張雨 綜述 徐燕 王孟昭 審校

近年來，肺癌在癌癥引起的死亡中已占據(jù)首位[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌中最常見的類型，約占所有肺癌總數(shù)的80%，大多數(shù)NSCLC患者確診時已處于晚期，失去了手術(shù)治療或根治性放療的機(jī)會，晚期NSCLC全身化療中位生存期僅為8個月-10個月。目前，對于有明確驅(qū)動基因的NSCLC，分子靶向藥物是治療晚期NSCLC的重要策略。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）酪氨酸激酶受體抑制劑（tyrosine kinases inhibitors, TKIs）是目前最重要的靶向治療藥物，對于有EGFR敏感突變的NSCLC患者，EGFR-TKIs治療具有明顯的臨床療效[2-5]。

部分癌細(xì)胞從原發(fā)腫瘤組織中脫落進(jìn)入外周血、胸腔積液、唾液、糞便中，稱為游離腫瘤細(xì)胞，游離腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或腫瘤細(xì)胞在原發(fā)腫瘤組織中凋亡壞死后均可釋放DNA到外周血、胸腔積液、唾液、糞便等部位，這些DNA稱為游離DNA（cell-free DNA, cfDNA）。研究[6,7]證實，釋放入外周血的游離腫瘤細(xì)胞或游離DNA可一定程度反映腫瘤基因表型。Karlovich等[8]曾采用不同檢測方法反復(fù)試驗后指出組織突變亦存在假陰性的可能，其原因可歸結(jié)為腫瘤異質(zhì)性，這在檢測耐藥突變T79M時更為突出，也間接證明了血漿代替腫瘤組織做為檢測EGFR突變樣本的優(yōu)越性。

目前，用于檢測外周血EGFR突變的方法有很多，包括測序法、實時熒光定量PCR（real-time PCR, RT-PCR）、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）、突變富集PCR（mutant-enriched PCR, ME-PCR）、變性高效液相色譜法（denaturing high performance 1iquid chromatography, DHPLC）及數(shù)字PCR等。以上方法各有其優(yōu)缺點，本文將目前用于檢測外周血EGFR基因突變的方法綜述如下。

1 用于檢測外周血EGFR基因突變的方法概述

1.1 測序法 測序法是目前檢測基因突變最基礎(chǔ)、應(yīng)用最廣、最直接、最準(zhǔn)確的一種方法，不僅能檢測已知突變，而且能發(fā)現(xiàn)新的突變，且費用不高，是目前公認(rèn)的檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)。該方法需要對待測序樣品進(jìn)行擴(kuò)增、純化、序列分析，過程繁瑣，耗時較長，故在臨床應(yīng)用中存在一定的限制，不適用于大量臨床樣品分析。更重要的是測序法本身靈敏度不高，僅能檢測突變含量在25%-30%以上的樣本[9-11]。因此，對核酸含量較低的外周血來說，其檢測效果不佳。由一代測序法即直接測序法發(fā)展而來的二代測序，其核心思想為邊合成邊測序，相比一代測序靈敏度及特異性有所提高，現(xiàn)有的技術(shù)平臺包括Roche/454 FLX、Illumina、Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

1.2 RT-PCR RT-PCR于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，與常規(guī)PCR相比，其特異性更強(qiáng)，自動化程度高，目前已得到廣泛應(yīng)用。實時熒光定量PCR在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)定量功能。其原理為：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加，每經(jīng)過一個循環(huán)，熒光定量PCR儀收集一次熒光信號，這樣就可以借助于熒光信號強(qiáng)度來監(jiān)測PCR產(chǎn)物的變化，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板濃度進(jìn)行定量分析。用熒光定量法檢測目的基因并不需要檢測突變基因組DNA具體含量，僅需檢測樣本是否具有擴(kuò)增信號即可，并且PCR反應(yīng)具有核酸擴(kuò)增的高效性，可檢測出微小突變。該方法可以檢測出含量為1%以上突變[12]。但該技術(shù)的定量檢測依賴于Ct值（cycle threshold），而Ct值會受擴(kuò)增效率的影響，這在一定程度上限制了精確定量檢測。

