李　迪,李　偉,肖調(diào)義,2*,褚武英,2*,何美鳳,周智愚,金生振,鄧亞林

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心,中國 長沙　410128;2.湖南文理學(xué)院，水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,中國 常德　415000)

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草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1與其親本的肌肉特性比較研究

李迪1,李偉1,肖調(diào)義1,2*,褚武英1,2*,何美鳳1,周智愚1,金生振1,鄧亞林1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心,中國 長沙410128;2.湖南文理學(xué)院，水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心,中國 常德415000)

為探討草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1的肉質(zhì)特點(diǎn)，以同規(guī)格的草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1和其親本草魚(母本)、赤眼鱒(父本)為材料，采用質(zhì)構(gòu)儀測定分析比較了三者肌肉質(zhì)構(gòu)特性，采用冷凍切片法和HE染色法統(tǒng)計(jì)分析比較了三者肌纖維數(shù)量和密度，采用實(shí)時熒光定量PCR的方法分析了與肉質(zhì)特性關(guān)聯(lián)緊密的鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因、Ⅰ型膠原蛋白α1基因(COL1A1)和α2基因(COL1A2).在雜交F1和親本肌肉中的表達(dá)量.結(jié)果顯示：雜交F1與母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復(fù)性無顯著性差異(P>0.05)；雜交F1的肌肉硬度、彈性、內(nèi)聚性和咀嚼性均顯著高于母本草魚(P<0.05)，與父本赤眼鱒無顯著差異；雜交F1的肌纖維直徑和密度與其母本草魚無顯著差異(P>0.05)，與其父本赤眼鱒差異顯著(P<0.05)；COL1A1和COL1A2兩個基因在雜交F1肌肉組織中的表達(dá)量顯著高于其母本草魚(P<0.05)，而與其父本赤眼鱒無顯著差異(P>0.05)；CAST基因在雜交F1肌肉組織中的表達(dá)量顯著高于其母本草魚(P<0.05)，與其父本赤眼鱒無顯著差異(P>0.05).

草魚(♀)×赤眼鱒(♂)雜交F1；肉質(zhì)；肌纖維；I型膠原蛋白α1；I型膠原蛋白α2；鈣蛋白酶抑制蛋白

草魚是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的淡水經(jīng)濟(jì)魚類.由于生產(chǎn)上近親繁殖的影響，草魚種質(zhì)資源衰退較為嚴(yán)重,疾病頻發(fā)，其品質(zhì)也呈下降趨勢，肉質(zhì)疏松、口感下降等問題嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)價值.提高草魚抗病力和改善草魚肉質(zhì)是目前急需解決的問題，遠(yuǎn)緣雜交育種是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的有效方法之一.

赤眼鱒與草魚同屬雅羅魚亞科,不僅外形上與草魚相似,還具有抗草魚出血病毒(GCRV)強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，本課題研究團(tuán)隊(duì)在2010年完成了草魚與赤眼鱒的雜交試驗(yàn)，獲得了正交F1和反交F1兩個雜交子代群體[1].基于日常生活中魚產(chǎn)品肉質(zhì)的口感是吸引消費(fèi)者的重要原因，本實(shí)驗(yàn)選取正交F1為試驗(yàn)對象，結(jié)合其母本草魚和父本赤眼鱒的肉質(zhì)特點(diǎn)，對其進(jìn)行了肌肉特性分析比較研究，并采用Real Time PCR技術(shù)，從mRNA水平研究COL1A1，COL1A2，CAST三個基因在不同群體的表達(dá)水平，探索基因表達(dá)與肉質(zhì)性狀之間的關(guān)系，從分子水平對肌肉品質(zhì)差異的形成進(jìn)行初步分析，從而系統(tǒng)評價正交F1.

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

選取18月齡雜交F1(體重953.09±23.63 g，體長36.24±0.31 cm)、赤眼鱒(體重235.71±9.81 g，體長20.54±0.35 cm)和草魚(體重2 215.65±69.65 g，體長47.56±0.45 cm)健康個體各10尾，所有樣品均由瀏陽烏龍漁場養(yǎng)殖基地提供.

