矯麗曼

(遼寧省楊樹研究所，遼寧　蓋州115200)

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羊肚菌胞內(nèi)多糖的提取及單糖組成分析*

矯麗曼

(遼寧省楊樹研究所，遼寧蓋州115200)

以人工培養(yǎng)的羊肚菌菌絲為材料，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)的方法，篩選羊肚菌胞內(nèi)多糖(MIP)的最佳提取方法，并用硅膠G薄層層析和高效液相色譜法對(duì)MIP純品的單糖組分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，羊肚菌多糖最佳的提取工藝為加水倍數(shù)25倍、提取溫度90℃、浸提時(shí)間2h、用95%乙醇沉淀多糖，其多糖得率為7.694%。其MIP由D-甘露糖和D-半乳糖兩種單糖組成，摩爾比為1︰1.059。

羊肚菌；胞內(nèi)多糖；提取工藝；薄層層析；高相液相色譜

進(jìn)入21世紀(jì)后，中國(guó)林下經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展，林下經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)能夠大幅度提高林地的利用效率以及森林產(chǎn)業(yè)的綜合效益，利用林地的資源優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)林下經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)的深入發(fā)展，使其集約化、產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；l(fā)展，最終實(shí)現(xiàn)農(nóng)民收入的增加，成為中國(guó)林業(yè)發(fā)展新的經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。當(dāng)前中國(guó)林下經(jīng)濟(jì)發(fā)展的基本模式主要包括森林景觀利用、林下產(chǎn)品采集加工、林下養(yǎng)殖和林下種植等4種模式。其中林下種植，就是利用林下資源，適當(dāng)?shù)匕l(fā)展藥類、菌類、牧草等種植類產(chǎn)品[1]。

中國(guó)真菌的半野生栽培技術(shù)已取得了成功，適合這種半野生栽培的菌種也很多。羊肚菌(MorchellaconicaFr)就是其中一種。羊肚菌(Morchella)是一種珍貴的食(藥)用菌，具有補(bǔ)腎、補(bǔ)腦、提神的功能。多糖是其主要的功能成分，是一種有效的生物系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，具有較高的藥用價(jià)值，可明顯改善腰腿疼痛、手麻木、盤骨不舒等癥狀[2]。羊肚菌人工栽培最早成功的是1982年Ower等發(fā)明的羊肚菌(M.esculenta)人工栽培方法[3]。中國(guó)從20世紀(jì)80年代至今也有羊肚菌(M. spp.)栽培成功的報(bào)道[4～5]，關(guān)明進(jìn)行了林下羊肚菌栽培技術(shù)探索，實(shí)驗(yàn)采用改良的土豆培養(yǎng)基制作母種，選擇以楊樹(Populus)或樺樹(Betula)為主的針闊葉林作為播種場(chǎng)地，種植羊肚菌獲得成功[6]。劉紅民對(duì)楊樹林下羊肚菌菌種的制備及林下栽培方法進(jìn)行了研究[7]。本文以人工培養(yǎng)的羊肚菌菌絲為材料，對(duì)羊肚菌胞內(nèi)多糖的提取方法及其單糖組成進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步研究楊樹林下栽培的菌種及其多糖藥用價(jià)值的開發(fā)利用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料和試劑

1.1.1材料

羊肚菌購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所菌種保存中心。

1.1.2試劑

苯酚、硫酸、無(wú)水乙醇、硅膠G、甲醇、冰乙酸、氯仿、乙腈、苯胺、二苯胺、磷酸、鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖、果糖、半乳糖、蔗糖。

1.2儀器設(shè)備

DHG-9240(A)型鼓風(fēng)干燥箱；LGJ-10型冷凍干燥儀；AL104型電子天平；HZQC型恒溫浴振蕩器；UV2501PC紫外分光光度計(jì)；高效液相色譜儀Waters 600(美國(guó)Water公司)；Ultrahydrogel 2000和Ultrahydrogel 500色譜柱串聯(lián)(美國(guó)沃特世公司)；SPD-10A示差折光檢測(cè)器(日本島津公司)；LC-10AT流動(dòng)泵；層析柱(2.0cm×40cm)。

