李俊，楊雪梅，宋亞曼，譚宇哲，劉芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031)

?

兩種玻璃化冷凍試劑在小鼠卵裂期及囊胚期胚胎凍存中的應(yīng)用觀察

李俊，楊雪梅，宋亞曼，譚宇哲，劉芳

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031)

目的比較兩種玻璃化冷凍試劑在小鼠卵裂期及囊胚期胚胎凍存中的應(yīng)用效果。方法4～6周齡雌性白小鼠20只，2月齡同品系雄鼠10只。雌鼠超數(shù)排卵后處死取卵母細(xì)胞，雄鼠處死取精子，制作小鼠胚胎模型。將小鼠胚胎分為A、B組，A組卵裂期胚胎122個(gè)、囊胚期胚胎69個(gè)，B組分別為119、86個(gè)。A、B組分別按加藤玻璃化冷凍試劑及捷鷹玻璃化冷凍試劑說(shuō)明中的操作方法進(jìn)行玻璃化冷凍。觀察并記錄解凍后胚胎存活及發(fā)育情況。結(jié)果A、B組卵裂期胚胎解凍后存活率分別為98.36%(120/122)、94.96%(113/119)，繼續(xù)發(fā)育至囊胚的比例分別為80.00%(96/120)、74.34%(84/113)，兩組相比，P均>0.05。A、B組囊胚期胚胎解凍后存活率分別為92.75%(64/69)、95.35%(82/86)，發(fā)育為孵化囊胚的比例分別為82.81%(53/64)、85.37%(70/82)，兩組相比，P均>0.05。結(jié)論加藤、捷鷹玻璃化冷凍試劑均可有效保存小鼠卵裂期及囊胚期胚胎，胚胎解凍后存活率和繼續(xù)發(fā)育能力均較高。

胚胎；冷凍；輔助生殖技術(shù)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

胚胎冷凍已成為輔助生殖技術(shù)的重要組成部分。玻璃化冷凍胚胎存活率高、臨床結(jié)局較好，為首選的冷凍方法[1～3]。玻璃化冷凍是使胚胎暴露于高濃度冷凍保護(hù)劑中，以超高速降溫將細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外溶液轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡB(tài)的方法。研究[4]表明，玻璃化冷凍試劑的成分、暴露于冷凍保護(hù)液的時(shí)間及溫度和裝桿時(shí)胚胎周?chē)鋬霰Ｗo(hù)液的體積為玻璃化冷凍效果的影響因素。加藤及捷鷹冷凍試劑是兩種常用的商品玻璃化冷凍試劑。2015年5～7月，我們以小鼠胚胎為模型，比較了兩種玻璃化冷凍試劑在卵裂期及囊胚期胚胎凍存中的應(yīng)用效果。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料4～6周齡雌性昆明白小鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)20只，2月齡同品系雄鼠10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)2周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。注射用尿促性腺激素(HMG)及人絨毛膜促性腺激素(HCG)，VitroLife序貫培養(yǎng)液，加藤玻璃化冷凍試劑(日本加藤公司)，捷鷹玻璃化冷凍試劑(加拿大捷鷹公司)，Cryotop載桿(日本加藤公司)。

1.2小鼠胚胎模型制作雌鼠腹腔注射HMG 10 IU/只，48 h后腹腔注射HCG 10 IU/只。注射HCG 12～14 h后頸椎脫臼法處死雌鼠，剪下輸卵管，取卵母細(xì)胞團(tuán)。充分清洗卵母細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至受精液中備用。頸椎脫臼法處死雄鼠，剪下附睪尾，取出精子。將盛有精子團(tuán)的平皿放于CO2培養(yǎng)箱中，孵育30～45 min，計(jì)算精子密度，將精子加至受精皿中，倒置顯微鏡下觀察精子活力,加卵母細(xì)胞(卵母細(xì)胞與精子比例為1∶10 000～1∶5 000)。受精4～6 h后，去除卵母細(xì)胞周?chē)穆亚鸺?xì)胞及黏附的精子，在高倍解剖鏡下挑選受精卵母細(xì)胞(出現(xiàn)2PN)，轉(zhuǎn)移至G-1 Plus培養(yǎng)液中培養(yǎng)。受精當(dāng)天記為D0，在倒置鏡下進(jìn)一步觀察原核形態(tài)，計(jì)數(shù)獲卵數(shù)、2PN數(shù)、未受精數(shù)。每日觀察并記錄胚胎發(fā)育情況，D3將胚胎轉(zhuǎn)移至G-2 Plus培養(yǎng)液，記錄囊胚發(fā)育情況。

