牛燕燕，鄭彩娟，羅由萍

(海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南　?？凇?70100)

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電噴霧質(zhì)譜技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用*

牛燕燕，鄭彩娟，羅由萍

(海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海南?？?70100)

電噴霧電離技術(shù)(Electrospray ionization, ESI)是具有高靈敏度的氣相離子軟電離技術(shù)。結(jié)合中藥有效成分復(fù)雜，含量低等特點(diǎn)，從化合物結(jié)構(gòu)分析、中藥質(zhì)量控制和藥物代謝三方面闡述了ESI-MS技術(shù)在中藥分析領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。通過(guò)分析離子裂解途徑，對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)一步確認(rèn)，指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)特異性微量化合物；建立中藥有效成分化學(xué)指紋圖譜，對(duì)中藥質(zhì)量快速準(zhǔn)確控制，確保中藥用藥安全；研究化合物體內(nèi)代謝途徑及代謝產(chǎn)物，表征化合物藥理效應(yīng)，指導(dǎo)臨床用藥。

電噴霧電離質(zhì)譜；裂解途徑；質(zhì)量控制；藥物代謝

中藥是我國(guó)古代勞動(dòng)人民在長(zhǎng)期實(shí)踐過(guò)程中積累起來(lái)的寶貴醫(yī)藥遺產(chǎn)，為中華民族的繁衍昌盛做出了重要貢獻(xiàn)，對(duì)世界文明的進(jìn)步產(chǎn)生了積極的影響。我國(guó)幅員遼闊，地域差異顯著，有利于構(gòu)成我國(guó)中藥資源的多樣性。因?yàn)橹兴幊煞謴?fù)雜，有效成分含量低，各組分性質(zhì)各異，對(duì)環(huán)境(如溫度、濕度等)較為敏感[1]，近年來(lái)，一些新型的分析方法和實(shí)驗(yàn)手段應(yīng)用于中藥研究領(lǐng)域，使得其分析的有效成分種類不斷拓展，分析速度和準(zhǔn)確性也不斷提高。電噴霧電離質(zhì)譜(Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS)是一種大氣壓軟電離質(zhì)譜技術(shù)，具有準(zhǔn)確性高、分析速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，特別是各種高效分離技術(shù)與多種模式的質(zhì)譜掃描技術(shù)聯(lián)用，已成為分離分析復(fù)雜樣品的首選方法[2-3]。

1　電噴霧電離原理

典型的ESI離子源是一個(gè)金屬毛細(xì)管，樣品溶液從毛細(xì)管端流出并在瞬間受到幾千伏高壓作用，導(dǎo)致待測(cè)樣品以單電荷或多電荷離子形式進(jìn)入高真空離子源。目前，受到廣泛支持的電噴霧離子化原理是“離子蒸發(fā)模型”：在高電場(chǎng)梯度和殼層氣作用下，樣品溶液從毛細(xì)管流出，在電噴霧針出口端形成細(xì)小的帶電液滴，在加熱氣流的作用下，液滴中的溶劑逐漸蒸發(fā)，液滴直徑不斷變小，表面電荷密度增加。當(dāng)液滴表面電荷產(chǎn)生的庫(kù)侖斥力大于液滴表面張力時(shí)，液滴受靜電斥力而分裂成細(xì)小的液滴。這一過(guò)程反復(fù)進(jìn)行，直到離子間的靜電排斥力大到一定程度時(shí)，揮發(fā)度高的離子優(yōu)先從液滴表面射出，形成氣相樣品離子通過(guò)錐孔和聚焦透鏡進(jìn)入質(zhì)譜分析器檢測(cè)。圖1所示為ESI正離子模式電離示意圖。由于待測(cè)樣品在ESI源電離過(guò)程中，不涉及高能量的激發(fā)過(guò)程，不易發(fā)生分解，因此容易得到比較完整的準(zhǔn)分子離子信號(hào)[3-5]。