1.3 ARMS 1989年Newton等[13]在PCR的基礎(chǔ)上，建立了AMRS，也稱等位基因特異性擴(kuò)增法（allele-specific amplification, ASA），或稱等位基因特異PCR（allele specific PCR, AS-PCR）。該技術(shù)利用DNA聚合酶缺乏3’→5’外切酶活性，PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補(bǔ)才能有效擴(kuò)增的原理，針對不同的已知突變，設(shè)計適當(dāng)?shù)囊镆詸z測出突變基因。該法在設(shè)計引物時，在引物3’端設(shè)計一錯配堿基，一個與野生DNA互補(bǔ)，一個與突變DNA互補(bǔ)，使之僅能與突變型或野生型互補(bǔ)而只擴(kuò)增突變型或野生型基因。擴(kuò)增產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物可以通過凝膠電泳或是實時熒光定量PCR（real-time PCR）測定進(jìn)行分析。ARMS法敏感性可達(dá)到1%[14]。蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions ARMS, SARMS）則是在擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，引用了一種新型探針即Scorpions探針，由于Scorpions探針中序列特異性引物和探針在同一分子上，因此信號的產(chǎn)生特別快，其敏感性可達(dá)0.1%[15]。Cobas@是以ARMS為檢測原理的伴隨檢驗試劑盒，檢測EGFR突變的敏感性達(dá)0.1%[16]。ARMS的不足之處在于只能檢測已知突變。

1.4 ME-PCR ME-PCR最早由Asano等[11]建立并用來檢測EGFR基因突變。該方法通過兩次PCR使突變基因得到富集，其靈敏度及特異性均較高，能從1×103-1×104個野生基因型拷貝中檢測出一個突變基因[17-19]，且成本低廉，適合大醫(yī)院開展肺癌患者常規(guī)追蹤檢測。其不足之處在于需要兩次PCR，操作復(fù)雜，耗時長，容易污染而造成假陽性，只能檢測一些常見的突變，而另一些較小的突變則檢測不出，且檢測通量較小。

1.5 DHPLC DHPLC技術(shù)最早建立于1995年，近年來發(fā)展迅速，是在單鏈構(gòu)象多態(tài)性和變性梯度凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新雜合雙鏈突變檢測技術(shù)，可自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。該技術(shù)是根據(jù)受檢DNA片段序列，經(jīng)由特定軟件分析選擇維持一定的柱溫，使受檢DNA片段的雙鏈達(dá)到部分變性，可被較低濃度的乙腈洗脫下來。由于錯配的異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同，在相同的部分變性條件下，異源雙鏈DNA因有錯配區(qū)的存在而更易變性，被色譜柱保留時間短于同源雙鏈，從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線，依據(jù)洗脫曲線可以直觀分析判斷結(jié)果。與測序法相比，DHPLC簡單、快速，3 min就可完成一個樣本的檢測，不僅可用于已知突變的檢測，還可以用于未知突變的掃描。在突變含量達(dá)到1.6%-6.25%以上時，DHPLC檢測可行[20,21]。其不足之處在于不能檢測同源突變，也不能檢測出突變的具體類型，結(jié)果判讀容易出錯，且當(dāng)有多個片段需要檢測時，由于有多個解鏈溫度，需要多步檢測，增加了工作量。

1.6 數(shù)字PCR 數(shù)字PCR的問世給基因分子檢測帶來了里程碑式的改變，其通過將樣品大倍數(shù)稀釋，使每個細(xì)分試樣中所含有的待測分子數(shù)不超過1個，經(jīng)PCR擴(kuò)增后通過基因芯片逐個計數(shù)。這是一種絕對定量的方法，可以在大量野生型基因為背景時檢測到含量極少的突變，無需校準(zhǔn)。近年來，在數(shù)字PCR基礎(chǔ)之上又衍生出如微乳滴磁珠PCR（BEAMing）、微數(shù)字PCR（microfluidics digital PCR）、微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR, ddPCR）等敏感性和特異性更高、定量更精確、效率也更高的檢測方法。BEAMing于2003年推出，該方法結(jié)合了數(shù)字PCR與流式技術(shù)，通過將引物結(jié)合在磁珠表面，再將單個磁珠與目標(biāo)分子包裹在微乳液滴中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將野生型和突變型目標(biāo)分子在磁珠表面進(jìn)行復(fù)制，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行破乳，再利用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行熒光計數(shù)。其靈敏度高，適合用于低概率的等位基因突變分析，其檢測EGFR突變的敏感性達(dá)0.02%[22]。微數(shù)字PCR是在數(shù)字PCR的基礎(chǔ)上結(jié)合了基因芯片技術(shù)，有效避免了交叉污染，操作時間短，可在2 h內(nèi)（僅需20 min的人工操作時間）完成12個樣品的同步檢測，檢測靈敏度達(dá)0.1%[23]。但由于目前基因芯片技術(shù)發(fā)展還不甚成熟，其在臨床的實際應(yīng)用程度仍然有限。Bio-Rad公司于2011年推出了ddPCR系統(tǒng)[24]，該技術(shù)在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，可以將每份樣本分成20,000個微滴，而后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例，可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度，是一種核酸分子絕對定量技術(shù)，其檢測敏感性高達(dá)0.001%[15,24,25]。

