梁達(dá)煒，梁權(quán)輝，方艷平，姜長(zhǎng)宏，龍　軍，曾念宜，林麗娟，江凌曉

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基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速鑒定沙門(mén)菌臨床分離株

梁達(dá)煒，梁權(quán)輝，方艷平，姜長(zhǎng)宏，龍軍，曾念宜，林麗娟，江凌曉

目的評(píng)估基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)在沙門(mén)菌鑒定中的臨床應(yīng)用，并研究其影響因素。方法用傳統(tǒng)血清學(xué)方法鑒定沙門(mén)菌的血清型，用MALDI-TOF MS對(duì)哥倫比亞血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板分別培養(yǎng)24 h、72 h、120 h和168 h的179株沙門(mén)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果179株沙門(mén)菌可分為38種血清型，腸炎沙門(mén)菌(21.2%)、斯坦利沙門(mén)菌(17.3%)和Ⅰ4,5,12:i:-沙門(mén)菌(16.2%)居前3位。所有菌株在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板分別培養(yǎng)24 h和72 h均能被MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定為沙門(mén)菌。MALDI-TOF MS的耗材成本約為微生物自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)(Vitek 2)的1/3，檢測(cè)時(shí)間約為Vitek 2的1/7。結(jié)論在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板培養(yǎng)3 d以內(nèi)的沙門(mén)菌，MALDI-TOF MS均可以準(zhǔn)確鑒定。與Vitek 2相比，MALDI-TOF MS檢測(cè)的速度更快，消耗的成本更低，并且可以直接鑒定生長(zhǎng)在選擇性培養(yǎng)基的沙門(mén)菌。

沙門(mén)菌；基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜；鑒定

Supported by grant of the National Projects of Major Infectious Disease Control and Prevention (No. 2012ZX10004-213)

從1966年到2007年，世界上每年有超過(guò)9 380萬(wàn)人患上沙門(mén)氏菌病，導(dǎo)致155 000個(gè)死亡病例[1]?；|(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time f Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS) 是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，并逐漸應(yīng)用于細(xì)菌和真菌的快速鑒定[2-4]。MALDI-TOF MS的基本原理是微生物標(biāo)本與基質(zhì)形成的共結(jié)晶體被激光照射后，通過(guò)基質(zhì)吸收激光能量傳遞給樣本，同時(shí)將質(zhì)子轉(zhuǎn)移給生物分子，從而使其發(fā)生電離，不同的微生物標(biāo)本產(chǎn)生不同的微生物蛋白質(zhì)量指紋圖譜而被鑒別。目前常用的微生物自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)，例如Vitek 2(梅里埃，法國(guó))，是通過(guò)辨別細(xì)菌引起的不同生化反應(yīng)進(jìn)行菌屬鑒定，但其細(xì)菌培養(yǎng)的時(shí)間和生化反應(yīng)的時(shí)間使檢測(cè)時(shí)間至少需要4 h。不同的培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、樣品的處理方式會(huì)影響MADLI-TOF MS鑒定細(xì)菌的結(jié)果[5-6]。本研究利用MADLI-TOF MS檢測(cè)179株沙門(mén)菌的臨床分離株，評(píng)估其在沙門(mén)菌鑒定中的臨床應(yīng)用，并對(duì)其影響因素進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源本研究中，共有179個(gè)沙門(mén)菌菌株，由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。所有細(xì)菌菌株均經(jīng)過(guò)Vitke 2 (梅里埃, 法國(guó))鑒定為沙門(mén)菌菌屬。

1.2儀器微生物自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)Vitek 2和MALDI-TOF MS 質(zhì)譜儀為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3試劑GN卡(革蘭陰性菌鑒定卡)、CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質(zhì)液、Vitek MS-DS 靶板、MH平板、哥倫比亞血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板均為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品。沙門(mén)菌診斷血清為丹麥國(guó)家血清研究院(Statens Serum Institut, Denmark)產(chǎn)品。

1.4血清型鑒定沙門(mén)菌菌株血清型鑒定參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010進(jìn)行，根據(jù)Kauffman-White 表，確定具體的血清型。