圖1　ESI正離子模式電離示意圖

2　ESI-MS在中藥分析領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1天然產(chǎn)物分析

中藥化學(xué)組成復(fù)雜，微量成分多，但同類化合物因具有相同母核結(jié)構(gòu)而在質(zhì)譜裂解中往往有一定的規(guī)律可循。結(jié)合已知標(biāo)準(zhǔn)品ESI質(zhì)譜裂解的分析，可以幫助我們確定中藥中某些復(fù)雜的微量化學(xué)成分。同時(shí)，ESI質(zhì)譜還能為有機(jī)化合物提供準(zhǔn)確的分子量信息，對(duì)于大分子化合物(如多肽、蛋白質(zhì)等)，在ESI電離源中可以帶上多電荷，根據(jù)不同電荷數(shù)離子的質(zhì)荷比準(zhǔn)確計(jì)算出大分子化合物的分子質(zhì)量[6-7]。質(zhì)子加合物是ESI-MS軟電離源中常見的準(zhǔn)分子離子之一，質(zhì)子化位點(diǎn)關(guān)系著進(jìn)一步的反應(yīng)機(jī)理，影響對(duì)整個(gè)反應(yīng)步驟的理解[4]，一般認(rèn)為，所有的離子裂解都是在電荷或者游離基中心的誘導(dǎo)下發(fā)生的，各官能團(tuán)的電離能大小影響著分子離子的裂解過(guò)程[8]，因此，確定最有利的質(zhì)子化位點(diǎn)對(duì)于分析碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)過(guò)程中質(zhì)子化分子離子的結(jié)構(gòu)及其隨后的裂解反應(yīng)是非常有幫助的。此外，借助化合物中活潑氫-氘交換(H/D exchange)方法，可以進(jìn)一步探尋化合物更高級(jí)別的結(jié)構(gòu)[9-11]。

孫學(xué)軍等[12]經(jīng)在線串聯(lián)LC-ESI-MS建立了單糖衍生物的電噴霧質(zhì)譜裂解方法，借助糖類化合物在ESI-MS正離子模式下表現(xiàn)出的質(zhì)子化分子離子峰和ESI-MS/MS條件下呈現(xiàn)出的特征碎片離子峰m/z 473，快速有效地確定出單糖類化合物的組成。李麗等[13]利用LC-MS技術(shù)研究了朝鮮淫羊藿中六個(gè)黃酮類化合物，獲得了這些化合物的分子量信息，并進(jìn)一步借助源內(nèi)CID技術(shù)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明這幾種化合物均產(chǎn)生m/z 531和369的碎片離子峰，結(jié)合文獻(xiàn)對(duì)比，確定這些化合物是以相同的母核(脫水淫羊藿素)為苷元的黃酮類化合物。丁健樺等[14]采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MSn)技術(shù)，結(jié)合H/D交換方法，研究L-抗壞血酸質(zhì)譜行為，實(shí)驗(yàn)表明毛細(xì)管溫度對(duì)L-抗壞血酸的裂解方式產(chǎn)生顯著影響。根據(jù)L-抗壞血酸特征碎片離子，提出了其結(jié)構(gòu)變化和降解反應(yīng)的可能機(jī)制和基本規(guī)律，為現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)快速測(cè)定復(fù)雜基體樣品中的痕量 L-抗壞血酸奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。L-抗壞血酸在CID裂解時(shí)，受其他基團(tuán)誘導(dǎo)效應(yīng)的影響，碳原子上的羥基極易接受質(zhì)子成為質(zhì)子化的活性位點(diǎn)，并丟失水分子形成伯碳正離子過(guò)渡態(tài)，進(jìn)一步氫重排，形成新的更加穩(wěn)定的碳正離子。同時(shí)，L-抗壞血酸在MS2直接丟失中性碎片CO和CO2，但與脫除H2O相比，所需電離能則要大很多。Iyad Hailat等[15]通過(guò)ESI-IT-MSn直接進(jìn)樣研究了人造黃油和玉米油中脂肪酸甾醇酯的質(zhì)譜行為，實(shí)驗(yàn)表明ESI正離子模式下，加入緩沖劑乙酸銨的脂肪酸甾醇酯極易檢測(cè)到[M+NH4]+加合物，甾醇酯同分異構(gòu)體可以通過(guò)MS2和 MS3碰撞誘導(dǎo)裂解來(lái)確定結(jié)構(gòu)。

