陳加敏 朱承慧

(安徽省合肥市第一中學 230601)

絕大多數(shù)酶是具有一定空間結構的蛋白質，因蛋白質空間結構易受到pH等環(huán)境的影響，因此酶具有易變性的特點。若在不同pH條件下測定酶的反應速度，然后將測得的反應速度相對于pH作圖，一般會得到“鐘罩形”曲線。在特定pH下，酶促反應速度達到最大值，此值稱為酶促反應的最適pH。但對于“鐘罩形”的pH范圍內(nèi)，偏離最適pH導致酶活性下降的機理存在爭議。因此，實驗探究設想如下：根據(jù)酶失活后不能恢復活性的特點，偏離最適pH，若導致酶活性下降的原因是反應液中所有酶分子的整體活性下降；那么將不同pH處理的酶溶液，再放入最適pH條件下進行酶促反應，酶的活性將會100%的恢復；若酶的活性不能完全恢復，則應是部分酶失活所致。

1 材料方法

1.1 實驗試劑 各種稀釋倍數(shù)的唾液淀粉酶棉花過濾液、2%淀粉(含0.3% NaCl)溶液、0.2 mol/L Na2HPO4溶液、0.1 mol/L檸檬酸溶液、0.05% HCl溶液和0.05% NaOH溶液、KI-I2溶液(棕黃色)、斐林試劑(藍色)、蒸餾水等。

不同pH磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液及其回調至pH 6.2的試劑用量見表1，如10mL pH 4的緩沖液配制方法為3.85mL 0.2mol/L Na2HPO4溶液和6.15mL 0.1mol/L檸檬酸溶液混合而成。若將pH 4的緩沖液再調至pH 6.2，可在pH 4的緩沖液中加入9.37mL 0.2mol/L Na2HPO4溶液和0.63mL 0.1mol/L檸檬酸溶液混合液。

表1 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制及回調

1.2 實驗用具 量筒、燒杯、玻璃棒、試管及試管架、移液槍、滴管、水浴鍋、點滴板、電磁爐、pH計等。

1.3 檢測方法 KI-I2溶液鑒定方法：用滴管吸取反應液和KI-I2溶液各1滴至點滴板上，觀察顏色的變化；斐林試劑鑒定方法：取適量斐林試劑1mL加入含有反應液的試管中，60℃水浴5min。

2 實驗結果

2.1 唾液淀粉酶最適pH和適宜酶濃度的探究 由于酶含量會影響pH對酶活性影響的判斷，如高濃度的酶溶液，即使少量酶失活或活性下降也可能充分將底物反應完畢。因此，若要探究酶活性下降的可逆性機理，適合的酶濃度的探究至關重要。首先，將唾液淀粉酶分別稀釋10、25、50、75、100、125、150和200倍，探究不同pH緩沖液(表1)對唾液淀粉酶各種稀釋倍數(shù)的影響。1mL唾液淀粉酶稀釋液+1mL不同pH緩沖液+1mL 2%淀粉溶液混合，37℃水浴反應5min后，斐林試劑鑒定結果表明：pH 6.2為唾液淀粉酶的最適pH(圖1曲線Ⅰ)50倍以上的唾液淀粉酶稀釋液，根據(jù)反應顏色，斐林試劑鑒定可以明顯區(qū)分不同pH對淀粉酶活性的影響(圖1曲線Ⅱ)。

圖1 pH對唾液淀粉酶活性的影響及唾液淀粉酶活性鑒定

2.2 pH影響酶活性下降或失活的可逆性探究 唾液淀粉酶不同的稀釋倍數(shù)實驗表明，100倍的唾液淀粉酶稀釋液在不同的pH緩沖液中，與2%淀粉溶液反應5min經(jīng)斐林試劑反應呈不同的顏色。因此，采用100倍的唾液淀粉酶稀釋液鑒定pH對酶活性的影響，可以很好地反映出酶活性的變化。另外，將不同pH處理的酶溶液再調至最適pH后，可以很好地反映是酶活性的整體變化還是部分酶失活導致酶活性的下降。