1.2 樣品的采集和處理

每種魚各取10尾，取魚體側(cè)線上部的背部肌肉，在下面放有冰塊的解剖盤內(nèi)按橫縱方向修好組織塊(1 cm×1 cm×0.5 cm).采下后放于30%的蔗糖溶液中脫水24 h.采取背中部肌肉樣品用于質(zhì)構(gòu)實(shí)驗(yàn).另采取部分背肌放入已滅菌的1.5 mL離心管中，迅速放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存，用于實(shí)時定量PCR分析.

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1肌肉質(zhì)構(gòu)特性的測定采取魚背中部肌肉切成厚20 mm×15 mm×15 mm的小塊，利用TA.XT.Plus型物性測試儀(英國Stable Micro Systems公司)，使用平底柱形探頭P/36,模擬人牙齒咀嚼食物,對樣品進(jìn)行兩次壓縮TPA測試，測試條件如下：測試前速率5 mm/s,測試速率1 mm/s，測試后速率5 mm/s，壓縮程度60%，停留間隔時間5 s，負(fù)重探頭類型：Auto-5g,數(shù)據(jù)收集率200 pps.樣品在室溫下進(jìn)行TPA測試，每尾魚取4個平行樣進(jìn)行測定.

1.3.2冷凍切片的制備將樣品修整好后放入樣品托上，均勻抹上OCT,迅速放入冰凍切片機(jī)內(nèi).待OCT均變?yōu)榘咨?，用刀片休整組織塊并切片.其后再進(jìn)行HE染色.切片制作完成后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照(如圖1).

1.3.3相關(guān)肉質(zhì)基因表達(dá)采用Trizol法提取肌肉RNA,按照Fermentas pure公司提供的cDNA試劑盒產(chǎn)品說明書完成cDNA第一鏈的合成.使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)COL1A1，COL1A2以及CAST的定量引物(如表1)，送于鉑尚公司合成.用于熒光定量表達(dá)實(shí)驗(yàn),反應(yīng)程序如表2.

表1　本文所用的引物序列

表2　熒光光定量反應(yīng)條件

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

用Image-pro plus 6.0進(jìn)行肌纖維統(tǒng)計(jì),熒光定量數(shù)據(jù)用EXCEL進(jìn)行整理，采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以各組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著.

2　結(jié)果

2.1質(zhì)構(gòu)特性

通過質(zhì)構(gòu)儀對雜交F1及其親本的測定，得到結(jié)果見表3.雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌肉黏附性、膠著性和回復(fù)性無顯著性差異(P>0.05);雜交F1肌肉硬度和彈性(分別為4 791.02±427.89 g和0.65±0.05)，顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性(分別為2 348.82±194.69 g和0.42±0.02) (P<0.05).與其父本赤眼鱒肌肉硬度和彈性(分別為4 658.51±564.32 g和0.64±0.03),無顯著差異.

表3　草魚(♀)×赤眼鱒(♂)F1與其親本的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)

注：同列上標(biāo)小寫字母不同表示二者之間有顯著差異(P<0.05).

2.2肌肉組織學(xué)分析

在倒置顯微鏡下觀察兩種魚的肌肉切片，可以看出雜交F1和母本草魚的肌纖維紋理清楚，排列緊密，基本結(jié)構(gòu)相同(圖1，彩圖見封三).肌纖維直徑的測量:參考陳璐等[2]的計(jì)算方法，選取一定視野范圍內(nèi)的肌纖維進(jìn)行統(tǒng)計(jì),圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出每根肌纖維的面積,并默認(rèn)為“圓”的面積,根據(jù)s=πr2(r為半徑)自動計(jì)算出每根肌纖維的等效直徑，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，如圖2所示，肌纖維直徑大小在30～60 μm范圍內(nèi)的雜交F1占61%，母本草魚占68%，父本赤眼鱒占38%；纖維直徑在60～80 μm范圍內(nèi)的雜交F1占28%，母本草魚占25%，赤眼鱒占41%；80 μm以上的肌纖維直徑雜交F1占11%，母本草魚占7%，父本赤眼鱒占21%. 用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，見表4.結(jié)果表明，雜交F1的肌纖維直徑與其母本草魚肌纖維直徑差異不顯著(P>0.05)，但顯著小于其父本赤眼鱒；雜交F1的肌纖維密度與其母本草魚的肌纖維密度無顯著差異(P>0.05)，但顯著大于其父本赤眼鱒.