2.2質(zhì)量控制

中藥的整體作用特點(diǎn)決定了中藥有別于西藥，其質(zhì)量控制方法對(duì)起效的全成分進(jìn)行有效控制，達(dá)到控制中藥質(zhì)量、保證中藥用藥安全的目的。指紋圖譜質(zhì)控技術(shù)便是有效方法之一[16]，高效的分離方法和質(zhì)譜快速檢測(cè)的分析方法相結(jié)合，提供了準(zhǔn)確、可靠的質(zhì)量控制結(jié)果。

黃昆[17]使用UPLC-MS技術(shù)建立起蘿芙木指紋圖譜的中藥分析方法，不僅節(jié)約了研究時(shí)間和試劑成本，而且較HPLC具有更高的分辨率和準(zhǔn)確度。作者結(jié)合文獻(xiàn)，對(duì)云南蘿芙木甲醇提取物中利血平、育亨賓、蛇根亭堿、阿嗎堿、阿嗎靈、利血胺、羅尼生、坎尼生八個(gè)中藥成分分離并歸屬。其次，對(duì)不同產(chǎn)地的云南蘿芙木指紋圖譜分析，確定了42個(gè)特征指紋峰，其中共有特征峰22個(gè)，并結(jié)合質(zhì)譜和相關(guān)文獻(xiàn)，確定了藥材中部分化學(xué)成分指紋圖譜的歸屬，通過(guò)共有峰面積的比較，說(shuō)明不同產(chǎn)地的云南蘿芙木存在一定的差異，要實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的質(zhì)量控制，就要進(jìn)行基地化建設(shè)。竇建鵬等[18]以朝鮮淫羊藿藥材乙醇提取部分作為考察對(duì)象，建立該藥材的HPLC梯度洗脫指紋圖譜，并采用MSn方法確認(rèn)了13個(gè)共有峰結(jié)構(gòu)，以此作為長(zhǎng)白山區(qū)朝鮮淫羊藿有效成分的質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。周莉莉等[19]利用HPLC-ESI-MSn聯(lián)用技術(shù)，對(duì)傳統(tǒng)中藥山茱萸炮制過(guò)程中環(huán)烯醚萜苷類成分的變化進(jìn)行了研究，C18反相色譜柱二元線性梯度洗脫分離得到7個(gè)環(huán)烯醚萜苷類化合物，并通過(guò)ESI一級(jí)質(zhì)譜獲得了分子量信息，利用CID技術(shù)，獲得了該類化合物負(fù)離子模式下碎裂特征，研究結(jié)果表明，通過(guò)色譜保留時(shí)間、色譜峰面積和質(zhì)譜特征信息能夠提供更加準(zhǔn)確可靠的定性定量結(jié)果。劉悅等[20]應(yīng)用ESI-MSn技術(shù)對(duì)傳統(tǒng)中藥甘遂根中弱極性部分化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定，對(duì)甘遂氯仿提取物全掃描和串聯(lián)質(zhì)譜掃描數(shù)據(jù)分析，共鑒定出39個(gè)化合物，其中包括9個(gè)新化合物。王鵬[21]以蒙古黃芪為原料，研究了黃芪藥材及市售黃芪注射液的特征圖譜，結(jié)果顯示雖然都出現(xiàn)了相應(yīng)的主成分峰，但峰面積比值不同，說(shuō)明中藥注射劑必須在固定的藥材產(chǎn)地和提取工藝等條件下，才能保證中藥注射劑的質(zhì)量穩(wěn)定可控。

2.3藥物代謝和藥物動(dòng)力學(xué)

藥物通過(guò)各種途徑進(jìn)入體內(nèi)后的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)過(guò)程，決定了藥物能否有效到達(dá)目標(biāo)部位并充分發(fā)揮療效。ADME血藥濃度隨時(shí)間變化動(dòng)態(tài)過(guò)程的定量描述即為藥代動(dòng)力學(xué)，對(duì)于闡明中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理具有非常的意義[22]。HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，可直接用于藥物及其代謝產(chǎn)物的分離和鑒定[23]。