2 外周血EGFR基因突變檢測

測序法目前被公認(rèn)為是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)，但僅能檢測突變含量在25%-30%以上的樣本，外周血EGFR突變檢出率波動也較大，約在5.1%-37.0%[12,14,26]。因此，對于外周血這類cfDNA及腫瘤細(xì)胞含量少、野生型占比高的樣本來說，測序法并不是最優(yōu)選擇。ARMS法敏感性可達(dá)0.1%，但只能檢測已知突變。日本學(xué)者Kimura等[26,27]在其兩項研究中用測序法和SARMS法分別檢測了血清EGFR的兩個熱點突變，發(fā)現(xiàn)采用SARMS法得到的突變率明顯高于測序法（48.1%vs37.0%），其靈敏度為50.0%-75.0%，特異度85.7%-97.1%，一致率達(dá)72.7%-92.9%；值得一提的是，SARMS法檢測得到的血清EGFR敏感突變陽性的患者在接受靶向治療后，其中位無疾病進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）、總生存期（overall survival, OS）明顯長于突變陰性患者，顯示出敏感突變與靶向治療反應(yīng)的一致性，而采用測序法則并未得到這一結(jié)論。Maheswaran等[28]曾選取20例配對的腫瘤組織及外周血游離腫瘤細(xì)胞，其腫瘤組織已知均含有EGFR敏感突變，采用SARMS法對外周血游離腫瘤細(xì)胞進(jìn)行檢測，共檢測出19例與腫瘤組織相一致的突變，檢出率達(dá)95.0%；該研究同時比較了12例配對外周血游離腫瘤細(xì)胞和血漿cfDNA分別作為樣本時在檢測EGFR突變方面的優(yōu)劣，結(jié)果提示以游離腫瘤細(xì)胞為樣本時能更有效的檢測出突變（92%vs33%,P=0.009）。在IPASS[29]研究中的亞組分析中，曾采用SARMS法對86例血清cfDNA進(jìn)行EGFR基因突變檢測，其靈敏度為43.1%，特異度為100.0%，一致率為66.3%。Douillard等[30]采用SARMS法檢測了652例高加索人種的血漿cfDNAEGFR基因突變，其靈敏度為65.7%，特異度為99.8%，檢測一致率達(dá)到94.3%。ME-PCR靈敏度及特異性較高，能從2,000個野生拷貝中檢測到一個突變基因，而普通PCR僅能從10個野生拷貝中檢測到一個突變基因，ME-PCR明顯優(yōu)于普通PCR及測序法[11,31,32]。He等[12]采用ME-PCR對血漿EGFR基因突變進(jìn)行檢測，得到的突變率為49.3%（66/134），其敏感性明顯高于測序法（33/60, 55.0%vs11/60, 18.3%,P＜0.001），與配對腫瘤組織的檢測一致率達(dá)94.4%（17/18）。Zhao等[33]采用MEPCR法對111例血漿樣本進(jìn)行突變分析，靈敏度為35.6%，特異度95.5%，與組織檢測結(jié)果一致率為71.2%。Bai等[21]隨機(jī)選取了230例進(jìn)展期NSCLC，采用DHPLC得到的血漿EGFR突變率為34.3%，靈敏度為81.8%，特異度為90.8%，與組織突變結(jié)果一致率為87.0%。Yung等[23]采用數(shù)字PCR對31例血漿進(jìn)行突變檢測，與測序法測得的組織突變結(jié)果相比，其靈敏度為91.7%，特異度100.0%，一致率高達(dá)96.8%；同時，該研究利用數(shù)字PCR的定量功能發(fā)現(xiàn)對EGFR-TKIs反應(yīng)較好的患者，其血漿突變基因含量會隨著治療的進(jìn)行而降低，提示我們對EGFR突變進(jìn)行定量分析可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生做出更好的治療決策。Zhu等[34]將突變DNA稀釋至不同濃度，測得ddPCR敏感性達(dá)0.04%；與ARMS法檢測得到的組織突變結(jié)果比較，其檢測血漿cfDNA靈敏度和特異度均較高，分別為81.8%和98.4%。本文作者亦就ddPCR檢測血漿cfDNAEGFR兩個熱點突變的靈敏度、特異度及與組織結(jié)果的一致性進(jìn)行了相關(guān)研究，樣本例數(shù)充足，共檢測樣本215例，得到的結(jié)果分別為61.3%、96.7%、81.4%，與Oxnard等[25]得到的結(jié)果較為一致。Thress等[35]在其研究中詳細(xì)比較了Cobas@、BEAMing及ddPCR檢測EGFR兩種常見敏感突變的優(yōu)劣，不管是靈敏度、特異度還是與組織突變結(jié)果的一致性方面，三種檢測方法均取得了另人滿意的結(jié)果。其中以BEAMing靈敏度最高，達(dá)93%以上，Cobas@最低，但也在86%以上，ddPCR居中，為90%；特異性方面，Cobas@與ddPCR均達(dá)到了100%，BEAMing在93%以上；與組織突變的一致率方面，均能達(dá)到90%以上，其中以ddPCR最高，達(dá)到了97%。Karlovich等[8]在其試驗中同樣采用Cobas@檢測血漿ctDNAEGFR敏感突變，其特異度同樣達(dá)到100%，但靈敏度及與組織突變一致率較低，不到80%。表1列出了各研究采用不同方法檢測外周血EGFR兩種最常見敏感突變數(shù)據(jù)特點。

