張善強，李永濤，孫石柱，姚立杰，徐桂清，沈雷

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 解剖教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

論著

神經(jīng)營養(yǎng)因子-3通過W n t通路促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長和成骨分化的研究*

張善強，李永濤，孫石柱，姚立杰，徐桂清，沈雷

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 解剖教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

目的闡明神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞的能力，并分析W n t通路的作用機制。方法正常培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為對照組；NT-3刺激的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為NT-3組；加入I CG-001作用30m in后，用NT-3刺激者為W n t抑制劑組，每組進行成骨誘導(dǎo)實驗。利用噻唑藍細(xì)胞增殖、酶聯(lián)免疫吸附試驗、W e s t e r n blot檢測、茜素紅染色等實驗分別檢測各組人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（B M P-1）等蛋白表達及鈣結(jié)節(jié)形成能力。結(jié)果與對照組比較，NT-3組間充質(zhì)干細(xì)胞（M S C）增殖吸光度值增高（P＜0.01）；NT-3組堿性磷酸酶活性、B M P-1等蛋白表達或茜素紅染色效果均高于對照組（P＜0.01）；與NT-3組比較，W n t抑制劑組M S C增殖吸光度值降低（P＜0.01）；而W n t抑制劑組的堿性磷酸酶活性、B M P-1等蛋白表達均低于NT-3組（P＜0.01）。結(jié)論NT-3通過W n t通路，促進人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨分化。

神經(jīng)營養(yǎng)因子-3；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化；W n t通路

腫瘤、外傷、炎癥原因所造成的骨質(zhì)損傷，嚴(yán)重威脅患者的健康和生存質(zhì)量。促進骨損傷的修復(fù)一直是組織工程等領(lǐng)域的研究熱點［1］。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，M S C）可以向骨、軟骨、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞分化［2］，已成為組織工程中種子細(xì)胞的主要來源。

臨床工作發(fā)現(xiàn)，骨折區(qū)如果缺少血管營養(yǎng)或神經(jīng)支配，斷離的骨質(zhì)往往難以愈合［3］。人體神經(jīng)組織的生長與血管網(wǎng)絡(luò)的形成相互作用、伴行生長［4-5］。因此筆者設(shè)想，神經(jīng)因子可能在骨修復(fù)及骨再生中發(fā)揮重要作用。

神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（Ne u rotrophin-3，NT-3）是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)家族成員［6］，具有維持神經(jīng)元存活、促進M S C分化為神經(jīng)細(xì)胞［7］和促血管新生等作用［8］。如果挖掘NT-3對M S C成骨分化的影響，將對應(yīng)用NT-3和M S C的組織工程技術(shù)，促進骨組織血管、神經(jīng)再生，修復(fù)骨損傷等具有重要作用。目前，以NT-3促進M S C成骨分化的研究卻鮮有報道。本實驗擬闡明NT-3對人M S C生長和成骨分化能力的影響，為骨組織工程研究奠定研究基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（廣州賽業(yè)生物有限公司），以含10%胎牛血清（美國G bico公司），1μmol/L青霉素（美國S i g ma公司），100 u/ml鏈霉素（美國S i g ma公司），2mmol/L谷氨酰胺（美國H yclone實驗室）的α-M E M培養(yǎng)基為M S C基礎(chǔ)培養(yǎng)基。含1×10-7mol/L地塞米松（美國S i g ma公司）、50 m g/L抗壞血酸C（美國S i g ma公司）、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉（美國S i g ma公司）的α-M E M培養(yǎng)基為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

NT-3組中加入100 n g/ml人NT-3重組蛋白（美國R D公司）；在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)先加入100 mmol/L ICG-001（美國R D公司）作用30 min，0.01mmol/L磷酸緩沖鹽溶液（phosphate b uff er saline，P B S）清洗3次，用100 n g/ml NT-3刺激者為W nt抑制劑組；無刺激者為對照組。

1.2方法

1.2.1噻唑藍［3-（4，5）-d i m e th y lth i a h i az o（-z-y1）-3，5-d i-p h e n y t e tr az ol i u m ro m i d e，M TT］實驗檢測細(xì)胞增殖根據(jù)M S C誘導(dǎo)實驗的分組情況，將各組細(xì)胞按每孔2×103接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5%二氧化碳C O2培養(yǎng)48h，每孔中加入20μl、5m g/ml M TT（美國S i g ma公司），孵育4 h，加入150μl二甲基亞砜（美國S i g ma公司），連續(xù)振蕩10min后，用Ema x酶標(biāo)儀（美國M olec u lar De v ices公司）在490 nm波長檢測每組樣品吸光度（optical delnsity，O D）值。