1.5MALDI-TOF MS鑒定所有的菌株接種于哥倫比亞血平板37 ℃孵育(24±1) h。用無(wú)菌接種環(huán)挑取單個(gè)菌落均勻涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL CHCA覆蓋，在室溫下自然干燥后進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)菌株從靶板點(diǎn)樣到質(zhì)譜檢測(cè)重復(fù)2次試驗(yàn)。

1.6不同培養(yǎng)條件下MALDI-TOF MS對(duì)沙門(mén)菌的鑒定179株沙門(mén)菌菌株分別接種于血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板，在37 ℃分別培養(yǎng)24 h、72 h、120 h、168 h后挑取單個(gè)菌落均勻涂于靶板上，即刻在涂布的菌落上加入1 μL CHCA覆蓋，在室溫下自然干燥后進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)菌株從靶板點(diǎn)樣到質(zhì)譜檢測(cè)重復(fù)2次試驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1血清型分布179株沙門(mén)菌被鑒定為38種血清型，其中腸炎沙門(mén)菌38株，占21.2%；斯坦利沙門(mén)菌31株，占17.3%；，Ⅰ4,5,12:i:-沙門(mén)菌29株，占16.2%；鼠傷寒沙門(mén)菌18株，占10.1%；德?tīng)柋吧抽T(mén)菌6株，占3.4%；湯卜遜沙門(mén)菌5株，占2.8%；韋太夫雷登沙門(mén)菌5株，占2.8%；其他血清型沙門(mén)菌47株，占26.3%。

2.2MALDI-TOF MS和Vitek 2鑒定沙門(mén)菌的比較MALDI-TOF MS對(duì)腸炎沙門(mén)菌、I 4,5,12:i:-沙門(mén)菌、鼠傷寒沙門(mén)菌、德?tīng)柋吧抽T(mén)菌等38種血清型179株沙門(mén)菌均能準(zhǔn)確鑒定，與Vitek 2 鑒定的結(jié)果完全一致，如表1所示。Vitek 2鑒定沙門(mén)菌的耗材成本遠(yuǎn)高于MALDI-TOF MS，幾乎是MALDI-TOF MS的3倍，如表2所示。另外，MALDI-TOF MS每鑒定16株沙門(mén)菌所需要的時(shí)間僅僅約為Vitek 2所需時(shí)間的1/7。

在臨床微生物檢測(cè)的工作中，懷疑沙門(mén)菌感染的臨床患者的標(biāo)本需要先用選擇性平板如SS平板、HE平板進(jìn)行培養(yǎng)，然后對(duì)可疑的菌株需轉(zhuǎn)接到血平板再培養(yǎng)18～24 h后，挑取單個(gè)菌落，用Vitek 2進(jìn)行檢測(cè)。另外，單個(gè)菌株從上機(jī)檢測(cè)至結(jié)果輸出，Vitek 2至少需要4 h。因此，Vitek 2鑒定沙門(mén)菌從標(biāo)本接種至鑒定結(jié)果輸出至少需要2 d，而MALDI-TOF MS可以直接從SS平板、HE平板挑取菌落進(jìn)行鑒定，只需1 d左右就能獲得鑒定結(jié)果，并且單個(gè)菌株上機(jī)檢測(cè)的過(guò)程僅需要5 min。

2.3不同條件下MALDI-TOF MS鑒定沙門(mén)菌的結(jié)果接種于4種不同類型的平板：血平板、HE平板、SS平板、麥康凱平板的179株沙門(mén)菌分別培養(yǎng)24 h和72 h均能被MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定為沙門(mén)菌，如表3所示。培養(yǎng)時(shí)間為120 h時(shí)，血平板、HE平板、SS平板、麥康凱平板培養(yǎng)的沙門(mén)菌菌株分別有7株、8株、36株、32株無(wú)法與質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得出檢測(cè)結(jié)果，故其被MALDI-TOF MS成功檢測(cè)的鑒定率分別為96.1%、95.5%、79.9%和82.1%。然而，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為168 h時(shí)，血平板、HE平板、SS平板、麥康凱平板培養(yǎng)的沙門(mén)菌菌株分別有88株、89株、96株、61株無(wú)法與質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)庫(kù)匹配得出鑒定結(jié)果，故其被MALDI-TOF MS成功檢測(cè)的鑒定率分別為50.8%、50.3%、46.4%和65.9%。