1.3方法

1.3.1多糖含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量[8]。

1.3.2羊肚菌胞內(nèi)多糖(MIP)的基本提取方法[9]

取長(zhǎng)滿羊肚菌菌絲的發(fā)酵培養(yǎng)基，用紗布濾出菌絲，蒸餾水清洗3次，40℃干燥12h，粉碎后充分研磨，得到羊肚菌菌絲干粉。5g的羊肚菌菌絲干粉，加入20倍體積的水，在80℃條件下浸提2h，提取液4 000rpm離心15min，上清液經(jīng)紗布過(guò)濾，濾液減壓濃縮至原體積的1/3，濃縮液加入3倍體積的95%乙醇，沉淀12h。然后4 000rpm離心15min，沉淀在40℃下減壓干燥即為羊肚菌胞內(nèi)粗多糖。

1.3.3各提取因素對(duì)多糖得率的影響[10～11]

在基本提取方法的基礎(chǔ)上，只改變一個(gè)條件，其他條件不變，每組試驗(yàn)3次重復(fù)，分別研究加水倍數(shù)(分別為5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍)、提取溫度(分別為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)、浸提時(shí)間(分別為1h、2h、3h、4h、5h)、提取次數(shù)(分別為1次、2次、3次、4次、5次)、乙醇濃度(分別為70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%)對(duì)羊肚菌胞內(nèi)多糖得率的影響。

1.3.4正交試驗(yàn)法確定MIP的最佳熱水提取法[12～13]

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)各個(gè)因素對(duì)多糖得率影響的顯著性程度以及各個(gè)因素的有效影響范圍，選擇顯著的因素及其有效的水平，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，來(lái)確定最佳的熱水提取法。

1.3.5 不同提取方法對(duì)多糖得率的影響[14～15]

將最佳提取法中的熱水分別替換0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L的鹽酸溶液、氫氧化鈉溶液和氯化鈉溶液，每組試驗(yàn)3次重復(fù)。同熱水提取法相比，研究稀酸、稀堿、稀鹽提取法對(duì)多糖得率的影響。

1.3.6MIP的單糖組成分析

(1)單糖的水解[16～17]脫蛋白后的多糖溶液經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析和SephadexG-100凝膠柱層析進(jìn)行分離純化；用紫外光譜、醋酸纖維素薄膜電泳和SephadexG-200葡聚糖凝膠柱層析方法進(jìn)行純度鑒定，得到均一組分MIP純品，用2mol/L的硫酸110℃水解，即為多糖的水解液。

(2)薄層層析法[18～20]取活化過(guò)的硅膠G薄板一塊，依次點(diǎn)鼠里糖、木糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、甘露糖、果糖、半乳糖溶液和多糖水解液，用冰乙酸︰氯仿︰水=35︰30︰5做展層劑。根據(jù)色斑顏色及Rf值即可初步鑒定出MIP水解液中含有的單糖樣品。

(3)高效液相色譜法[21～23]將多糖的水解液用高效液相色譜分析，并與標(biāo)準(zhǔn)單糖對(duì)照，確定單糖的組成種類，計(jì)算各單糖的摩爾比。

2　結(jié)果與分析

2.1各提取因素對(duì)多糖得率的影響

2.1.1加水倍數(shù)對(duì)多糖得率的影響

加水倍數(shù)對(duì)多糖得率的影響見圖1。

圖1　加水倍數(shù)對(duì)多糖得率的影響

由圖1可見，隨著加水倍數(shù)的增加，多糖得率也隨著逐漸增大。達(dá)到20倍后多糖得率增幅不大，而且隨著加水倍數(shù)的增加，會(huì)增加后續(xù)提取液的濃縮工作量，因此，提取過(guò)程的加水倍數(shù)應(yīng)選擇20倍。

2.1.2提取溫度對(duì)多糖得率的影響

由圖2可見，隨著提取溫度的提高，多糖得率也逐漸增大；而且當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，增幅較大，隨后增幅明顯減弱。因此提取溫度應(yīng)選擇80℃。