圖1　雜交F1及其親本的肌肉冰凍切片圖Fig.1　The muscle frozen section of crossbreed F1 and his parents

圖2　肌纖維分布圖Fig.2　The distribution graph of muscle fibers

種類肌纖維平均直徑/μm肌纖維平均密度/mm2草魚72.43±9.61a243.89±10.57a赤眼鱒101.74±14.68b164.28±12.85b雜交F180.01±7.86a256.48±17.79a

注：同列上標(biāo)小寫字母不同表示二者之間有顯著差異(P<0.05).

2.3相關(guān)肉質(zhì)基因表達(dá)分析

以草魚RPL13作為內(nèi)參，考察COL1A1，COL1A2，CAST三個基因在F1和草魚肌肉中的表達(dá)，COL1A1和COL1A2兩個基因在父本赤眼鱒和雜交F1中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，都較母本草魚高且差異顯著(P<0.05).CAST基因在母本草魚和雜交F1中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，都比父本赤眼鱒低且差異顯著(P<0.05)(如圖3).

注：字母不同表示差異顯著(P<0.05).圖3　COL1A1，COL1A2和CAST在雜交F1、草魚和赤眼鱒肌肉中的表達(dá)量Fig.3　The significance tests of COL1A1，COL1A2 and CAST in the muscle of the three fishes

3　討論

肌纖維是組織學(xué)特性中較為重要的物理參數(shù)，是魚類肌肉品質(zhì)的重要評價指標(biāo)[3-6].本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析了雜交F1和母本草魚、父本赤眼鱒的肌纖維直徑和肌纖維密度.結(jié)果顯示，雜交F1的肌纖維直徑顯著小于父本赤眼鱒，與母本草魚的肌纖維直徑無顯著差異；雜交F1的肌纖維密度顯著大于父本赤眼鱒的肌纖維密度，與母本草魚的肌纖維密度無顯著差異.吳信生[7]等對我國7種地方雞種的組織學(xué)研究表明，肌纖維密度與肌肉的嫩度相關(guān)比較密切，7個地方雞種肌纖維密度與嫩度呈負(fù)相關(guān)，肌纖維直徑與嫩度呈正相關(guān)，即肌纖維愈細(xì)，肌纖維密度愈大，肉質(zhì)越鮮嫩.劉錚鑄[8]等對波爾山羊雜交后代肌肉組織學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)雜交后代羊與唐山奶山羊在眼肌肌纖維密度方面差異顯著,臂三頭肌肌纖維密度雖未達(dá)到顯著差異,但雜交后代明顯高于唐山奶山羊,說明雜交后代羊比唐山奶山羊的肉質(zhì)好.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與父本赤眼鱒相比，雜交F1的肌纖維直徑更小，肌纖維密度更大，這表明雜交F1肉質(zhì)比親本赤眼鱒更鮮嫩.

質(zhì)構(gòu)特性是決定其品質(zhì)的重要因素之一，儀器測定是質(zhì)構(gòu)特性的重要評價手段，一定程度上減少了人的主觀因素帶來的評價誤差.胡芬[9]等對5種淡水魚的質(zhì)構(gòu)特性進(jìn)行了相關(guān)性分析，得出硬度和彈性是影響魚肉質(zhì)構(gòu)特性的主要因素.本實(shí)驗(yàn)中雜交F1肌肉硬度和彈性，顯著高于母本草魚的肌肉硬度和彈性.雜交F1肉質(zhì)硬度和彈性增強(qiáng)，會使其口感更好.

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者選出了COL1A1，COL1A2和CAST三個與肌肉嫩度和彈性相關(guān)基因， 通過實(shí)時熒光定量PCR的方法從分子水平上進(jìn)一步對上述組織學(xué)水平指標(biāo)做出解釋.鈣蛋白酶系統(tǒng)在細(xì)胞內(nèi)普遍存在，是降解肌原纖維蛋白的主要酶系統(tǒng)，是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速環(huán)節(jié)，在肌肉的嫩化過程中起著重要作用[10-12].蛋白酶CAST系統(tǒng)在魚類中的相關(guān)研究報(bào)道不多，只有斑馬魚[13]、虹鱒[14]和草魚的部分mRNA被克隆分離.Dutt等[15]研究表明，Calpastatin表達(dá)量的減少都會導(dǎo)致肌肉蛋白水解及肉質(zhì)嫩度的增加,表明鈣蛋白酶水解作用才是導(dǎo)致肉質(zhì)嫩化的主要因素.關(guān)磊[16]等研究表明鈣蛋白酶抑制蛋白 mRNA 的高表達(dá)水平可提高魚類肌肉生長率和魚肉硬度、堅(jiān)韌性，CAST基因在肌肉中的表達(dá)可影響其肉質(zhì)硬度.本實(shí)驗(yàn)中CAST基因在雜交F1肌肉上的表達(dá)量與父本赤眼鱒無顯著差異，但是顯著高于其母本草魚，通過質(zhì)構(gòu)實(shí)驗(yàn)得出，雜交F1的肉質(zhì)變硬，彈性變大，可能也是和CAST基因在肌肉中的表達(dá)量提高有關(guān).

