　材料與方法

1.1材料8周齡健康雄性SD 大鼠55只，體質(zhì)量(200±20)g，購自第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所動物實驗中心，動物許可證號為SCXK(渝)2007-0005。

1.2方法

1.2.1分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按照數(shù)字隨機表法分為4組：正常對照組(A組)10只，飲食誘導肥胖組(B組)15只，血糖未控制糖尿病組(C組)15只，血糖控制糖尿病組(D組)15只。A組和B、C、D組大鼠分別采用普通飼料和高脂高糖飼料喂養(yǎng)。以空腹體質(zhì)量大于A組平均體質(zhì)量的20%即作為B組大鼠造模成功標準，共計成模10只。8周后C、D組禁食12 h測空腹體質(zhì)量，按40 mg/kg的體質(zhì)量標準一次性腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素(STZ)，A、B組按40 mg/kg的標準腹腔內(nèi)注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.1 mmol/L，pH 4.4)，以2次空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L作為C組成模標準，共計成模10只。D組大鼠糖尿病成模后予腹部皮下注射低精蛋白鋅胰島素注射液進一步建立D組大鼠模型，以FBG<11.1 mmol/L作為成模標準，共計成模9只。

1.2.2標本留取各組大鼠喂養(yǎng)至12周末，麻醉狀態(tài)下腹主動脈取血，用于血脂、胰島素測定。分離大鼠右后肢股四頭肌組織并置于Trizol中，后轉(zhuǎn)移保存于-80 ℃冰箱，以備后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)測定visfatin、PI3K的基因表達；其余置于液氮罐中，移入-80 ℃冰箱凍存用于Western blot測定visfatin、PI3K的蛋白表達。

1.2.3生化指標及胰島素測定使用強生穩(wěn)步倍加型血糖儀及配套試紙測定FBG。使用AU2700型全自動生化檢測儀檢測血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，酰基輔酶A氧化酶比色法測游離脂肪酸(FFA)；采用放射免疫法(RIA)測定血清空腹胰島素(FINS)，變異系數(shù)小于5%。穩(wěn)態(tài)模型評估的IR指數(shù)(HOMA-IR)=FBG×FINS/22.5；胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/(FINS×FBG)。

1.2.4骨骼肌visfatin基因、蛋白測定

1.2.4.1RT-PCR法測骨骼肌組織visfatin、PI3K mRNA表達從-80.0 ℃冰箱中取出含有1 mL Trizol液體的骨骼肌(約50 mg)，采用Trizol一步法提取總RNA。按照說明書進行逆轉(zhuǎn)錄上述液體混勻后放入Mastercycler Gradient PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第1鏈。反應(yīng)分為兩個階段：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)階段(37.0 ℃，15 min)和逆轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)階段(85.0 ℃，5 s),選取61.6 ℃為各引物退火溫度。分別以各組cDNA為模板進行擴增，以β-actin為內(nèi)參，引物由TaKaRa生物工程公司合成。由GeneBank查出相關(guān)引物序列。visfatin正義鏈5′-TAC TGT GGC GGG AAT TGC TCT AA-3′，反義鏈5′-CCA CAG ACA CAG GCA CTG ATG A-3′；PI3K 正義鏈5′-AGC TCC TGG AAG CCA TTG AGA A-3′，反義鏈5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′；β-actinz正義鏈5′-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3′，反義鏈5′-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3′。

1.2.4.2Western blot法測骨骼肌組織visfatin、PI3K蛋白表達分別提取各組骨骼肌組織，使用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后剪碎，加入RIPA強效裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)，超聲震碎，裂解4 ℃勻漿，提取上清液按BCA法測定蛋白濃度。蛋白變性(100 ℃，5 min)后上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入visfatin一抗過夜孵育后，加入二抗搖床中孵育1 h，洗膜，顯影。電泳電轉(zhuǎn)使用美國BIO-RAD公司電泳系統(tǒng)，visfatin抗體由美國Biovision公司提供。骨骼肌組織PI3K及其對應(yīng)的β-actin蛋白檢測步驟同上。凝膠成像系統(tǒng)拍照，掃描蛋白條帶灰度值并定量分析。

2　結(jié)　　果

2.14組大鼠一般及生化指標比較B、D組大鼠內(nèi)臟脂肪重量/體質(zhì)量較A組明顯增高(P<0.01)，C、D組大鼠內(nèi)臟脂肪重量/體質(zhì)量較B組明顯降低(P<0.01)，D組大鼠內(nèi)臟脂肪重量/體質(zhì)量較C組明顯增高(P<0.01)；C組FBG 較A、B組明顯增高(P<0.01)，D組FBG較C組明顯降低(P<0.01)；B組TG較A組明顯增高(P<0.05)，C組TG、TC、LDL-C、FFA較A、B組均明顯增高(P<0.01)，D組TG較B組明顯增高(P<0.05)，D組TG、TC、LDL-C、FFA較C組明顯降低(P<0.01)。B、C組較A組FINS、HOMA-IR明顯增高，ISI明顯降低(P<0.05)，C組較B組FINS、HOMA-IR明顯增高，ISI明顯降低(P<0.01)，見表1。