圖2　提取溫度對(duì)多糖得率的影響

2.1.3浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

由圖3可見，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖得率逐漸增大；當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2h，多糖得率的增幅較大，隨后其增幅變小。因此，提取時(shí)間應(yīng)選擇2h。

2.1.4提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響

由表1可見，隨著提取次數(shù)的增加，多糖得率有逐漸增大的趨勢(shì)，但增幅很小，從多糖得率上來(lái)看，提取5次與提取1次相比，多糖總得率只增加了0.324%，因此，可以確定提取次數(shù)對(duì)多糖得率的影響作用不明顯，可以作為次要因素考慮。

圖3　浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

提取次數(shù)/次12345多糖得率/%6.8346.9987.0377.0827.158

2.1.5乙醇濃度對(duì)多糖沉淀效果的影響

由圖4可見，隨著乙醇濃度的增加，多糖得率逐漸增大，而且增大的幅度相同，因此提取過(guò)程的乙醇濃度應(yīng)選擇100%乙醇，即無(wú)水乙醇。

圖4　乙醇濃度對(duì)多糖得率的影響

2.1.6正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果,確定加水倍數(shù)、浸提溫度、提取時(shí)間、乙醇濃度為影響多糖得率的主要因素，而且確定各個(gè)因素的水平，其中加水倍數(shù)(A)分別為：20倍、25倍、30倍；浸提溫度(B)分別為：70℃、80℃、90℃；提取時(shí)間(C)分別為：2h、3h、4h；乙醇濃度(D)分別為：90%、95%、100%。因此，正交試驗(yàn)采用L9(34)的方法(表2)進(jìn)行試驗(yàn)，來(lái)確定最佳方法。

表2　正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

注：A為加水倍數(shù)(倍)，B為浸提溫度(℃)，C為提取時(shí)間(h)，D為乙醇濃度(%),Ki表示任意列上水平號(hào)為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和，k表示平均值，R表示極差。

從表2的正交試驗(yàn)R值可以看出，A、B、C、D 4個(gè)因素對(duì)多糖得率的影響程度依次為：B>C>A>D。正交試驗(yàn)確定最佳多糖提取工藝為A2B3C2D2，即加水倍數(shù)為25倍、90℃、提取3h、用95%乙醇沉淀多糖。照正交試驗(yàn)確定的最佳組合A2B3C2D2，進(jìn)行多糖提取試驗(yàn)，并設(shè)3次重復(fù)，此時(shí)粗多糖的平均得率為7.547%，與表2中的第6次試驗(yàn)A2B3C1D2的結(jié)果相比，A2B3C2D2組合的多糖得率略小于A2B3C1D2的多糖得率，因此，羊肚菌胞內(nèi)多糖最佳提取工藝為:A2B3C1D2。即加水倍數(shù)為25倍、浸提溫度為90℃、提取時(shí)間為2h、用95%乙醇沉淀多糖，多糖的得率為7.694%。

2.2不同提取溶劑對(duì)多糖得率的影響

從圖5可以看出，采用稀HCl溶液提取羊肚菌胞內(nèi)多糖時(shí)，隨著HCl溶液濃度的增加，多糖的得率有明顯的下降趨勢(shì)；采用稀NaOH溶液提取時(shí)，隨著NaOH溶液濃度的增加，多糖得率也有下降的趨勢(shì)；采用NaCl溶液提取時(shí)，隨著NaCl溶液濃度的增加，多糖的得率有較小的下降趨勢(shì)。

圖5　不同濃度的溶劑對(duì)多糖得率的影響

最佳熱水提取法多糖的得率為7.694%，酸、堿、鹽溶液提取羊肚菌胞內(nèi)多糖時(shí)，多糖的得率沒(méi)有提高，反而下降，從7.694%分別降到2.194%、1.657%、6.189%。因此，選用熱水提取法提取較為適宜。

2.3MIP的單糖組分分析結(jié)果

2.3.1硅膠G薄層層析分析結(jié)果

如圖6所示，各種單糖顯示出不同的顏色。多糖水解樣品的斑點(diǎn)顏色與幾種標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品都很相似，Rf值也和幾種標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品相近，初步確認(rèn)該多糖含有幾種單糖成分，必須通過(guò)高效液相色譜來(lái)確定它的單糖組成。