1.2.2W e s t e r n blot檢測 C a s pa s e-3蛋白的表達培養(yǎng)每組5×106個細(xì)胞，裂解細(xì)胞，25μg蛋白樣品；依次經(jīng)過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodi u m dodecyls u l f ate-polyacrylamideg elelectrophoresis，S D S-P A G E）凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉等步驟；一抗使用小鼠抗人C aspase-3抗體（1∶150，英國A bcam公司），二抗使用辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G；增強化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemil u minescence，E C L）檢測蛋白表達，I ma g e-P ro P l u s 6.0軟件分析各蛋白條帶相對吸光度作定量計算。選用β-actin（英國A bcam公司）為內(nèi)參對照組。

1.2.3酶聯(lián)免疫吸附試驗（e n zy m e l in ke d i mm u n o s orb e n t a ss ay，EL ISA）檢測堿性磷酸酶（al k aline phosphatase，A L P）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-1（bone morpho g enetic protein-1，B MP-1）的表達。使用人E L I S A試劑盒（美國R D公司）檢測各實驗組中A L P、B MP-1蛋白表達，嚴(yán)格按照說明書進行操作。1.2.4茜素紅染色各組M S C誘導(dǎo)14 d后，用0.01 mol/L P B S沖洗3遍，4%多聚甲醛溶液固定60min，1%茜素紅染色15min，再用0.01mol/L P B S漂洗，B I X顯微鏡（日本O lymp u s公司）觀察。I ma g e-P ro P l u s 6.0軟件分析各組茜素紅染色的光密度。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

采用S P SS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較用方差分析，若方差齊則兩兩比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1MSC細(xì)胞增殖檢測結(jié)果

對照組細(xì)胞增殖的O D值為（0.440±0.257），NT-3組為（0.980±0.248），W nt抑制劑組為（0.685±0.251），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.720，P=0.000）。NT-3組與對照組的M S C增殖O D值比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.415，P=0.001），NT-3組M S C增殖O D值高于對照組；W nt抑制劑組與NT-3實驗組的M S C增殖O D值比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.547，P=0.001），W nt抑制劑組M S C增殖O D值低于NT-3實驗組。見圖1。

2.2MSC細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果

對照組C aspase-3蛋白相對含量為（1.250± 0.254），NT-3組為（0.690±0.239），W nt抑制劑組為（0.889±0.243），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F= 24.080，P=0.000）。NT-3組與對照組的C aspase-3蛋白相對含量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=6.812，P=0.001），NT-3組C aspase-3蛋白相對含量低于對照組；W nt抑制劑組與NT-3組的C aspase-3蛋白相對含量比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.477，P=0.018），W nt抑制劑組C aspase-3蛋白相對含量高于NT-3組。見圖2。

2.3細(xì)胞的A LP和BMP-1的表達

對照組、NT-3組和W nt抑制劑組的A L P、B MP-1蛋白濃度比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（見附表）。NT-3組A L P和B MP-1蛋白與對照組比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.497和19.792，P=0.001），NT-3組A L P和B MP-1蛋白均高于對照組；W nt抑制劑組A L P和B MP-1蛋白濃度與NT-3組比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 6.474和10.919，P=0.001），W nt抑制劑組A L P和B MP-1蛋白濃度均低于NT-3組。見圖3。

2.4細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果

圖1　MTT法檢測各組MSC增殖的OD值

圖2　Wester n blot檢測各組Caspase-3蛋白的表達

附表　各組細(xì)胞的A LP蛋白濃度方差分析 （n=18）

附表　各組細(xì)胞的A LP蛋白濃度方差分析 （n=18）

組別P值對照組　1 . 2 5 5 ± 0 . 2 5 6 　1 . 7 9 1 ± 0 . 2 1 3 N T -3組　2 . 1 9 0 ± 0 . 2 7 8 　5 6 . 7 0 0 　0 . 0 0 0 　3 . 4 9 6 ± 0 . 2 9 7 　2 0 5 . 9 2 0 　0 . 0 0 0 W n t抑制劑組　1 . 6 0 5 ± 0 . 2 6 4 　2 . 5 1 0 ± 0 . 2 4 2 A L P蛋白濃度F 值P 值B M P -1蛋白濃度F 值