2.24組大鼠骨骼肌visfatin、PI3K mRNA和蛋白表達比較C、D組visfatin mRNA和蛋白表達較A組均明顯增高(P<0.05)，C組visfatin蛋白較B組明顯增高(P<0.01)。C組PI3K mRNA和蛋白表達較A、B組均明顯降低(P<0.01)，D組PI3K mRNA和蛋白表達較A組均明顯降低(P<0.05)，見表2、圖1。

表1　　4組大鼠一般指標及生化指標比較±s)

續(xù)表1　　4組大鼠一般指標及生化指標比較±s)

-：無數(shù)據(jù)。a:P<0.05，b:P<0.01，與A組比較；c:P<0.05，d:P<0.01，與B組比較；e:P<0.01，與C組比較。

表2　　4組大鼠骨骼肌visfatin、PI3K mRNA和蛋白表達比較

a:P<0.05，b:P<0.01，與A組比較；c:P<0.01，與B組比較。

圖1　　4組大鼠骨骼肌組織visfatin和PI3K蛋白表達比較

3　討　　論

近年的研究表明，visfatin與糖尿病和IR關(guān)系密切，提示visfatin可能通過與胰島素不同的結(jié)合部位和作用方式激活胰島素受體(InsR)，進而激活胰島素信號轉(zhuǎn)導通路，發(fā)揮類胰島素樣作用[1]。2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病基礎(chǔ)是骨骼肌、脂肪、肝臟的IR和胰島素β細胞功能缺陷，visfatin在骨骼肌、肝臟、骨髓、胎膜等組織中均有表達。本實驗以高脂高糖飲食聯(lián)合腹腔注射小劑量STZ建立糖尿病大鼠模型，實驗發(fā)現(xiàn)C、D兩組糖尿病大鼠骨骼肌組織visfatin mRNA表達量較A組均明顯增高，C組visfatin蛋白表達量較A、B組均明顯增高，可能是由于代償性的高胰島素血癥未能將血糖維持在正常水平，骨骼肌中visfatin表達增加或許是血糖增高的一種代償，而胰島素干預(yù)治療后糖脂代謝紊亂得到了明顯改善，骨骼肌visfatin基因和蛋白表達較C組并無明顯變化，visfatin并不隨機體糖代謝變化而發(fā)生急劇變化，前期研究也驗證了這點。Harasim等[3]在體外培養(yǎng)比目魚肌和伸趾長肌兩種骨骼肌細胞，用胰島素、visfatin及兩者聯(lián)合分別進行孵育，發(fā)現(xiàn)visfatin僅在伸趾長肌細胞中增加了骨骼肌的葡萄糖轉(zhuǎn)運，且轉(zhuǎn)運作用遠低于胰島素，提示visfatin在骨骼肌糖代謝中并不起主要作用，可能 visfatin在骨骼肌葡萄糖代謝中的作用十分有限，這與本實驗的研究一致，畢竟生理狀態(tài)下血漿中visfatin濃度僅為胰島素濃度的3%～10%。研究亦顯示小鼠血漿visfatin在糖負荷前后無明顯改變，短暫的血糖改變對其并無影響[1]。但Krzysik-Walker等[4]對4周齡、8周齡小雞的研究發(fā)現(xiàn)，相對于內(nèi)臟脂肪組織，骨骼肌visfatin表達水平明顯增高，且8周齡高于4周齡，考慮與此時期肌肉快速增長有關(guān)，進而提示visfatin可能作為一種肌肉來源的脂肪因子影響骨骼肌生長代謝及胰島素敏感性。骨骼肌visfatin的表達和作用可能與物種、骨骼肌種類等因素均有關(guān)，關(guān)于骨骼肌visfatin的產(chǎn)生、作用及作用機制均有待于進一步深入研究。后續(xù)試驗將進一步觀察visfatin在KKAy小鼠骨骼肌中的表達，對其在骨骼肌的糖脂代謝機制作更進一步的探討。

研究證實血和骨骼肌中FFA異常聚集可導致骨骼肌IR，肥胖、糖耐量異常，T2DM患者肌細胞內(nèi)脂質(zhì)水平均較健康者增高，且隨其水平逐漸增高，機體胰島素敏感性呈下降趨勢[5]。前期實驗中T2DM大鼠血漿visfatin和血清FFA較A組均明顯增高，且兩者呈顯著正相關(guān)，與本實驗結(jié)果一致。骨骼肌中visfatin表達水平的增高可能是機體對FFA異常蓄積所致的骨骼肌IR的一種拮抗機制。visfatin可顯著增加前脂肪細胞中TG的合成和聚集，并增強過氧化物酶體增生物激活受體γ激動劑(PPAR-γ)、脂肪酸合成酶、脂聯(lián)素等脂肪標記物的表達，提示visfatin可能通過自分泌或旁分泌作用于脂肪組織[1,6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)visfatin在B組大鼠骨骼肌中的表達較A組雖有增高趨勢而差異無統(tǒng)計學意義，這與Kloting等[8]的研究結(jié)論一致。雖然本實驗中骨骼肌visfatin表達量在B組與A組間無明顯差異，但這并不能代表機體整體visfatin水平與肥胖的關(guān)系，可能 visfatin主要在內(nèi)臟脂肪中高表達，而骨骼肌中表達較少，其機制需要更深入的研究。