1.3兩種玻璃化冷凍試劑用法將小鼠胚胎隨機(jī)分為A、B組，A組卵裂期胚胎122個(gè)、囊胚期胚胎69個(gè)，B組分別為119、86個(gè)。A、B組分別按加藤玻璃化冷凍試劑及捷鷹玻璃化冷凍試劑說(shuō)明中的操作方法進(jìn)行玻璃化冷凍。

1.3.1卵裂期胚胎冷凍方法A組將D3胚胎取出放于平衡液(ES)中，可觀察到胚胎體積縮小后又恢復(fù)原體積，將胚胎轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍液(VS)中，清洗數(shù)次后快速轉(zhuǎn)移至Cryotop載桿上投入液氮；解凍時(shí)將載桿浸入T1(37 ℃)中1 min，撿取胚胎依次放入T2 3 min、T3 5 min、T4 5 min后置于過(guò)夜平衡的G-2 plus培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。B組將D3胚胎取出放于玻璃化冷凍液1(V1)中，見(jiàn)胚胎體積縮小后又恢復(fù)原體積，將胚胎轉(zhuǎn)移至玻璃化冷凍液2(V2)中，清洗數(shù)次后快速轉(zhuǎn)移至Cryotop上投入液氮；解凍時(shí)將載桿浸入T1中1 min，撿取胚胎依次放入T2 3 min、T3 3 min、T4 3 min后置于過(guò)夜平衡的G-2 plus培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2囊胚期胚胎冷凍方法 將D4胚胎取出，激光透明帶打孔，使囊腔液體排出，其余冷凍、解凍步驟參考“1.3.1”。

1.4 觀察方法卵裂期胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段，記錄兩組胚胎解凍后存活及囊胚發(fā)育情況。囊胚期胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)，記錄兩組胚胎解凍后存活及孵化囊胚發(fā)育情況。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

A、B組卵裂期胚胎解凍后存后活率分別為98.36%(120/122)、94.96%(113/119)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.173，P=0.168)。卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚階段，A、B組胚胎囊胚發(fā)育率分別為80.00%(96/120)、74.34%(84/113)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.062，P=0.349)。兩組卵裂期胚胎解凍后存活及發(fā)育情況見(jiàn)圖1。

注：A為A組解凍后胚胎；B為A組解凍后培養(yǎng)至囊胚階段胚胎；C為B組解凍后胚胎；D為B組解凍后培養(yǎng)至囊胚階段胚胎。

圖1兩組卵裂期胚胎解凍后存活及發(fā)育情況

A、B組囊胚期胚胎解凍后存活率分別為92.75%(64/69)、95.35%(82/86)，兩組相比，χ2=0.471，P=0.513。繼續(xù)培養(yǎng)后兩組的囊胚孵出率分別為82.81%(53/64)、85.37%(70/82)，兩組相比，χ2=0.177，P=0.819。兩組囊胚解凍后存活及發(fā)育情況見(jiàn)圖2。