圖3　各組細(xì)胞的A LP、BMP-1表達

對照組茜素紅染色的光密度值為（0.426± 0.145），NT-3組為（0.857±0.187），W nt抑制劑組為（0.706±0.159），經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.780，P=0.000）。NT-3組茜素紅染色的光密度與對照組比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.727，P=0.001），NT-3組茜素紅染色的光密度高于對照組；W nt抑制劑組茜素紅染色的光密度與NT-3組比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.610，P= 0.013），W nt抑制劑組茜素紅染色的光密度低于NT-3組。見圖4。

圖4　各組細(xì)胞茜素紅染色結(jié)果

3　討論

目前，以組織工程技術(shù)進行骨損傷的治療方法主要有自體或異體骨移植及利用羥基磷灰石、脫鈣骨等技術(shù)制作人工骨組織材料等［9］，雖然，這些方法各有優(yōu)點，但同時也面臨著諸如二次手術(shù)損傷、供體來源限制或存在免疫排斥反應(yīng)、傳播疾病、醫(yī)學(xué)倫理等諸多問題［10］。

目前，骨組織工程成為促進骨質(zhì)修復(fù)的重要手段，高分子支架材料適應(yīng)于M S C生長和骨組織的修復(fù)［11］。M S C廣泛存在于人體骨髓、脂肪等部位，并具有向骨、軟骨、血管內(nèi)皮細(xì)胞等組織細(xì)胞分化的特性，被廣泛應(yīng)用于骨損傷、心血管系統(tǒng)等疾病的治療中，并取得較好的療效。若在M S C培養(yǎng)基中加入地塞米松、維生素C和β-甘油磷酸鈉，能夠較好地促進M S C分化為成骨細(xì)胞［12］，筆者的實驗以上述經(jīng)典的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)進行實驗。若單獨應(yīng)用M S C修復(fù)骨缺損，往往難以達到理想效果，M S C向成骨細(xì)胞分化及促進成骨細(xì)胞增殖代謝等，還需要B MP-1、表皮細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、胰島素樣生長因子等成骨誘導(dǎo)生物活性因子參與［13-14］。如果找到合適的骨活性因子，促進M S C成骨能力，必將加快成骨效果，對骨損傷修復(fù)具有重大意義。

臨床工作發(fā)現(xiàn)，缺少神經(jīng)支配或神經(jīng)支配減弱的骨骼容易骨折或骨質(zhì)疏松，筆者考慮神經(jīng)因素在骨修復(fù)中扮演極為重要的角色。神經(jīng)血管病變，會使骨組織失去神經(jīng)血管支配或營養(yǎng)，而導(dǎo)致骨組織重塑修復(fù)功能障礙［15］。上述研究結(jié)果提示筆者，與其利用細(xì)胞因子單純的促進M S C向成骨細(xì)胞分化，不如尋找一種能夠促進神經(jīng)、血管新生，并對M S C成骨分化具有效果的多功能細(xì)胞因子。

NT-3作為神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，能夠激化Tr k C發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，促進脊髓損傷平面神經(jīng)元存活及其軸突再生。NT-3還能夠激活W nt通路，W nt通路在胚胎血管、肢體等形成或發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。W nt通路活化，可以使胞質(zhì)內(nèi)的βcatenin積聚，導(dǎo)致下游K remen、N g n2、P a x6等基因高表達，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)軸突等遷移，重塑肢體骨骼形成［16-17］。同時發(fā)現(xiàn)，NT-3也可有效地促進M S C向神經(jīng)元分化［18］。近年來發(fā)現(xiàn)，NT-3與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的Tr k C受體結(jié)合，在血管新生的過程中發(fā)揮重要作用［19］，NT-3修飾的M S C能有效地促進M S C增殖并分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，加快糖尿病性小鼠皮膚潰瘍的愈合［12］。而腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)肽Y、NT-4能夠促進M S C向成骨細(xì)胞分化［20］，但有關(guān)NT-3對骨組織再生及修復(fù)的研究鮮見報道。