2.2.1 緩沖液調節(jié)pH對酶活性的影響 37℃水浴條件下，不同pH緩沖液處理100倍唾液淀粉酶5min后，加入1mL 2%淀粉溶液反應5min后用斐林試劑和KI-I2溶液鑒定結果見表2。鑒定結果表明，斐林試劑可以明顯鑒定出各種pH緩沖液對淀粉酶活性的影響，呈現(xiàn)出從紫磚色→灰褐→褐色→灰紫→灰綠→灰藍→藍色各種不同的顏色；但KI-I2溶液鑒定淀粉殘留量區(qū)分度不夠明顯。

表2 pH 4～7.4磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液對唾液淀粉酶活性的影響

2.2.2 緩沖液調節(jié)pH影響酶活性下降的可逆性探究 37℃條件下，100倍唾液淀粉酶用不同pH緩沖液處理5min后，再用相應的磷酸氫二鈉和檸檬酸混合液將反應液回調至最適pH 6.2處理5min，加入1mL 2%淀粉溶液，反應5min后，KI-I2溶液和斐林試劑鑒定結果見表3。

鑒定結果表明，在pH 5.0～7.4范圍內(nèi)處理唾液淀粉酶后，再調至最適pH 6.2，KI-I2溶液和斐林試劑鑒定結果呈一致，說明唾液淀粉酶的活性可以100%恢復。

本實驗證明，在一定pH范圍內(nèi)，偏離最適pH酶活性的下降，是pH導致反應液中酶整體活性的下降，而并非是導致部分酶的失活。因為若是部分酶的失活導致酶反應能力的下降，那么回調至最適pH后，鑒定結果將不會與始終在最適pH條件下反應結果相同。特別引起注意的鑒定結果是，在pH 4緩沖液條件下，并不能檢測到唾液淀粉酶的活性(表2)，但將pH 4緩沖液處理的酶液回調至最適pH 6.2后，酶活性也有較大程度的恢復(表3)，值得進一步探究。

2.2.3 HCl-NaOH導致酶活性失活的可逆性探究 pH 5.0～7.4的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液處理酶后再回調至pH 6.2，酶皆可完全恢復，在完全檢測不到酶活性的pH 4的緩沖液處理酶后，再回調至pH 6.2，酶也可較大程度的恢復活性。那么過酸或過堿溶液處理酶后，酶是否也可恢復活性，用0.05% HCl和0.05%NaOH溶液處理100倍唾液淀粉酶稀釋液的相關實驗結果見表4。

表3 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液調節(jié)pH影響酶活性下降的可逆性探究

表4 0.05% HCl-NaOH導致酶活性失活及其可逆性探究(HCl和NaOH溶液濃度0.05%，pH分別為2和12)

實驗結果表明，經(jīng)0.05% HCl和0.05% NaOH溶液處理的酶液，再回調至中性pH，酶的活性也不能恢復，說明唾液淀粉酶經(jīng)過過酸過堿處理，酶發(fā)生了不可逆性的失活。由此可以推測，pH 4的緩沖液可能是酶空間結構造成徹底破壞的臨界點，此時5min的處理，部分酶可能結構遭到破壞，發(fā)生不可逆的失活，但有部分酶空間結構可能并沒完全破壞，及時回調至最適pH，酶仍可發(fā)揮活性。

3 結論分析

實驗結果表明，pH是通過影響所有酶分子的活性而影響酶促反應速度，而不是逐漸使部分酶失活而影響酶促反應速度。因此，有限程度偏離最適pH后，酶活性的下降是可逆的，即“鐘罩形”內(nèi)的pH處理酶后，再將酶促反應條件回調至最適pH，酶的活性可100%的恢復。但過酸或過堿會導致酶發(fā)生不可逆的失活。

不同比例的斐林試劑(藍色)與還原糖反應的磚紅色產(chǎn)物混合后呈現(xiàn)不同的顏色：藍色→灰綠→紫色→紫磚→磚紅，且各種顏色的深淺度不同，因此斐林試劑鑒定唾液淀粉酶活性比較理想；而不同程度的淀粉水解產(chǎn)物遇KI-I2溶液呈不同的顏色反應：藍色(淀粉)→紅褐色或紅棕色(紅色糊精)→棕黃(麥芽糖、葡萄糖)，顏色區(qū)分并不是很明顯，特別是在淀粉過量或酶不足的條件下，淀粉降解不充分，利用KI-I2溶液鑒定pH值對唾液淀粉酶活性的影響并不理想。