3 外周血T790M突變檢測與EGFR-TKIs獲得性耐藥

在EGFR-TKIs治療過程中，所有患者最終均會對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥，其中T790M突變?yōu)樽畛Ｒ姷哪退帣C(jī)制，約占所有耐藥機(jī)制的47%-66%[36-38]。已有文獻(xiàn)[25,39]報道，T790M突變在外周血中的出現(xiàn)要早于影像學(xué)進(jìn)展，最早可在影像學(xué)進(jìn)展前16周在外周血中檢測到T790M突變的存在。及時對患者的T790M突變狀態(tài)進(jìn)行動態(tài)檢測便于臨床工作者做出更好的醫(yī)療決策，這在實際臨床工作中對T790M的監(jiān)測造成了很大限制，并且腫瘤組織有很大的異質(zhì)性，而以外周血為標(biāo)本檢測T790M突變相較腫瘤組織則具備了很多優(yōu)勢。Sorensen等[40]采用ARMS法對T790M連續(xù)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，其最早在臨床出現(xiàn)明顯進(jìn)展前344天就已經(jīng)出現(xiàn)在血漿DNA中。Ishii等[41]將數(shù)字PCR用于EGFR-TKIs耐藥后T790M的檢測，其靈敏度達(dá)81.8%，特異度85.7%，與組織檢測結(jié)果一致率為83.3%。Thress等[35]選取38例樣本詳細(xì)比較了Cobas@、ddPCR、BEAMing在檢測血漿ctDNA T790M突變靈敏度、特異度及與組織的一致率。ddPCR與BEAMing靈敏度及與組織突變狀態(tài)一致率取得了令人滿意的結(jié)果，在70%以上，Cobas@靈敏度僅為41%，與腫瘤組織一致率不足60%。而在Karlovich[8]的研究中，Cobas@檢測T790M的靈敏度及與組織突變的一致率均有所提高，分別為63.3%和86.3%。Thress等[35]進(jìn)一步選取了72例樣本對比了Cobas@與BEAMing檢測血漿ctDNA的優(yōu)劣，二者靈敏度均另人滿意，但BEAMing稍高于Cobas@（81%vs73%），但BEAMing檢測T790M的特異性不及Cobas@（58%vs67%）；二者檢測T790M的一致率高達(dá)90%；該研究同時指出，同樣經(jīng)過AZD9291治療的患者，采用Cobas@測得的組織T790M突變陽性患者的客觀緩解率與經(jīng)同樣方法測得的血漿陽性患者一致。以上均說明了Cobas@和BEAMing可以用于檢測血漿是否含有T790M突變。從以上各學(xué)者的研究中可以看出，與非數(shù)字化試劑盒相比，數(shù)字化試劑盒對游離DNA T790M的檢測更具優(yōu)勢，其靈敏度更高。Zheng等[39]采用ddPCR對EGFR-TKIs耐藥后的25例血漿ctDNA進(jìn)行T790M突變檢測，靈敏度81.%，特異度100.0%，組織突變一致率88.0%。

表 1 不同方法檢測外周血EGFR敏感突變結(jié)果匯總Tab 1 Characteristics of different methods evaluating EGFR activating mutation in peripheral blood