本實驗發(fā)現(xiàn)，NT-3組的M S C增殖顯著增高，而W nt抑制劑組的M S C增殖卻明顯降低，提示NT-3與M S C細(xì)胞膜上NT-3的特異性受體Tr k C結(jié)合，激活W nt通路［21］，通過W nt通路而促進M S C的增殖。M S C成骨分化實驗中發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，NT-3組的茜素紅染色效果顯著優(yōu)于對照組，其鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量多，面積大，說明NT-3能誘導(dǎo)細(xì)胞聚集生長和鈣鹽沉積，具有明顯的促M S C成骨作用；與NT-3組比較，W nt抑制劑組的鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯降低，團塊狀也較前者小，說明W nt抑制劑組的促M S C成骨作用明顯低于NT-3組。A L P作為M S C早期成骨分化的指標(biāo)，能夠反映M S C成骨分化的能力。本實驗發(fā)現(xiàn)，NT-3組M S C成骨分化效果明顯，A L P表達較高，W nt抑制劑組A L P表達降低，證明NT-3激活M S C內(nèi)的W nt通路，促使M S C向成骨細(xì)胞分化，證明NT-3能夠重新啟動成骨分化機制，間接證明神經(jīng)因子在M S C成骨分化中的重要作用。如果在臨床適當(dāng)應(yīng)用神經(jīng)因子將加快骨折等疾病的修復(fù)和重建。也有研究發(fā)現(xiàn)，NT-3尚能通過激活A(yù) k t通路，而促進高糖環(huán)境M S C旁分泌血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞因子［8，12，20］。因此不排除NT3在促進M S C成骨分化的過程中，可能會存在A k t、Er k等信號機制［22］。

綜上所述，NT-3能有效促進M S C向成骨細(xì)胞分化。NT-3具備作為良好骨誘導(dǎo)活性因子和促進神經(jīng)血管新生的潛質(zhì)。筆者將探討M S C聯(lián)合生物活性因子及生物支架，開發(fā)原位誘導(dǎo)性生物材料，以期達到骨組織工程支架材料的優(yōu)化與整合，更好地發(fā)揮神經(jīng)血管源性細(xì)胞因子和M S C等干細(xì)胞在骨再生及修復(fù)中的作用，為骨組織工程修復(fù)的發(fā)展奠定研究基礎(chǔ)。

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（童穎丹 編輯）

Neurotrophin-3 promotes grow th and osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells through W nt pathway*

Shan-qiang Zhang，Yong-tao Li，Shi-zhu Sun，Li-jie Yao，Gui-qing Xu，Lei Shen
（Department of Anatomy，Qiqihaer Medical College，Qiqihar，Heilongjiang 161006，China）

Objective To clarify the ability of neurotrophin-3（NT-3）in promoting the differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells（hMSCs）into osteoblasts，and analyze the mechanism of Wnt pathway.M ethods Normal cultured hMSCs were into control group，hMSCs stimulated by NT-3 were into NT-3 group，hMSCs added with ICG-001 acting for 30 min before stimulation of NT-3 were taken as Wnt inhibitor group.The experiment of osteogenic induction was performed in each group.MTT，ELISA，Western blot and alizarin red staining were used to detect hMSC proliferation，apoptosis，alkaline phosphatase activity （ALP），bone morphogenetic protein-1（BMP-1）and other proteins，and ability of calcium nodule formation respectively in each group.Results Compared with the control group，the OD value of hMSC proliferation in the NT-3 group significantly increased（P＜0.01）；the expressions of ALP，BMP-1 and other proteins，and the effect of alizarin red staining of the NT-3 group were significantly higher than those in the control group（P＜0.01）.Compared with the NT-3 group，the OD value of hMSC proliferation in the Wnt inhibitor group significantly decreased（P＜0.01）；the expressions of ALP，BMP-1 and other proteins of the Wnt inhibitor group were lower than those in the NT-3 group（P＜0.01）.Conclusions NT-3 promotes the proliferation and osteogenic differentiation of hMSCs through Wnt pathway

neurotrophin-3；human mesenchymal stem cell；osteogenic differentiation；Wnt pathway

R 318.0

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.002

1005-8982（2016）15-0006-05

2016-01-28

國家自然科學(xué)基金（No：81541137）；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院博士基金（No：Q Y2015B-04）

沈雷，E-mail：shenleiby@126.com；Tel：0452-2663205