注：A為激光輔助縮小囊腔；B為A組解凍后囊胚繼續(xù)發(fā)育至孵化囊胚；C為B組解凍后囊胚繼續(xù)發(fā)育至孵化囊胚。

圖2兩組囊胚解凍后存活及發(fā)育情況

3　討論

種植前胚胎冷凍保存技術(shù)是輔助生殖技術(shù)的重要部分，細(xì)胞內(nèi)冰晶形成可造成胚胎致死性損傷。玻璃化冷凍技術(shù)是將細(xì)胞置于極高濃度溶液中以避免冰晶形成，是以高濃度冷凍保護(hù)劑及超高冷凍速率為基礎(chǔ)的冷凍方法。玻璃化冷凍成功的必要條件是在冷凍保護(hù)劑濃度與降溫速度之間建立最佳平衡，減輕冷凍保護(hù)劑的毒性作用及滲透性損傷[5]。近年來(lái)，玻璃化冷凍方法及冷凍載體不斷改進(jìn)，玻璃化冷凍技術(shù)日益成熟[6]。

高冷凍速度是受精卵在玻璃化冷凍中獲取穩(wěn)定高存活率的前提之一，既往常用降溫速度≥10 000 ℃/min的冷凍載體[7]。Cryotop載桿是玻璃化冷凍中常用載體，降溫速度為23 000 ℃/min，復(fù)溫速度為42 000 ℃/min，胚胎解凍后存活率大于90%[8]。本實(shí)驗(yàn)均采用cryotop載桿進(jìn)行玻璃化冷凍，兩組胚胎解凍后存活率均高于90%，表明胚胎凍存體系達(dá)標(biāo)。

玻璃化冷凍試劑是保證玻璃化冷凍成功的另一重要因素。冷凍保護(hù)劑通常為極高濃度的非電解質(zhì)混合液，通過(guò)破壞水分子氫鍵而發(fā)揮抗凍作用。冷凍保護(hù)劑分為滲透性和非滲透性?xún)煞N。滲透性冷凍保護(hù)劑可進(jìn)入細(xì)胞，直接替換細(xì)胞內(nèi)水分子，如二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)等；非滲透性冷凍保護(hù)劑又稱(chēng)細(xì)胞外冷凍保護(hù)劑，通過(guò)細(xì)胞外高滲透壓促使細(xì)胞內(nèi)水分排出，如蔗糖等[9]。DMSO是應(yīng)用最為廣泛的冷凍保護(hù)劑，但有潛在毒性作用，因此常與其他冷凍保護(hù)劑聯(lián)合使用以減輕毒性作用[10]。EG毒性較低，且EG的細(xì)胞滲透性低于PROH，因此，EG常被添加至玻璃化冷凍試劑中以降低毒性。Fry等[11]指出在4、21、37 ℃時(shí)PROH對(duì)單層內(nèi)皮細(xì)胞的滲透參數(shù)最高，DMSO及EG的滲透參數(shù)無(wú)明顯差異。研究[12]發(fā)現(xiàn)，滲透性保護(hù)劑PROH較DMSO毒性小，人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍中EG、PROH聯(lián)合應(yīng)用的效果優(yōu)于EG、DMSO聯(lián)合應(yīng)用，但在胚胎中尚無(wú)相關(guān)研究結(jié)果。

加藤玻璃化冷凍試劑以EG、DMSO及蔗糖為主要成分，而捷鷹玻璃化冷凍試劑的主要成分為EG、PROH和蔗糖。目前，加藤及捷鷹玻璃化冷凍試劑均廣泛應(yīng)用于人類(lèi)胚胎的冷凍保存中[13～16]。本研究以小鼠胚胎為模型,比較了兩種冷凍試劑的效果，結(jié)果顯示A、B組卵裂期及囊胚期胚胎解凍后存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，解凍后胚胎繼續(xù)發(fā)育能力無(wú)顯著差異，均與相關(guān)報(bào)道一致[ 17～19]，提示加藤、捷鷹玻璃化冷凍試劑均可有效保存小鼠卵裂期及囊胚期胚胎，胚胎解凍后存活率和后續(xù)發(fā)育能力均較高。

[1] AbdelHafez FF,Desai N,Abou-Setta AM,et al.Slow freezing,vitrification and ultra-rapid freezing of human embryos: a systematic review and meta-analysis[J].Reprod Biomed Online,2010,20(2):209-222.