表1MALDI-TOF MS 和Vitek 2對(duì)不同血清型沙門(mén)菌在屬的水平上的鑒定結(jié)果比較

Tab.1Comparison of MALDI-TOF MS and Vitek 2 for Salmonella identification at genus level

血清型Serotype菌株數(shù)No.ofisolatesMALDI-TOFMSno.ofisolates(%)Vitek2no.ofisolates(%)準(zhǔn)確鑒定Correctidentification鑒定錯(cuò)誤Wrongidentification未鑒定出No.ofnotdetected準(zhǔn)確鑒定Correctidentification鑒定錯(cuò)誤Wrongidentification未鑒定出No.ofnotdetected腸 炎沙門(mén)菌3838(100.0)0038(100.0)00斯坦利沙門(mén)菌3131(100.0)0031(100.0)00I4,5,12:i:-沙門(mén)菌2929(100.0)0029(100.0)00鼠傷寒沙門(mén)菌1818(100.0)0018(100.0)00德?tīng)柋吧抽T(mén)菌66(100.0)006(100.0)00其他33種血清型5757(100.0)0057(100.0)00合計(jì)179179(100.0)00179(100.0)00

表2MALDI-TOF MS 和Vitek 2鑒定沙門(mén)菌的耗材成本和時(shí)間

Tab.2Consuming cost and detection time of MALDI-TOF MS and Vitek 2 for Salmonella identification

MALDI-TOFMSVitek2Consumingcost(yuan)/oneisolate2056Detectiontime(min)/16isolates45320

a從菌株標(biāo)本準(zhǔn)備到結(jié)果結(jié)果輸出所需時(shí)間。

Note: Detection time from isolate preparation to result output.

表3MALDI-TOF MS在不同培養(yǎng)基不同培養(yǎng)時(shí)間條件下對(duì)179株沙門(mén)菌準(zhǔn)確鑒定的菌株數(shù)量和鑒定率

Tab.3Number of Salmonella isolates and identification rate for accurate identification of 179 Salmonella strains by MALDI-TOF MS under different culture mediums and inoculation time

培養(yǎng)時(shí)間Inoculationtime(h)培養(yǎng)基Culturemedium血平板BloodagarHE平板HEagarSS平板SSagar麥康凱平板MacConkeyagar24179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)72179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)179(100.0%)120172(96.1%)171(95.5%)143(79.9%)147(82.1%)16891(50.8%)90(50.3%)83(46.4%)118(65.9%)

3　討　論

從上世紀(jì)80年代以來(lái)，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)被發(fā)現(xiàn)可以對(duì)大質(zhì)量生物分子進(jìn)行分析，包括核糖體蛋白，MALDI-TOF MS就逐漸被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)[7]。隨后，國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究報(bào)道，不同的培養(yǎng)基和不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MALDI-TOF MS鑒定微生物的結(jié)果產(chǎn)生影響[5, 8-10]。但是，對(duì)于從臨床患者分離的沙門(mén)菌菌株，目前還沒(méi)有研究報(bào)道不同種類的培養(yǎng)基和不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)MADLI-TOF MS的鑒定結(jié)果的影響。

本研究中，對(duì)于在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板分別培養(yǎng)24 h和72 h的179株沙門(mén)菌臨床分離株，MALDI-TOF MS均能準(zhǔn)確鑒定到沙門(mén)菌菌屬。但是當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至120 h時(shí)，部分菌株無(wú)法被MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至168 h時(shí)，在各種類型平板培養(yǎng)的菌株至少有35%的菌株無(wú)法被MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定。這表明培養(yǎng)時(shí)間在72 h內(nèi)，在血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板培養(yǎng)的沙門(mén)菌可以被MALDI-TOF MS準(zhǔn)確鑒定到沙門(mén)菌菌屬，這足以滿足臨床對(duì)沙門(mén)菌檢測(cè)的需求。