骨骼肌是機體廓清葡萄糖最主要的組織[3]，研究顯示T2DM大鼠骨骼肌和肝臟組織中PI3K基因表達調(diào)控有缺陷[9]，肥胖的T2DM大鼠骨骼肌中PI3K活性降低且P85α亞基表達減少[10]，高脂飲食誘導的IR小鼠骨骼肌中PI3K基因表達明顯降低[11]。visfatin的分泌通過PI3K和蛋白激酶B途徑，受胰島素和葡萄糖的調(diào)控，葡萄糖可增加體外培養(yǎng)的人皮下脂肪細胞visfatin的表達，添加PI3K抑制劑共培養(yǎng)可減弱葡萄糖對visfatin表達的促進作用，提示PI3K信號通路參與visfatin表達調(diào)控[12]。糖尿病Wistar大鼠存在PI3K蛋白表達缺損，腹腔注射visfatin重組蛋白后PI3K和GLUT4蛋白水平增高[13]。本實驗中與A、B組相比較，C組骨骼肌visfatin蛋白表達明顯增高，同時PI3K mRNA和蛋白表達明顯降低，D組PI3K mRNA表達較A組降低，visfatin可能與胰島素信號調(diào)節(jié)通路及其糖脂代謝有一定關(guān)系。

綜上所述，糖尿病大鼠骨骼肌visfatin的基因及蛋白表達均明顯增高，可能在IR及糖尿病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。visfatin可能通過PI3K途徑參與骨骼肌糖脂代謝的調(diào)節(jié)，進一步深入研究可能為糖尿病預(yù)防和治療提供新的思路。

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The expression of visfatin and phosphatidylinositol 3-kinase isoforms in skeletal muscle of diabetic rats*

ZhangHan,ZhangAnxing,GaoLin△,YangYan,LiaoXin,LiMingze,YangMengxue

(DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563003，China)

ObjectiveTo observe the expression of visfatin and phosphatidylinositol 3-kinase isoforms(PI3K) in skeletal muscle of diabetic rats,and to explore the function and the possible mechanism of visfatin in diabetes mellitus.MethodsThirty-nine 8-week-old male SD rats were randomly divided into four groups which were normal control group (group A,n=10),diet-induced obesity group (group B,n=10),blood glucose not control diabetes group (group C,n=10) and blood glucose control diabetes group(group D,n=9).After 12 weeks fed,FBG,triglyceride(TG),total cholesterol(TC),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C),free fat acid(FFA) and fasting insulin(FINS) were measured.The homeostasis model assessment (HOMA-IR) and insulin sensitivity index(ISI) were calculated.The expression of visfatin and PI3K mRNA in skeletal muscle tissue were detected by RT-PCR,and the expression of visfatin and PI3K protein were determined by Western blot.ResultsFBG of group C was significantly higher than those of group A and B(P<0.01);FBG of group D was significantly lower than that of group C(P<0.01);TG of group B was significantly higher than that of group A(P<0.05).TG,TC,LDL-C,FFA of group C was significantly higher than those of group A and B(P<0.01);TG,TC,FFA of group D was significantly higher than those of group A(P<0.05);TG of group D was significantly higher than those of group A and B(P<0.05);TG,TC,LDL-C,FFA of group D was significantly lower than those of group C(P<0.01).Comparing with group A,FINS,HOMA-IR of group B and C were significantly higher and ISI were significantly lower (P<0.01);comparing with group B,FINS,HOMA-IR of group C was significantly higher and ISI was significantly lower (P<0.01).The expression of visfatin mRNA and protein in skeletal muscle of group C and D were significantly higher than those of group A (P<0.05),while visfatin protein of group C was significantly higher than that of group B(P<0.01).The expression of PI3K mRNA and protein in skeletal muscle of group C were lower than those of group A and B(P<0.01),PI3K mRNA and protein of group D were lower than those of group A(P<0.05).ConclusionThe expression level of visfatin in skeletal muscle is relevant to skeletal muscle glucose and lipid metabolism state.Visfatin might involved in glucose and lipid metabolism regulation through PI3K in skeletal muscle.

1-phosphatidylinositol 3-kinase；diabetes mellitus；obesity；muscle,skeletal；visfatin；SD rats

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.14.006

貴州省社會發(fā)展攻關(guān)項目[SY(2013)3033]；貴州省科技合作項目[(2010)7004]。作者簡介：張晗(1986-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事糖尿病及并發(fā)癥研究?！?/p>

，E-mail:lgzymc@sina.com。

R587.1

A

1671-8348(2016)14-1889-04

2015-11-15

2016-01-25)