4 總結(jié)

如何快速簡便高效的篩選出EGFR突變是當(dāng)下基礎(chǔ)科研人員及臨床醫(yī)生共同關(guān)心的問題。目前還沒有一種完全適用于臨床的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的檢測外周血cfDNA及游離腫瘤細(xì)胞EGFR基因突變的方法。

RT-PCR、AMRS、ME-PCR、DHPLC、數(shù)字PCR等方法與測序法相比，其靈敏度及特異性均得到很大的提高，RT-PCR、ARMS、ME-PCR及數(shù)字PCR更實現(xiàn)了對突變的定量檢測，這對于靶向藥物治療后療效評估是十分必要的。RT-PCR法單次反應(yīng)只能對1個或少數(shù)突變進(jìn)行檢測，無法實現(xiàn)高通量。ARMS法重復(fù)性好，其敏感性為1%，而在結(jié)合Scorpions探針后其敏感性可達(dá)0.1%。Kimura等[26]以血漿為樣本采用ARMS進(jìn)行EGFR突變檢測時，發(fā)現(xiàn)L858R的檢出率僅為3.7%，而對E19 del的檢出率可達(dá)44.4%，提示在檢測突變含量較少，而大量野生型基因作為背景的樣本時，ARMS對于點突變的檢測可能不太靈敏。ME-PCR需要兩次PCR，而且需要酶切，操作復(fù)雜，耗時長，容易污染而造成假陽性，只能檢測一些常見的突變，而另一些較小的突變則檢測不出。DHPLC可以用于未知突變的掃描，但不能檢測出突變類型，結(jié)果判讀容易出錯，且當(dāng)有多個片段需要檢測時，由于有多個解鏈溫度，需要多步檢測，增加了工作量，其靈敏度與其他方法相比較低，為1.6%-6.25%。

目前，各學(xué)者就不同檢測方法的性能都在進(jìn)行相關(guān)研究，但得到的結(jié)果卻不太一致，甚至大相徑庭。筆者認(rèn)為，除檢測方法本身的特性外，以外周血游離腫瘤細(xì)胞或cfDNA為樣本進(jìn)行EGFR基因突變檢測過程中還受很多其它因素影響，包括樣本質(zhì)量、DNA含量、DNA的提取、樣本的臨床病理特征如病理類型、腫瘤分期、腫瘤分化程度等等。Maheswaran等[28]曾建立了CTC-chip設(shè)備，能夠分離、定量、從血樣中分析游離腫瘤細(xì)胞，改善樣本提取質(zhì)量，從而可以提高突變檢測效率。Oxnard等[25]通過測量長散在核元件（long interspersed element 1, LINE-1）濃度來評估cfDNA的質(zhì)量和數(shù)量，研究表明，當(dāng)樣本LINE-1低于設(shè)定的中位濃度時，其檢出EGFR突變的靈敏度只有50%，而高于LINE-1中位濃度時，其突變檢出靈敏度可提高至81%。Zhao等[33]在其研究中指出，以晚期NSCLC患者的血漿為樣本進(jìn)行檢測時，其敏感性及與組織的一致率明顯高于偏早期患者的血漿樣本檢測結(jié)果；而且，腫瘤分化較差患者的血漿檢測結(jié)果，其敏感性、與腫瘤組織的一致率明顯高于高分化腫瘤患者的血漿檢測結(jié)果。越來越多的學(xué)者將兩種方法相結(jié)合以更好地利用各方的優(yōu)勢。有學(xué)者將AMRS法與實時熒光定量PCR結(jié)合以避免電泳帶來的有毒操作；將測序法結(jié)合構(gòu)象敏感凝膠電泳（conformation-sensitive gel electrophoresis, CSGE）以提高其靈敏度[42,43]。

數(shù)字PCR及在此基礎(chǔ)上建立起來的BEAMing、微數(shù)字PCR、ddPCR及伴隨診斷試劑盒Cobas@，實現(xiàn)了對樣本的高通量定量檢測，尤其是ddPCR，其靈敏度極高，可檢測出含量為0.001%的突變，而且省時，3 h可以對96份樣本進(jìn)行結(jié)果判讀，且定量程度較其他方法更為精確，這對于靶向藥物治療后療效評估及耐藥機(jī)制研究來說十分重要，相信其在臨床基因診斷、第三代EGFR-TKIs作用機(jī)制研究中將會呈現(xiàn)無可比擬的優(yōu)越性。