注：1為L(zhǎng)-鼠李糖，2為D-木糖，3為D-葡萄糖，4為半乳糖醛酸，5為D-甘露糖，6為D-果糖，7為D-半乳糖，8為多糖水解樣品。

圖8　MIP水解液的HPLC色譜圖

2.3.2高效液相色譜法分析結(jié)果

從圖7和圖8可以看出，與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間對(duì)比，MIP純品完全水解液里含有二種單糖：D-甘露糖和D-半乳糖，摩爾比為1︰1.059。可見MIP主要由D-甘露糖和D-半乳糖組成。

3　結(jié)論與討論

3.1各單因素對(duì)多糖得率的影響

采用L9(34)的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到羊肚菌胞內(nèi)多糖的最佳熱水提取工藝，即加水倍數(shù)為25倍、浸提溫度為90℃、提取時(shí)間為2h、95%乙醇沉

淀多糖，該提取工藝的多糖得率為7.694%。在羊肚菌胞內(nèi)多糖提取率的各個(gè)因素中，影響程度依次為：浸提溫度>提取時(shí)間>加水倍數(shù)>乙醇濃度。究其原因，可能在多糖釋放過(guò)程中，細(xì)胞壁是一個(gè)薄薄的屏障，溫度越高，提取時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞壁越容易破損，多糖越容易釋放；同樣，在一定溫度下，提取時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞壁破損程度越大，多糖越容易釋放；利用了反萃取的技術(shù)，以乙醇作為萃取液，乙醇濃度越大，越易吸收細(xì)胞內(nèi)的水分，使其多糖越容易沉淀。因條件和時(shí)間限制，未對(duì)其他的提取法做比較分析，例如采用超聲破碎，液氮研磨，酶解等方法破壞細(xì)胞壁，然后釋放出多糖，尚待在今后實(shí)驗(yàn)中作深入研究。

3.2不同提取溶劑對(duì)多糖得率的影響

采用正交試驗(yàn)確定了最佳的提取方法為熱水提取法。

3.3MIP單糖組成分析

經(jīng)過(guò)高效液相色譜分析得出，MIP主要由D-甘露糖和D-半乳糖組成，摩爾比為1︰1.059，兩者均屬于吡喃糖。

本文主要對(duì)羊肚菌菌絲中的胞內(nèi)多糖提取和單糖組成進(jìn)行了研究，未對(duì)分離純化、分子結(jié)構(gòu)及其生物活性進(jìn)行分析。今后應(yīng)著重于羊肚菌多糖的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及其生物活性，尤其是在抗腫瘤機(jī)理等方面研究。

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Extraction and Monosaccharide Composition of Intracellular Polysaccharide of Morchella conica Fr.

JIAO Li-man

(Liaoning Provincial Institute of Poplar，Gaizhou Liaoning 115200，P.R.China)

The mycelium of the plantedMorchellaconicaFr as materials,the best extraction method of intracellular polysaccharide by single factor analysis and orthogonal experiment were studied.The composition sugars of MIP was also analyzed with Silica gel G thin-layer chromatography and HPLC.The results show that the optimal extraction technology is :the water multiple with 25,the extractive temperature with 90℃,the extractive time with 2 hours,the alcohol concentration with 95%.At this condition,the yield is 7.694% ,and the MIP is constituted by D-mannose and D-galactose,the mol proportion is 1︰1.059.

MorchellaconicaFr.；intracellular polysaccharide；extractive technology；thin-layer chromatography；HPLC

2015-08-27

遼寧省科技攻關(guān)及成果產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(2014207011)。

矯麗曼(1981-)，女，工程師，碩士研究生，主要從事楊樹轉(zhuǎn)基因育種和楊樹林下食用菌栽培等方面研究工作。E-mail：jiaoliman1025@163.com

Q 946.3

A

1672-8246(2016)04-0130-06

doi:10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.04.022