[2] Roy TK,Bradley CK,Bowman MC,et al.Single-embryo transfer of vitrified-warmed blastocysts yields equivalent live-birth rates and improved neonatal outcomes compared with fresh transfers[J].Fertil Steril,2014,101(5):1294-1301.

[3] Lopes AS,Frederickx V,Van Kerkhoven G,et al.Survival,re-expansion and cell survival of human blastocysts following vitrification and warming using two vitrification systems[J].J Assist Reprod Genet,2015,32(1):83-90.

[4] Alpha Scientists in reproductive medicine.The Alpha consensus meeting on cryopreservation key performance indicators and benchmarks: proceedings of an expert meeting[J].Reprod Biomed Online,2012,25(2):146-167.

[5] Kuleshova LL,Lopata A.Vitrification can be more favorable than slow cooling[J].Fertil Steril,2002,78(3):449-454.

[6] Fasano G,Fontenelle N,Vannin AS,et al.A randomized controlled trial comparing two vitrification methods versus slow-freezing for cryopreservation of human cleavage stage embryos[J].J Assist Reprod Genet,2014,31(2):241-247.

[7] Seki S,Mazur P.Ultra-rapid warming yields high survival of mouse oocytes cooled to -196℃ in dilutions of a standard vitrification solution[J].PLoS One,2012,7(4):e36058.

[8] Kato O,Kawasaki N,Bodri D,et al.Neonatal outcome and birth defects in 6623 singletons born following minimal ovarian stimulation and vitrified versus fresh single embryo transfer[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2012,161(1):46-50.

[9] Wong KM,Mastenbroek S,Repping S.Cryopreservation of human embryos and its contribution to in vitro fertilization success rates[J].Fertil Steril,2014,102(1):19-26.

[10] Yokota Y,Sato S,Yokota M,et al.Successful pregnancy following blastocyst vitrification: case report[J].Hum Reprod,2000,15(8):1802-1803.

[11] Fry AK,Higgins AZ.Measurement of cryoprotectant permeability in adherent endothelial cells and applications to cryopreservation[J].Cell Mol Bioeng,2012,5(3):287-298.

[12] Moussa M,舒娟,張雪洪,等.哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存研究進(jìn)展：現(xiàn)存問(wèn)題與未來(lái)展望[J].中國(guó)科學(xué)：生命科學(xué),2014,44(7):663-675.

[13] Ku PY,Lee RK,Lin SY,et al.Comparison of the clinical outcomes between fresh blastocyst and vitrified-thawed blastocyst transfer[J].J Assit Reprod Genet,2012,29(12):1353-1356.

[14] 鄒林兵,戴志俊,張芳芳,等.玻璃化冷凍技術(shù)在人類(lèi)卵裂期胚胎的應(yīng)用分析[J].中國(guó)優(yōu)生與遺傳雜志,2014,22(8):121-122.

[15] Dong Z,Sun L,Zhang H,et al.The frozen-thawed embryo transfer timing determined by serum progesterone level: a retrospective follow-up study[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2014,181(1):210-213.

[16] 黃柳靜,許常龍,李春苑,等.低評(píng)分胚胎的囊胚培養(yǎng)和移植結(jié)局[J].生殖醫(yī)學(xué)雜志,2016,25(3):214-218.

[17] 張蔚,曹煬,白照岱,等.不同玻璃化冷凍保護(hù)劑對(duì)早卵裂期小鼠胚胎生存發(fā)育的影響[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2011,29(1):12-14.

[18] Zhang J,Cui J,Ling X,et al.Vitrification of mouse embryos at 2-cell,4-cell and 8-cell stages by cryotop method[J].J Assist Reprod Genet,2009,26(11-12):621-628.

[19] Joo JK,Lee YJ,Jeong JE,et al.Vitrification solution without sucrose for cryopreservation in mouse blastocysts[J].Clin Exp Reprod Med,2014,41(3):115-119.

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2015206453)。

劉芳(E-mail：liufydyy@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.19.012

R715.2

A

1002-266X(2016)19-0036-03

2015-11-23)