MALDI-TOF MS在鑒定沙門(mén)菌菌屬時(shí)，與Vitek 2的檢測(cè)結(jié)果完全一致，所有菌株均能準(zhǔn)確鑒定到沙門(mén)菌菌屬。但MALDI-TOF MS的耗材成本約為Vitek 2的1/3，檢測(cè)時(shí)間約為Vitek 2的1/7。MALDI-TOF MS可以準(zhǔn)確鑒定各種血清型的沙門(mén)菌。對(duì)于培養(yǎng)時(shí)間在3 d以內(nèi)培養(yǎng)于血平板、HE平板、SS平板和麥康凱平板的沙門(mén)菌，MALDI-TOF MS均可以準(zhǔn)確鑒定，比通過(guò)鑒別沙門(mén)菌的相關(guān)生化反應(yīng)的傳統(tǒng)鑒定方法所需的時(shí)間減少24 h以上。因?yàn)樵赟S平板和HE平板等選擇性平板上，由于大多數(shù)沙門(mén)菌會(huì)產(chǎn)生H2S，H2S與培養(yǎng)基中的Fe離子在菌落中心形成黑色物質(zhì)FeS, 從而影響生化反應(yīng)的鑒定結(jié)果，因此需要將可疑菌株轉(zhuǎn)接到血平板培養(yǎng)后再進(jìn)行鑒定。在沙門(mén)菌屬的水平上的鑒定，與Vitek 2相比，MALDI-TOF MS可以更快獲得鑒定結(jié)果，消耗的成本費(fèi)用更低，并且對(duì)于常用的選擇性培養(yǎng)基，如HE平板、SS平板和麥康凱平板，其檢測(cè)結(jié)果不會(huì)受到影響。

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Rapid identification onSalmonellaisolated from clinical specimens by matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry

LIANG Da-wei, LIANG Quan-hui, FANG Yan-ping, JIANG Chang-hong,LONG Jun, ZENG Nian-yi,LIN Li-juan, JIANG Ling-xiao

(ZhujiangHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510000,China)

In this study, we aimed to evaluate the clinical application values of matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) forSalmonellaidentification and investigate its influencing factors. AllSalmonellaisolates were serotyped by traditional serological method.Salmonellaisolates were cultured for 24, 72, 120 and 168 h in Columbia blood agar, Hektoen Enteric (HE) agar, Salmonella Shigella (SS) agar and MacConkey (MAC) agar respectively. And then the strains were identified by MALDI-TOF MS. Thirty-eight serotypes were identified among 179Salmonellastrains and the top three serotypes wereSalmonellaenteritidis (21.2%),Salmonellastanley (17.3%) andSalmonellaⅠ4,5,12:i:-(16.2%). All isolates cultured in blood agar, HE agar, SS agar and MAC agar for 24 h and 72 h could be correctly identified by MALDI-TOF MS. The consuming cost of MALDI-TOF MS was about one third of microbial automatic biochemical identification system (Vitek 2) and its detection time was one seventh of Vitek 2.Salmonellacultured in Columbia blood agar, Hektoen Enteric agar,SalmonellaShigellaagar and MacConkey agar within three days could be correctly identified by MALDI-TOF MS. Compared with Vitek 2, MALDI-TOF MS provided a faster and lower-cost method that could also directly identifySalmonellaisolates cultured in selective medium.

Salmonella; matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry; identification

Jiang Ling-xiao, Email: jiang-lingxiao@163.com

江凌曉，Email：jiang-lingxiao@163.com

南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，廣州510000

R446.5

A

1002-2694(2016)07-0600-04

2015-12-07；

2016-04-25

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.002

國(guó)家科技重大專項(xiàng)課題資助項(xiàng)目(No.2012ZX10004-213)