Lokiec等[24]采用LC/MS和LC-MS/MS研究了20(S)-喜樹堿的半合成衍生物CPT-11在臨床階段的代謝途徑，發(fā)現(xiàn)了其體內(nèi)代謝的三個(gè)主要反應(yīng)：內(nèi)酯位置的脫羧、7-乙基位置的氧化和二-哌啶側(cè)鏈的多級(jí)氧化。趙宇峰等[25]利用ESI軟電離質(zhì)譜技術(shù)探討了烏頭堿在人腸內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化規(guī)律，根據(jù)正離子電離條件下烏頭類生物堿質(zhì)子化分子[M+H]+提供的分子量信息和精確質(zhì)量測(cè)定提供的元素組成及MSn提供的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)烏頭堿的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物直接進(jìn)行定性分析，研究結(jié)果表明，烏頭堿在人腸內(nèi)細(xì)菌環(huán)境中通過(guò)脫乙?；⒓谆?、羥基和酯化反應(yīng)產(chǎn)生新的單酯型、雙酯型和脂類生物堿等二十余種轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。鐘大放等[26]采用ESI-IT-MS對(duì)人尿樣中羅紅霉素及其十種代謝物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，通過(guò)質(zhì)譜裂解途徑研究發(fā)現(xiàn)，正離子模式下MS2和MS3分別生成脫紅霉糖和脫氨基糖碎片，同時(shí)還觀察到脫含氮烷基側(cè)鏈和一系列質(zhì)荷比相差18的脫水碎片離子，這些特征碎片可用于羅紅霉素及其結(jié)構(gòu)類似物的體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化研究。

3　展　望

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，各種檢測(cè)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)手段的不斷發(fā)展，我們對(duì)中藥化學(xué)成分的研究已取得了大量有意義的結(jié)果，大多數(shù)常用的中藥化學(xué)成分均有文獻(xiàn)報(bào)道[22, 27]，這為中藥現(xiàn)代化研究打下了夯實(shí)的基礎(chǔ)。質(zhì)譜裂解規(guī)律的研究不僅可以幫助我們快速分析和確認(rèn)某些特異性、微量的化合物，同時(shí)對(duì)新化合物的發(fā)現(xiàn)提供了指導(dǎo)依據(jù)。與高效的分離技術(shù)聯(lián)用，可以為復(fù)雜的中藥化合物體系快速分析和中藥有效成分體內(nèi)代謝途徑研究提供準(zhǔn)確可靠的研究基礎(chǔ)，這對(duì)于中藥質(zhì)量控制和指導(dǎo)臨床用藥都具有重要的意義。未來(lái)對(duì)于如何根據(jù)已知的質(zhì)譜裂解實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)歸納出具有廣泛適用性的質(zhì)譜裂解規(guī)律，建立能夠全面反映中藥化學(xué)組成，突出其主要鑒別特征的化學(xué)指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)代謝指紋圖譜來(lái)表征中藥藥理效應(yīng)，都將成為中藥研究發(fā)展的重要課題，也將成為中藥現(xiàn)代化發(fā)展的重要內(nèi)容。

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Application of Electrospray Ionization Mass Spectrometry Technique Used in the Analysis of Traditional Chinese Medicine*

NIUYan-yan,ZHENGCai-juan,LUOYou-ping

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Hainan Normal University, Hainan Haikou 570100, China)

The electrospray ionization (ESI) technique is a gas phase soft ionization technique and it can be used for the sensitive detection of large and small molecules in complex samples without sample pretreatment. ESI-MS technology application and development in the field of traditional Chinese medicine modernization expounded from three aspects: compound structure analysis, traditional Chinese medicine quality control and drug metabolism. It predicted the fragmentation pathway of proton ions and the structure of compound to find specific trace compounds. It could control the quality of traditional Chinese medicine quickly and accurately to ensure drug safety through the establishment of effective component chemical fingerprint. Further more, it could characterize the pharmacological effect and guide the clinical medication through the study of compounds in vivo metabolic pathway and metabolites.

electrospray ionization mass spectrometry; fragmentation pathway; quality control; drug metabolism and pharmacokinetic

海南師范大學(xué)校青年基金(QN1244)。

牛燕燕(1986-)，女，實(shí)驗(yàn)員，主要從事天然產(chǎn)物研究。

羅由萍(1981-)，女，實(shí)驗(yàn)員，主要從事天然產(chǎn)物研究。

O657.63

A

1001-9677(2016)05-0011-03