Hatae[17]等人研究表明，魚類肌肉的堅(jiān)韌性與膠原蛋白的含量密切相關(guān).在大西洋鮭[18]研究表明，肌肉中膠原蛋白含量的增加使肌肉具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，凝聚性增大.李文倩[19]等的實(shí)驗(yàn)中表明，膠原蛋白含量與質(zhì)構(gòu)參數(shù)均呈正相關(guān)，膠原蛋白含量增加能夠改善肌肉質(zhì)構(gòu)，較高的肌肉膠原蛋白含量，其肌肉的結(jié)構(gòu)、強(qiáng)度和品質(zhì)也相對較好.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，COL1A1和COL1A2兩個基因在雜交F1肌肉上的表達(dá)量顯著高于在母本草魚肌肉上的表達(dá)量，肌肉硬度和彈性也顯著高于母本草魚.

4　結(jié)論

綜上所述，雜交F1肌肉彈性大、嫩度高，肉質(zhì)堅(jiān)韌，這給人們在選擇水產(chǎn)品時提供了一種新的魚蛋白選擇，同時也豐富了魚類種質(zhì)資源.

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(編輯WJ)

Comparative Study on Muscle Texture Between the Crossbreed F1Generation from Grass Carp (CtenopharyngodonIdellus) (♀) × Barbel hub (SqualiobarbusCurriculus) (♂) and Their Parents

LI Di1, LI Wei1, XIAO Tiao-yi1,2*, CHU Wu-ying1,2*, HE Mei-feng1,ZHOUZhi-yu1,JINSheng-zhen1,DENGYa-lin1

(1. Hunan Engineering Research Center for Utilization of Characteristics of Aquatic Resources,Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China;2. Key Laboratory of Zoology in Hunan Higher Education, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

Objective:To explore the muscle texture of the crossbreed F1. Method: The female parent grass carp (Ctenopharyngodonidellus) (♀) × Barbel chub (Squaliobarbuscurriculus) (♂) F1(crossbreedF1) as well as their parents at the same specification were used for our research. The texture analyzer, the freezing sectioning technology and hematoxylin-eosin staining method were used for muscle characterization and fiber diameter. In addition, the spatio-temporal expression ofCOL1A1,COL1A2,CASTgenes were identified by RT-PCR. Our results show that hybrid F1muscle fiber diameter is less than that of the female parent grass carp. By using the real-time PCR technology, we found thatCOL1A1,COL1A2andCASTgenes expressions in hybrid F1muscle volume were slightly higher than the expression on grass carp muscle. Results: The muscle tenderness, cohesiveness, springiness and chewiness in crossbreed F1is significantly better than those of grass carp (P<0.05). No significant difference was found for barbell chub. The muscle adhesiveness, gumminess and resilience had no significant difference in hybrid F1, grass carp and barbell chub (P>0.05). The muscle fiber diameter and density of crossbreed F1when compared with grass carp had no significant difference (P>0.05). But they were significantly different when compared with barbell chub (P>0.05). The expression ofCOL1A1,COL1A2,CASTgenes in crossbreed F1was significantly higher than that grass carp (P<0.05), but was no significantly different in comparison with barbell chub (P>0.05).

grass carp (♀)×barbel chub (♂) crossbreed F1; muscle texture; muscle fiber; COL1A1；COL1A2；CAST

10.7612/j.issn.1000-2537.2016.03.006

2015-09-10基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-46)*通訊作者,E-mail：tyxiao1128@163.com;chuwuying18@163.com

S963.3

A

1000-2537(2016)03-0028-06